專利名稱：含有與色氨酸的生物合成有關(guān)的突變基因的大腸桿菌突變體和用所述突變體生產(chǎn)色氨酸 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有一個或多個與色氨酸的生物合成有關(guān)的突變基因的產(chǎn)色氨酸的大腸桿菌(E.coli)突變株CJ285(KCCM-10534)和用所述突變株生產(chǎn)色氨酸的方法。更具體地，用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(下文將其稱為NTG)進(jìn)行反復(fù)處理，而得知了源自產(chǎn)色氨酸的突變基因CJ285的多種基因的堿基序列和氨基酸序列，如用于編碼抗色氨酸異羥肟酸(下文將其稱為THX，色氨酸類似物)的DAHP合酶的同功酶的aroF和aroG，用于調(diào)節(jié)與色氨酸生物合成有關(guān)的trp、aroH、mtr、trpR和aroL操縱子的trpR，以及用于調(diào)節(jié)aroF-tyrA、aroG和aroP操縱子的tyrR蛋白。然后在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中對含有一個或多個上述基因的突變株進(jìn)行發(fā)酵，以生產(chǎn)L-色氨酸。
背景技術(shù)：
色氨酸是必需氨基酸之一，并已經(jīng)被廣泛用于各種領(lǐng)域，包括飼料添加劑，諸如安眠藥或鎮(zhèn)靜劑或林格氏溶液等醫(yī)藥物質(zhì)，以及健康食品物質(zhì)。色氨酸的典型生產(chǎn)方法是化學(xué)合成、酶反應(yīng)和用微生物進(jìn)行發(fā)酵。在化學(xué)合成的情況中，在高溫和高壓的空間中進(jìn)行生產(chǎn)，而且由于D-色氨酸和L-色氨酸一起產(chǎn)生，因此為獲得所需的色氨酸需要另外的精制過程。在酶反應(yīng)(如Matsui Doatsui的日本專利(韓國專利公開號90-005773)的情況中，用作反應(yīng)底物的吲哚和絲氨酸非常貴，而且酶本身也不安全。
另一方面，采用微生物的發(fā)酵涉及各種微生物，如大腸桿菌和棒狀桿菌(Corynebacterium)的營養(yǎng)缺陷株和調(diào)節(jié)突變株。在二十世紀(jì)80年代迅速發(fā)展的基因重組技術(shù)提供了很多有關(guān)新陳代謝及其控制機(jī)制的信息。許多研究人員通過基因操作，非常成功地開發(fā)出了優(yōu)異的重組株并提高了生產(chǎn)力(Matsui等，1988)。同時(shí)，在韓國，很多與通過使用色氨酸抗性或營養(yǎng)缺陷型突變株(韓國專利公開號87-1813、90-8251和92-7405)或重組株(韓國專利公開號90-5772和91-5627)的直接發(fā)酵有關(guān)的色氨酸生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)公開。這些色氨酸類似物抗性株主要是為了在色氨酸生物合成過程中克服酶的反饋抑制，而且重組株也用來克隆色氨酸生物合成過程中的酶。事實(shí)上，該研究已經(jīng)獲得了巨大的成功。例如，使用大腸桿菌的人工突變體的傳統(tǒng)L-色氨酸生產(chǎn)的最大特征是使用廉價(jià)的培養(yǎng)底物來生產(chǎn)L-色氨酸。然而，生產(chǎn)力或色氨酸的產(chǎn)量極低。因此，為了通過基因重組使色氨酸的產(chǎn)量最大，有必要確保作為親本菌株的人工突變體優(yōu)良以及獲得其調(diào)節(jié)已經(jīng)解除的基因。

發(fā)明內(nèi)容
因此，鑒于上述問題而創(chuàng)造了本發(fā)明，本發(fā)明的一個目的是鑒定突變基因的堿基序列和氨基酸序列，所述突變基因用于編碼aroF和aroG和用于調(diào)節(jié)與色氨酸合成有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄的trpR和tyrR，所述aroF和aroG是用于3-脫氧阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(3-deoxyarabionohep-tulosonate7-phosphate，下文將其稱為DAHP)合成的酶，所述DAHP是源自大腸桿菌突變株CJ285的色氨酸的合成過程中的芳香族氨基酸的第一個前體，該DAHP是由磷酸烯醇丙酮酸和赤蘚糖4-磷酸(Erythorse 4-phosphate)制得的。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有上述一個或多個突變基因的生產(chǎn)L-色氨酸的大腸桿菌突變株。
本發(fā)明的另一個目的是提供通過將所述突變株直接培養(yǎng)在含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中來生產(chǎn)高濃度和高產(chǎn)量的L-色氨酸的方法。


根據(jù)以下詳述內(nèi)容并結(jié)合附圖，將可以更清楚地理解本發(fā)明的上述和其它的目的、特征和其它優(yōu)點(diǎn)，其中圖1顯示了一個突變基因，其中aroF基因的內(nèi)部序列中的CCT被突變?yōu)閇TCT]，結(jié)果導(dǎo)致第280位氨基酸即脯氨酸變?yōu)榻z氨酸；
圖2顯示一個突變基因，其中aroG基因的啟動子區(qū)域中的T堿基被突變?yōu)閇C]堿基，該基因的內(nèi)部序列中的GTG被突變?yōu)閇GCG]，TGC被突變?yōu)閇CGC]，結(jié)果分別導(dǎo)致第57位氨基酸即纈氨酸變?yōu)楸彼幔偷?1位氨基酸即半胱氨酸變?yōu)榫彼?；圖3顯示一個突變基因，其中trpR基因的內(nèi)部序列中第704位的G堿基被刪掉了，結(jié)果導(dǎo)致蛋白翻譯過程中的框架發(fā)生變化，并且相對于野生型基因[cgattgattttgtaggcctgataagacgtggcgcatcaggcatcgtgcaccgaatgccggatgcggcgtga]，其增加了23個氨基酸；和圖4顯示一個突變基因，其中tyrR基因的內(nèi)部序列中的GGC被突變?yōu)閇GAC]，而CTG被突變?yōu)閇CTA]，結(jié)果導(dǎo)致第25位氨基酸即甘氨酸變?yōu)樘於彼?，并且使?6位氨基酸即亮氨酸變?yōu)闊o義突變。
具體實(shí)施例方式
技術(shù)問題根據(jù)本發(fā)明的一個方面，上述和其它的目的可以通過提供含有與色氨酸生物合成有關(guān)的突變基因的大腸桿菌突變株來實(shí)現(xiàn)，其中用NTG對大腸桿菌CJ181(KFCC 10902，產(chǎn)生色氨酸的親本菌株)進(jìn)行反復(fù)處理，以在其中引起突變，并且使突變體(CJ285)具有色氨酸類似物THX抗性，由此使突變株相對于親本菌株，其色氨酸產(chǎn)量得到顯著提高。同時(shí)，為了分析DNA堿基序列和氨基酸序列，克隆了編碼以下物質(zhì)的基因aroF和aroG，所述aroF和aroG為色氨酸生物合成過程中合成芳香族氨基酸的第一個前體DAHP的酶；用于調(diào)節(jié)與色氨酸生物合成有關(guān)的trp、aroH、mtr、trpR和aroL操縱子的trpR蛋白；以及用于調(diào)節(jié)aroF-tyrA、aroG、aroP操縱子的tyrR蛋白；并將DNA堿基序列與野生型基因的堿基序列進(jìn)行比較。通過這種方式，就可以對基因突變進(jìn)行定位。然后，將含有aroF、aroG、trpR和tyrR中的至少一個的CJ285菌株直接培養(yǎng)在含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中。相對于親本菌株，CJ285生成的色氨酸要多得多。
也就是說，通過基因重組技術(shù)，大腸桿菌CJ285菌株可以用來使色氨酸產(chǎn)率最大，并且該菌株是從未公開的新菌株。
技術(shù)方案本發(fā)明提供L-色氨酸的生產(chǎn)方法，其中該方法包括以下步驟通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增基因的引物，所述基因?yàn)榫幋a涉及3-脫氧阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)的合成的酶的基因，編碼用于調(diào)節(jié)與色氨酸生物合成有關(guān)的trp、aroH、mtr、trpR和aroL操縱子的trpR蛋白的基因，和編碼用于調(diào)節(jié)aroF-tyrA、aroG和aroP操縱子的tyrR蛋白的基因，通過pCR2.1-TOPO載體克隆所述基因以尋找與預(yù)期大小的條帶反應(yīng)的質(zhì)?？寺。焕煤猩鲜?個基因的質(zhì)?？寺∽鳛槟０?，根據(jù)雙向堿基序列分析，測定aroF、aroG、trpR和tyrR基因的堿基序列，由所述堿基序列確定氨基酸序列，并將所述基因的堿基序列與野生型基因的堿基序列進(jìn)行比較以對突變進(jìn)行定位；和將含有一個或多個突變基因aroF、aroG、trpR和tyrR的大腸桿菌突變株CJ285在含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，由此生產(chǎn)L-色氨酸。
本發(fā)明中所用的基因操作遵照分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(MolecularCloning Laboratory Manual，T.Maniatis E.F.，F(xiàn)litch，J.Sambrook)。
在含有0.3g/l的THX(色氨酸類似物)的基本培養(yǎng)基的平板中將產(chǎn)生色氨酸的親本菌株大腸桿菌CJ181(KFCC 10902)恒溫培養(yǎng)5天。為了提高生長速度并解除CJ181對THX的敏感性，向培養(yǎng)基中加入500μg/ml的致突變物NTG。首先，選擇在含有0.3g/l THX的基本培養(yǎng)基中生長的任何菌株，并將這些經(jīng)選擇的菌株再次培養(yǎng)在含有0.5g/l THX的基本培養(yǎng)基中。最后，選擇到了對THX具有高度抗性的菌株，并將其命名為CJ285。基本培養(yǎng)基的成分如下表1所示，分別往培養(yǎng)基中添加100mg/l的輔源氨基酸。
表1 大腸桿菌基本培養(yǎng)基(M9培養(yǎng)基)的組成

在37℃將本發(fā)明的突變株CJ285在LB培養(yǎng)基中搖動培養(yǎng)12小時(shí)。LB培養(yǎng)基(pH＝7.4)含有1％的細(xì)菌用胰蛋白胨(Bacto-Trypton)、0.5％的細(xì)菌用酵母提取物和1％的NaCl。從培養(yǎng)基收集地衣共生菌(mycobiont)，并利用Quiagen染色體DNA分離試劑盒獲得染色體DNA。將如此獲得的染色體DNA浸在乙醇中并干燥純化。以所述經(jīng)純化染色體DNA為模板進(jìn)行PCR。使用Quiagen凝膠提取試劑盒，從1％瓊脂糖凝膠中分離到分別約為1.3kb、2kb、530bp和1.9kb的aroF、aroG、trpR和tyrR突變基因，并純化所述基因片段以用作克隆的遺傳資源。利用TOPO克隆試劑盒(由Invitrogen公司生產(chǎn))，將源自于CJ285菌株的這些突變基因片段克隆到pCR2.1-TOTO載體中，結(jié)果鑒定到含有所述基因的克隆。
為了測定編碼aroF、aroG、trpR和tyrR蛋白的基因的堿基序列和氨基酸序列，分離和純化包含突變基因的質(zhì)粒，并測定包括啟動子后的序列、遺傳密碼區(qū)，蛋白合成終止密碼子在內(nèi)的整個基因序列。為了測定本發(fā)明的基因的DNA堿基序列，將先前分離純化的質(zhì)粒DNA與測序引物和聚合酶混合，并通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。將經(jīng)如此擴(kuò)增的質(zhì)粒DNA浸在乙醇中進(jìn)行純化并與Hi-Di溶液混合。結(jié)果，質(zhì)粒DNA被轉(zhuǎn)換成含有單鏈的雙鏈DNA(dsDNA)，并用堿基序列測序儀ABI 3100(由Applied Biosystem制造)進(jìn)行DNA堿基序列分析。根據(jù)美國NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)網(wǎng)站中的BLAST(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)檢索程序和ExPasy網(wǎng)站中的Tools PROGRAM(http//us.expasy.org/tools/dna.html)進(jìn)行DNA堿基序列分析。然后將經(jīng)如此測定的基因堿基序列與野生型基因的堿基序列進(jìn)行比較，以檢查是否發(fā)生任何突變，并通過翻譯來鑒定突變氨基酸。
將包含突變基因aroF、aroG、trpR和tyrR中的至少一個的CJ285突變株在含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中直接發(fā)酵，以生產(chǎn)L-色氨酸。更具體地，在有氧條件(以200rpm～300rpm搖動瓶子或以400rpm～1000rpm搖動發(fā)酵罐，并且氣流量＝0.5vvm～1.5vvm)下培養(yǎng)所述突變株，發(fā)酵溫度＝30℃，pH＝6.0～8.0，所生成的L-色氨酸積累在培養(yǎng)基中。在使用瓶子的情況中，在30℃和220rpm將突變株培養(yǎng)48小時(shí)～60小時(shí)，所生成的L-色氨酸積累在培養(yǎng)基中。在使用發(fā)酵罐的情況中，采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)法。于是，另外多次補(bǔ)充葡萄糖來生產(chǎn)L-色氨酸。發(fā)酵培養(yǎng)基各成分列于下表2中。
表2 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成

為了了解培養(yǎng)基的地衣共生菌的生長速度，測定了600nm的吸光度。而且，還根據(jù)Bertrand法進(jìn)行糖分析。同時(shí)，利用HPLC(高效液相色譜)分析了L-色氨酸的量。
雖然為說明目的而公開了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，各種修改、增加和替換都是可能的，其并未脫離如附加的權(quán)利要求書所公開的本發(fā)明的范圍和精神。
有益效果根據(jù)本發(fā)明，通過用NTG反復(fù)處理大腸桿菌CJ181，開發(fā)了新的大腸桿菌突變株CJ285(KCCM-10534)，并且該突變株具有色氨酸異羥肟酸(色氨酸類似物)抗性。通過分析與色氨酸生物合成有關(guān)的突變基因aroF、aroG、trpR和tyrR的DNA堿基序列和氨基酸，可鑒定重要的突變，并且可獲得在重組菌株開發(fā)中使用的適當(dāng)?shù)耐蛔兓?。此外，相對于親本菌株CJ181，它的包含至少一個突變基因的突變株CJ285能夠產(chǎn)生更多的色氨酸(約多10％)。因此，本發(fā)明的CJ285非常有利于用作重組菌株開發(fā)和氨基酸發(fā)酵業(yè)和藥物制造的適當(dāng)親本菌株。
實(shí)施例實(shí)施例1 THX抗性突變株CJ285的選擇在37℃將產(chǎn)生色氨酸的親本菌株大腸桿菌CJ181(KFCC 10902)在LB培養(yǎng)基中搖動培養(yǎng)12小時(shí)，并用經(jīng)消毒的鹽水溶液沖洗兩次。此處的LB培養(yǎng)基(pH＝7.4)含有1％的細(xì)菌用胰蛋白胨、0.5％的細(xì)菌用酵母提取物和1％的NaCl。將CJ181稀釋在0.1M的檸檬酸鈉緩沖液(pH＝5.5)中直到最終OD＝1.0。將CJ181在含有0.3g/l的THX的基本培養(yǎng)基(請參照表1)中培養(yǎng)5天。為了提高生長速度并獲得對THX具有抗性的CJ181，將500μg/ml的NTG(致突變物)加到培養(yǎng)基中。將該溶液放在37℃恒溫浴中反應(yīng)30分鐘，并在0.1M磷酸鹽緩沖液(pH＝7.0)中漂洗3次。然后將CJ181在含有0.5g/l的THX的基本培養(yǎng)基(請參照表1)中培養(yǎng)5天，結(jié)果獲得約100個菌落。在瓶子中對如此獲得的突變株和原來的親本菌株進(jìn)行色氨酸發(fā)酵試驗(yàn)。結(jié)果可選擇到相對于原來的大腸桿菌親本菌株CJ181具有更優(yōu)異的色氨酸生產(chǎn)性能特征的大腸桿菌CJ285。從該菌株中分離產(chǎn)生L-色氨酸的最好菌株，并將其放在三角瓶中。在三角瓶中對該菌株進(jìn)行色氨酸生產(chǎn)試驗(yàn)之后，如以下實(shí)施例6中所述，在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
表3 新開發(fā)的人工突變株在瓶中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表3所見到的，由大腸桿菌突變株CJ285生產(chǎn)的L-色氨酸比原來的親本菌株大腸桿菌KFCC 10902的高。在2003年11月28日將CJ285保藏在KCCM(韓國微生物保藏中心，Korean Culture Center of Microorganisms)，編號為KCCM-10534。
實(shí)施例2 突變株CJ285的aroF基因的克隆和序列分析為了利用從CJ285中分離的染色體DNA作為模板通過PCR擴(kuò)增aroF基因，使用了下列的引物(21mer)。用5′-GTATTTACCCCGTTATTGTC-3′作為正義引物，并用5′-CACTTCAGCAACCAGTTCCAG-3′作為反義引物。為進(jìn)行PCR，將約30ng的CJ285的基因組DNA和各為25pmol的引物加到含有DNA聚合酶、dNTPs和反應(yīng)緩沖液的Accupower PCR HL-Premix中，直至最終濃度變?yōu)?0μl。PCR程序運(yùn)行25次。開始在94℃進(jìn)行5分鐘，然后在94℃進(jìn)行35秒，55℃進(jìn)行40秒和72℃進(jìn)行90秒。最后，在72℃進(jìn)行最后延伸7分鐘。然后通過1％瓊脂糖凝膠電泳對其結(jié)果進(jìn)行檢測。
為了將基因片段克隆到pCR2.1-TOPO載體中，利用Quiagen凝膠提取試劑盒從1％的瓊脂糖凝膠中分離約1.3kb(其對應(yīng)于aroF突變基因的大小)的基因片段。然后純化如此獲得的基因片段，并將其用作克隆的遺傳資源。使用TOPO克隆試劑盒(由Invitrogen公司生產(chǎn))，將從CJ285菌株獲得的突變基因片段與pCR2.1-TOPO載體溶液按1∶4的比率進(jìn)行混合。然后，往該混合物中加入1μl的鹽水溶液，并在室溫持續(xù)反應(yīng)20分鐘。將反應(yīng)溶液和40μl的包含在所述試劑盒中的TOP10感受態(tài)細(xì)胞混合并在冰上放置20分鐘。然后在42℃熱激30秒，并立即將該溶液放回冰上，放置2分鐘。向其中加入250μl的SOC培養(yǎng)基，并將該突變基因于37℃培養(yǎng)1小時(shí)。將100μl培養(yǎng)物培養(yǎng)基涂在含有50μg/ml的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，并在其中于37℃將該突變基因培養(yǎng)約12小時(shí)。只選擇白色菌落并再次在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)約12小時(shí)。從中提取質(zhì)粒，并用EcoRI限制酶處理2小時(shí)，然后用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行顯影。利用紫外照射儀，鑒定到了含有突變基因的克隆。
為了測定該基因的DNA堿基序列，從先前鑒定的克隆中分離質(zhì)粒并純化。將經(jīng)如此分離純化的質(zhì)粒和2pmol能夠通過互補(bǔ)氫鍵與aroF基因結(jié)合的序列分析引物、2μl含有聚合酶的Big dye和1μl質(zhì)粒DNA(約200ng)混合。然后，將PCR運(yùn)行25次，首先在96℃進(jìn)行30秒，50℃進(jìn)行15秒和60℃進(jìn)行4分鐘。將質(zhì)粒DNA浸在乙醇中純化，并與10μl的Hi-Di溶液混合。結(jié)果，質(zhì)粒DNA被轉(zhuǎn)換成含有單鏈的雙鏈DNA，并用堿基序列測序儀ABI3100(由Applied Biosystem制造)進(jìn)行DNA堿基序列分析。根據(jù)美國NCBI(National Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站中的BLAST(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)檢索程序和ExPasy網(wǎng)站中的ToolsPROGRAM(http//us.expasy.org/tools/dna.html)進(jìn)行DNA堿基序列分析。然后將經(jīng)如此測定的基因堿基序列與野生型基因的堿基序列進(jìn)行比較以檢查是否發(fā)生任何突變，并通過翻譯來鑒定突變氨基酸。
實(shí)施例3 突變株CJ285的aroG基因的克隆和序列分析為了利用從CJ285中分離的染色體DNA作為模板通過PCR擴(kuò)增aroG基因，使用了下列的引物(21mer)。用5’-GTATTTACCCCGTTATTGTC-3’作為正義引物，并用5’-ACTCCGCCGGAAGTGACTAA-3’作為反義引物。為進(jìn)行PCR，將約30ng的CJ285的基因組DNA和各為25pmol的引物加到含有DNA聚合酶、dNTPs和反應(yīng)緩沖液的Accupower PCR HL-Premix中，直至最終濃度變?yōu)?0μl。PCR程序運(yùn)行25次。開始在94℃進(jìn)行5分鐘，然后在94℃進(jìn)行35秒，55℃進(jìn)行40秒和72℃進(jìn)行2分鐘20秒。最后，在72℃進(jìn)行最后延伸7分鐘。然后通過1％瓊脂糖凝膠電泳對其結(jié)果進(jìn)行檢測。
為了將基因片段克隆到pCR2.1-TOPO載體中，利用Quiagen凝膠提取試劑盒分離到約2kb(其對應(yīng)于aroG突變基因的大小)的基因片段。然后純化如此獲得的基因片段，并將其用作克隆的遺傳資源。此后的實(shí)驗(yàn)程序和堿基序列測定后的堿基序列分析與實(shí)施例2中的相同。
實(shí)施例4突變株CJ285的trpR基因的克隆和序列分析為了利用從CJ285中分離的染色體DNA作為模板通過PCR擴(kuò)增trpR基因，使用了下列的引物(21mer)。用5’-CGCCACGGAATGGGGACGTCG-3’作為正義引物，并用5’-CCGCGTCTTATCATGCCTACC-3’作為反義引物。為進(jìn)行PCR，將約30ng的CJ285的基因組DNA和各為25pmol的引物加到含有DNA聚合酶、dNTPs和反應(yīng)緩沖液的Accupower PCR HL-Premix中，直至最終濃度變?yōu)?0μl。PCR程序運(yùn)行25次。開始在94℃進(jìn)行5分鐘，然后在94℃進(jìn)行1分鐘，60℃進(jìn)行30秒和72℃進(jìn)行1分鐘。最后，在72℃進(jìn)行最后延伸7分鐘。然后通過1％瓊脂糖凝膠電泳對其結(jié)果進(jìn)行檢測。
為了將基因片段克隆到pCR2.1-TOPO載體中，利用Quiagen凝膠提取試劑盒分離到約530bp(其對應(yīng)于trpR突變基因的大小)的基因片段。然后純化如此獲得的基因片段，并將其用作克隆的遺傳資源。此后的實(shí)驗(yàn)程序和堿基序列測定后的堿基序列分析與實(shí)施例2中的相同。
實(shí)施例5 突變株CJ285的tyrR基因的克隆和序列分析為了利用從CJ285中分離的染色體DNA作為模板通過PCR擴(kuò)增tyrR基因，使用了下列的引物(21mer)。用5’-GGATTGACGATGACAAACCT-3’作為正義引物，并用5’-CTGGTGGATGAAATCACCAC-3’作為反義引物。為進(jìn)行PCR，將約30ng的CJ285的基因組DNA和各為25pmol的引物加到含有DNA聚合酶、dNTPs和反應(yīng)緩沖液的Accupower PCR HL-Premix中，直至最終濃度變?yōu)?0μl。PCR程序運(yùn)行25次。開始在94℃進(jìn)行5分鐘，然后在94℃進(jìn)行1分鐘，53℃進(jìn)行30秒和72℃進(jìn)行2分鐘20秒。最后，在72℃進(jìn)行最后延伸7分鐘。然后通過1％瓊脂糖凝膠電泳對其結(jié)果進(jìn)行檢測。
為了將基因片段克隆到pCR2.1-TOPO載體中，利用Quiagen凝膠提取試劑盒分離到約1.9kb(其對應(yīng)于tyrR突變基因的大小)的基因片段。然后純化如此獲得的基因片段，并將其用作克隆的遺傳資源。此后的實(shí)驗(yàn)程序和堿基序列測定后的堿基序列分析與實(shí)施例2中的相同。
實(shí)施例6 在5L發(fā)酵罐中對突變株CJ285所進(jìn)行的發(fā)酵將包含具有如實(shí)施例2～5所公開的堿基序列的突變基因中的至少一個的大腸桿菌CJ285和親本菌株CJ181(KFCC 10902)補(bǔ)料分批培養(yǎng)在5L發(fā)酵罐(發(fā)酵溫度＝30℃，培養(yǎng)物pH＝6.9～7.1(pH可以由氨水控制)，空氣流量＝0.5vvm～1.0vvm，且攪拌速度＝500rpm～700rpm)中。結(jié)果，CJ285的發(fā)酵濃度為28.2g/l，親本菌株CJ181的發(fā)酵濃度為25.1g/l。因此，大腸桿菌CJ285的發(fā)酵時(shí)間稍微減少，從而L-色氨酸生產(chǎn)率每小時(shí)提高約10％。
表4 5L發(fā)酵罐中CJ285突變株的發(fā)酵


有關(guān)保藏的微生物或其他生物材料的說明(PCT Rule 13bis)



表PCT/RO134(1998年7月)
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生L-色氨酸的大腸桿菌突變株，該突變株含有由與色氨酸生物合成有關(guān)的aroF、aroG、trpR和tyrR組成的突變基因中的至少一個。
2.如權(quán)利要求1所述的突變株，其中所述大腸桿菌突變株為大腸桿菌CJ285KCCM-10534。
3.L-色氨酸的生產(chǎn)方法，該方法使用權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的大腸桿菌突變株。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生色氨酸的大腸桿菌突變株CJ285(KCCM－10534)，該突變株含有與色氨酸的生物合成有關(guān)的一個或多個突變基因，和涉及用所述突變株產(chǎn)生色氨酸的方法。更具體地，本發(fā)明公開了源自于產(chǎn)生色氨酸的大腸桿菌突變株CJ285(KCCM－10534)并與色氨酸生物合成有關(guān)的aroF、aroG、trpR和tyrR的DNA堿基序列和氨基酸序列，并將含有至少一個所述突變基因的大腸桿菌CJ285直接培養(yǎng)在含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，由此可在培養(yǎng)基中積累L－色氨酸。
文檔編號C07K14/245GK1926232SQ200480037362
公開日2007年3月7日 申請日期2004年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月15日
發(fā)明者樸英薰, 林相曹, 金炳勳, 金星俊, 林鎬洙 申請人:Cj株式會社