專利名稱：一種嵌合基因的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及基因工程中一種嵌合基因的構(gòu)建方法，其氨基酸序列連接的方向有一部分和傳統(tǒng)的方向相反，有更多的自由氨基端，類似生物體內(nèi)天然存在的狀況，促進(jìn)構(gòu)建全新的分子的研究。
利用現(xiàn)有的方法只能將受體的亞單位通過(guò)鏈接區(qū)將第1部分的羧基端和第2部分的氨基端相連，而在人體內(nèi)受體的亞單位的氨基端是自由結(jié)合的，沒(méi)有任何的限制。同樣利用現(xiàn)有的方法構(gòu)建重組抗體的過(guò)程中，只能將一種蛋白的某一段基因片段，稱為第一鏈的羧基端通過(guò)鏈接區(qū)與同種或另一種蛋白的某一段基因片段，稱為第二鏈的氨基端相連，而使形成的人工分子的氨基端區(qū)域受到限制；而利用現(xiàn)有的方法構(gòu)建的核苷酸序列如圖2所示即第一鏈的氨基端→羧基端→鏈接區(qū)→第二鏈的氨基端→羧基端，其氨基端是自由的，沒(méi)有任何的限制。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的采取的方案1、一種嵌合基因的構(gòu)建方法，在氨基酸序列合成時(shí)第一(或第二)鏈的方向?yàn)榘被说紧然送ㄟ^(guò)鏈接區(qū)鏈接第二(或第一)鏈，其特征是所述的第一鏈和第二鏈在合成時(shí)都以羧基端和鏈接區(qū)相連，所述的第二(或第一)鏈方向?yàn)轸然说桨被?；形成一條完整的DNA鏈的嵌合基因序列的方向?yàn)榈谝?或第二)鏈的氨基端—羧基端—鏈接區(qū)一第二(或第一)鏈的羧基端—氨基端這樣的序列。
2、所述的第一鏈和第二鏈構(gòu)建成嵌合基因的基因片段，是同種蛋白基因的全部基因或部分基因或是來(lái)自不同蛋白的基因片段，是來(lái)自生物體內(nèi)或是人工合成的基因片段；是確切的核苷酸序列，或是隨機(jī)的核苷酸序列。
3、所述的鏈接區(qū)由0-2000個(gè)氨基酸構(gòu)成，其最佳長(zhǎng)度為1-40個(gè)氨基酸序列，一般為苷氨酸和絲氨酸組成的鏈接序列。
4、所述的第二鏈的氨基端加入一個(gè)琥珀終止密碼子UAG，以使嵌合基因表達(dá)產(chǎn)物純化。
5、所述的琥珀終止密碼子UAG的后面通過(guò)鏈接區(qū)連接噬菌體的基因片段，使其與外源性基因片段融合，并表達(dá)于噬菌體的表面，利于蛋白之間互相作用的深入研究。
6、一種嵌合基因的構(gòu)建方法的應(yīng)用，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)、拼接、測(cè)序和人工合成常見(jiàn)的分子生物學(xué)方法，證明用本發(fā)明的嵌合基因的構(gòu)建方法所構(gòu)成的嵌合基因，其特征是和生物體內(nèi)天然存在的狀況類似，有更多的自由氨基端，有利于其與受體和配基的自由結(jié)合，使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸，有利于細(xì)胞蛋白的合成，促進(jìn)構(gòu)建全新的分子的研究。
通過(guò)對(duì)基因的人工合成，不僅可以根據(jù)所用細(xì)胞的兼并密碼子的使用頻率來(lái)調(diào)整基因的序列，以提高蛋白的翻譯水平，同時(shí)也可以根據(jù)氨基酸的序列，利用分子生物學(xué)的手段，來(lái)構(gòu)建編碼蛋白分子的基因。傳統(tǒng)的人工合成蛋白的基因片段具有方向性，即在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)，合成的方向只能從氨基的5’端到羧基的3’端，遵循這一原則，方能得到具有活性的產(chǎn)物。
本發(fā)明所述的一種嵌合基因的構(gòu)建方法，第一鏈和第二鏈都以羧基端和鏈接區(qū)相連，第二鏈的編碼羧基端氨基酸的密碼子位于傳統(tǒng)人工合成基因的5’端，而編碼氨基端氨基酸的密碼子位于傳統(tǒng)人工合成基因的3’端，使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸，利用細(xì)胞的蛋白合成機(jī)制來(lái)合成全新的分子，因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)有更多的自由氨基端，使其與受體或配基結(jié)合時(shí)，充分自由結(jié)合，便于構(gòu)建二聚體或多聚體，篩選到在體內(nèi)具有高度活性的藥物的深入研究。在本發(fā)明的嵌合基因構(gòu)建的方法中，所述的鏈接區(qū)可以是任何氨基酸序列，由0-2000個(gè)氨基酸構(gòu)成，其最佳長(zhǎng)度為1-40個(gè)氨基酸序列；所述的第二鏈的氨基端加入一個(gè)琥珀終止密碼子UAG，以利于嵌合基因表達(dá)產(chǎn)物的純化。
絲狀噬菌體是一種細(xì)菌的病毒，它可以借助細(xì)菌的DNA和蛋白質(zhì)合成機(jī)制，來(lái)完成自身的復(fù)制，并且不引起細(xì)菌的死亡。最常見(jiàn)和常用的絲狀噬菌體為M13，fd等，其外形呈棒狀。M13的基因組為一條單鏈DNA，其為10個(gè)基因編碼。這10個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)，組成了包被單鏈DNA的外衣。整個(gè)噬菌體的分子量為1.63×107Da，其中88％為蛋白質(zhì)，12％為DNA。整個(gè)包衣有大約2700份的主要包衣蛋白pVIII。在噬菌體的一端，有各為5個(gè)拷貝的基因VII和VI編碼的蛋白，參與和細(xì)菌的結(jié)合以及結(jié)束噬菌體的裝配過(guò)程。噬菌體的另一端為各為5個(gè)拷貝的基因VII和IX編碼的分別為33個(gè)和32個(gè)氨基酸的蛋白，參與噬菌體裝配的起始和噬菌體穩(wěn)定性的維持。目前已經(jīng)報(bào)道了分別用基因III，VI，VII，VIII和IX來(lái)顯示抗體于噬菌體表面的報(bào)道。利用噬菌體的基因III，VI，VII， VIII或IX基因與外源性基因片段融合，可以使外源性基因編碼的蛋白產(chǎn)物顯示在噬菌體的表面，這樣達(dá)到了基因型與表現(xiàn)型的統(tǒng)一。特別是利用體內(nèi)外的篩選技術(shù)所獲得的與受體或配基結(jié)合的噬菌體，直接可以從中分離出編碼的基因片段，用于更進(jìn)一步的研究。
重組噬菌體抗體系統(tǒng)利用了M13噬菌體獨(dú)特的生活周期，特別是在噬菌體表面表達(dá)的幾個(gè)噬菌體蛋白的獨(dú)特特性。絲狀噬菌體M13長(zhǎng)度約為895nm，直徑為9nm。其為單鏈DNA，共有6407個(gè)堿基，為10個(gè)蛋白質(zhì)編碼。與其它的大多數(shù)細(xì)菌噬菌體不同的是，M13并不產(chǎn)生溶菌性的感染，而是在保持宿主存活的狀態(tài)下，利用宿主的基因復(fù)制和蛋白合成機(jī)制來(lái)復(fù)制產(chǎn)生大量的噬菌體。在感染宿主的過(guò)程中蛋白III起著至關(guān)重要的作用，因?yàn)橥ㄟ^(guò)蛋白III與宿主細(xì)菌菌毛的結(jié)合，而使得噬菌體可以進(jìn)入大腸桿菌體內(nèi)。利用分子生物學(xué)方法，將抗體的相關(guān)基因片段通過(guò)與蛋白III或蛋白VIII等的融合，利用噬菌體的基因與外源性基因片段融合，使外源性基因編碼的蛋白產(chǎn)物，表達(dá)于噬菌體的表面，而達(dá)到基因與功能的偶聯(lián)，為研究蛋白之間的相互作用，開(kāi)辟了一條新的途徑。
除了噬菌體以外，還有許多動(dòng)物和人類的病毒、細(xì)菌、酵母和細(xì)胞被用來(lái)在其表面顯示外源性的蛋白質(zhì)。如葡萄球菌的蛋白A，脊髓灰質(zhì)炎病毒，酵母的α因子等，用來(lái)與外源性的蛋白質(zhì)組成融合蛋白，使外源性的蛋白質(zhì)表達(dá)在其表面，同樣可以通過(guò)篩選技術(shù)，達(dá)到基因型和表現(xiàn)型的統(tǒng)一。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用本發(fā)明的嵌合基因的構(gòu)建方法所構(gòu)建的嵌合基因的表達(dá)產(chǎn)物，使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸，有更多的自由氨基端，有利于其與受體或配基的自由結(jié)合，和生物體內(nèi)天然存在的結(jié)構(gòu)相似，不受傳統(tǒng)氨基酸序列方向的限制，有利于細(xì)胞蛋白的合成，促進(jìn)構(gòu)建全新的分子的研究。
箭頭為體內(nèi)蛋白質(zhì)合成的方向；1、2、橢圓為嵌合基因的第一鏈與第二鏈；3、基因片段的羧基端；4、7、線條為鏈接區(qū)；5、基因片段的氨基端；6、矩形為琥珀終止密碼子；8、三角形為噬菌體的pIII(VI，VII，VIII或IX)基因所編碼的蛋白片段。


圖1表示體內(nèi)嵌合基因構(gòu)建方向?yàn)榈谝绘湹陌被恕然恕溄訁^(qū)→第二鏈的羧基端→氨基端→琥珀終止密碼子→鏈接區(qū)→噬菌體的pIII(VI，VII，VIII或IX)基因所編碼的蛋白片段。
圖2表示傳統(tǒng)人工方法基因的構(gòu)建方向?yàn)榈谝绘湹陌被恕然恕溄訁^(qū)→第二鏈的氨基端→羧基端→琥珀終止密碼子→鏈接區(qū)→噬菌體的pIII(VI，VII，VIII或IX)基因所編碼的蛋白片段。
2)用等量的磷酸緩沖液稀釋外周血。
3)為了分離血中的淋巴細(xì)胞，首先在各試管中加入3毫升淋巴細(xì)胞分離液(上海生化試劑廠)，然后在每個(gè)試管中從管壁輕輕加入5毫升稀釋后的血液。
4)置低速離心機(jī)，2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘。
5)此時(shí)可見(jiàn)試管中不同組分的條帶，從上至下分別為血漿層(黃色)，淋巴細(xì)胞層(白色)，分離液(無(wú)色)和紅細(xì)胞層(紅色)，用毛細(xì)吸管輕輕吸取淋巴細(xì)胞層，置于另一10至15毫升的離心管中。
6)用磷酸緩沖液作等量稀釋，1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。
7)小心棄上清，照步驟6用磷酸緩沖液洗兩遍。
8)用磷酸緩沖液按每10毫升血液懸1毫升的比例重選沉淀。1.4.2總細(xì)胞RNA的提取1)將1毫升變性的溶液D(4摩爾的異硫氫酸胍，25毫摩爾的二水檸檬酸鈉，0.5％月桂?；“彼徕c(重量/體積)，0.1摩爾的二巰基乙醇，加入沉淀的細(xì)胞中(約107細(xì)胞)，懸起沉淀，使細(xì)胞碎片裂解。
2)加入0.1毫升2摩爾pH4.0的醋酸鈉，混勻，分成兩小管。
3)每管中加入0.5毫升水飽和酚，充分混勻。
4)每管加入1毫升氯仿—異戊醇溶液，混勻約10秒鐘。置冰浴15分鐘，如果未形成兩層，另加入0.5毫升氯仿—異戊醇溶液。
5)置攝氏4度12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘。
6)上層水相轉(zhuǎn)移至一新鮮離心管中，加等量異丙醇，置負(fù)攝氏20度沉淀1小時(shí)；棄上清，用75％的乙醇洗一遍。
7)室溫自然干燥沉淀的RNA，重懸于50微升無(wú)RNA酶的純水中。1.4.3 cDNA的合成1)將上述1.4.2所獲得的總RNA取44微升加入一個(gè)無(wú)RNA酶的離心管中。加入4微升(0.5微克/微升)的人工合成的下游引物，分成兩個(gè)離心管。下游引物的序列為5’AGA ACC ACCACC ACC ACC TTG AGA CAT TTG TGG CAA GGT3’(其中黑體為鏈接區(qū)序列)。
2)每管置入攝氏70度水浴中10分鐘。然后置冰浴中3分鐘。
3)制備以下混合液10X PCR緩沖液 8微升15毫摩爾/升的氯化鎂 8微升10毫摩爾/升的dNTP 4微升100毫摩爾/升的二巰基蘇硫醇8微升4)加14微升上述混合液到每個(gè)RNA引物混合管中，輕輕混合，短暫離心。置室溫5分鐘。
5)每管加入2微升(200單位)反轉(zhuǎn)錄酶Superscript II RT，置攝氏42度60分鐘。
6)置攝氏70度15分鐘終止反應(yīng)，置冰浴中。
7)瞬時(shí)離心，加2微升RNAase H于每個(gè)反應(yīng)管，攝氏37度20分鐘。1.4.4生長(zhǎng)激素受體細(xì)胞外區(qū)域的PCR擴(kuò)增1)先合成生長(zhǎng)激素受體細(xì)胞外區(qū)域的上游引物，其序列為5’GTCCTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCCATG CAA CCA GACCCA CCA ATC3’(帶下劃線的序列為限制性內(nèi)切酶SfiI的酶切位點(diǎn))。生長(zhǎng)激素受體細(xì)胞外區(qū)域的下游引物，其序列為5’ TTG AGA CAT TTG TGG CAAGGT3’(黑體字為鏈接區(qū)序列)。
2)在500微升的PCR反應(yīng)管中加入1.4.3制得的cDNA 2微升2微摩爾的上游引物 10微升2微摩爾的下游引物 0.5微升去離子水 67.5微升置攝氏94度5分鐘后，立即置于冰上，瞬時(shí)離心，在管中加入10X Vent DNA聚合酶緩沖液 10微升2毫摩爾的dNTP 10微升Vent DNA聚合酶(2單位/微升)1.0微升混勻后，加入2滴液體石蠟覆蓋液面后，瞬時(shí)離心。
于下列條件下反應(yīng)3)攝氏94度1分鐘，攝氏55度1分鐘，攝氏72度2分鐘，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，攝氏72度延伸10分鐘，置于攝氏4度。
1.5人工合成步驟1.3所列的本發(fā)明所提出的新的DNA片段。
1.5.1人工合成下列DNA片段，其中片段1，3，5，7為正鏈，片段2，4，6，8為反鏈，按1.5.2到1.6.5的方法構(gòu)建。
片段15’ CAA TCT ATG CAA CCA TTG ACCGTC TAC CTG GTA GAA TCC TTT GAA GGT TAC AAC GGT TCT AAC AGA CAAAAG TCC AGA GTC 3’(黑體字為鏈接區(qū)序列)片段25’AGT AGA AAC TGG AAC GTA AGA AAG CTT AAC GTC CTT TTCGTA TTC AAC TCT GAC TCT GGA CTT TTG TCT GTT AGA ACC GTT GTA ACCTTC AAA GGA TTC3’片段35’AGA GTT GAA TAC GAA AAG GAC GTT AAG CTT TCT TAC GTTCCA GTT TCT ACT ACC TTG ATC CCA GAT ATG ATG AAG TGG AAA ACT GAAAAC GTC GAA AAG TAC 3’片段45’GTT GGC GTC AAT TTG TTT GCC CCA CAT AAC TAG TTC GTA TTCCAA TTG GTA CTTTTC GAC GTT TTC AGT TTT CCA CTT CAT CAT ATC TGGGAT CAA GGT3’片段55’CAA TTG GAA TAC GAA CTA GTT ATG TGG GGC AAA CAA ATTGAC GCC AAC AGA CCA GCT GAA TGG AGA GTT CAA ATC GAT GCT CAC ATTGGT ACT TTG 3’
片段65’TTG TGG GTC TGG TGG GAT AGC TAA GTT CCA AGT CAA CAA GTTGAC AGA CAA AGT ACC AAT GTG AGC ATC GAT TTG AAC TCT CCA TTC AGC TGGTCT 3’片段75’TCT GTC AAC TTG TTG ACT TGG AAC TTA GCT ATC CCA CCA GACCCA CAA 3’片段8片段85’GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC TTG TGG GTC TGG TGG GAT AGC TAA GTT CCA AGT CAA CAAGTT GAC AGA CAA AGT ACC AAT GTG AGC ATC GAT GTT3’(帶下劃線的序列為NotI的酶切位點(diǎn)，黑體字為鏈接區(qū)序列，斜黑體字為琥珀終止密碼子。)下面為上述1-8 DNA片段以及PCR上下游引物在人工合成的DNA雙鏈中的位置上 游 引物5’GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG CAA CCA GAC CCA CCA3’CAG GAG CGT TGA CGC CGG GTC GGC CGG TAC GTT GGT CTG GGT GGTATCGCT TTA AAC TGG ACT TTG TTG AAC GTC TCT TTG ACT GGT ATTTAG CGA AAT TTG ACC TGA AAC AAC TTG CAG AGA AAC TGA CCA TAACAC GCT GAT ATC CAA GTT AGA TGG GAA GCT CCA AGA AAC GCC GAC ATTGTG CGA CTA TAG GTT CAA TCT ACC CTT CGA GGT TCT TTG CGG CTG TAACAA AAA GGC TGG ATG GTT CTA GAA TAC GAA TTG CAA TAC AAG GAA GTCGTT TTT CCG ACC TAC CAA GAT CTT ATG CTT AAC GTT ATG TTC CTT CAGAAC GAA ACT AAA TGG AAG ATG ATG GAT CCA ATC TTG ACC ACT TCTTTG CTT TGA TTT ACC TTC TAC TAC CTA GGT TAG AAC TGG TGA AGAGTT CCA GTT TAC TCT CTT AAG GTT GAC AAG GAA TAC GAA GTT AGA GTCCAA GGT CAA ATG AGA GAA TTC CAA CTG TTC CTT ATG CTT CAA TCT CAGAGA TCC AAG CAA AGA AAC TCT GGT AAC TAC GGT GAA TTT TCC GAA GTATCT AGG TTC GTT TCT TTG AGA CCA TTG ATG CCA CTT AAA AGG CTT CAT片段 1CTG TAC GTC ACC TTG CCA CAA ATG TCT CAA GAC ATG CAG 下 游引物片 段 1 GTT AGA TAC GTT GGT AAC TGG CAG ATG GAC CAT 片 段2片 段 1 片 段 3 片 段 2片 段3GAA AAG GAC GTT AAG CTT TCT TAC GTT CCA GTT TCT ACT ACC TTG 片 段 2 片段4片 段 3ATC CCA GAT ATG ATG AAG TGG AAA ACT GAA AAC GTC GAA AAG TAC 片 段4片 段5 片 段 4片 段 5 片 段 6片 段 8片 段 5GTC AAC TTG TTG ACT TGG AAC TTA GCT ATC CCA CCA GAC CCA CAA3’CAG TTG AAC AAC TGA ACC TTG AAT CGA TAG GGT GGT CTG GGT GTT片 段6片 段8 片 段 81．5．2人工合成的DNA片段的5’端磷酸化制備下列反應(yīng)液合成的DNA片段1-7(0.5微克/微升)各 1微升IOXT4DNA多核苷酸激酶緩沖液7微升10毫摩爾的ATP 7微升噬菌體T4多核苷酸激酶(10單位／微升)2微升加水 53微升瞬時(shí)離心，置攝氏37度水浴1小時(shí)。然后，取30微升于攝氏95度變性10分鐘，然后緩慢冷卻到室溫。
1.5.3人工合成的5’端磷酸化的DNA片段的連接經(jīng)變性后緩慢冷卻到室溫的DNA片段 30微升5X T4 DNA連接酶緩沖液 9微升10毫摩爾的ATP 4微升T4 DNA連接酶 4魏氏單位加水至45微升將連接產(chǎn)物在攝氏16度反應(yīng)16小時(shí)。然后于攝氏65度反應(yīng)15分鐘。
1.5.4人工連接的DNA片段的純化向1.5.3所制得的反應(yīng)液中加入4.5微升的3摩爾的pH5.2的醋酸鈉，然后在加入90微升的無(wú)水乙醇，于負(fù)攝氏20度放置16個(gè)小時(shí)。然后離心收集沉淀，再用75％的酒精洗一遍。于室溫下自然干燥。然后溶于50微升pH8.0的10毫摩爾三羥基氨基甲烷-1毫摩爾乙二胺四乙酸緩沖液中。
1.5.5 DNA片段1的5’磷酸化合成的DNA片段1(0.5微克/微升) 1微升10XT4DNA多核苷酸激酶緩沖液 1微升10毫摩爾的ATP1微升噬菌體T4多核苷酸激酶(10單位/微升)0.5微升加水 6.5微升瞬時(shí)離心，置攝氏37度水浴1小時(shí)。然后于攝氏65度反應(yīng)15分鐘。置于攝氏4度保存。
1.5.6人工連接的純化的DNA片段的不對(duì)稱PCR擴(kuò)增制備下列反應(yīng)液10X Vent DNA聚合酶緩沖液 10微升2毫摩爾的dNTP 10微升2微摩爾5’磷酸化的DNA片段10.5微升2微摩爾的DNA片段8 10微升1.5.4所制得的DNA片段 2微升Vent DNA聚合酶(2單位/微升)1微升去離子水 67.5微升然后先于攝氏72度反應(yīng)10分鐘，然后攝氏94度1分鐘，攝氏62度1分鐘，攝氏72度2分鐘，35個(gè)循環(huán)。然后再在攝氏72度反應(yīng)10分鐘，于攝氏4度保存。
1.6本發(fā)明所描述的嵌合基因的制備1.6.1.嵌合基因的PCR擴(kuò)增制備下列反應(yīng)液10X Vent DNA聚合酶緩沖液 10微升2毫摩爾的dNTP 10微升步驟1.4.4制得的DNA片段2微升步驟1.5.6制得的DNA片段2微升2微摩爾的步驟1.4.4制得的上游引物 10微升2微摩爾的步驟1.5.1制得的DNA片段8 10微升Vent DNA聚合酶(2單位/微升)1微升去離子水55微升先于攝氏94度反應(yīng)5分鐘，攝氏72度反應(yīng)10分鐘后，再在攝氏94度1分鐘，攝氏62度1分鐘，攝氏72度2分鐘，35個(gè)循環(huán)。然后再在攝氏72度反應(yīng)10分鐘，于攝氏4度保存。
1.6.2.嵌合基因的純化用pH8.0的三羥基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸緩沖液配制1.5％的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠。加入1.6.1.制備的PCR產(chǎn)物后，在紫外燈下回收750堿基對(duì)的DNA片段。溶于100微升pH8.0的10毫摩爾三羥基氨基甲烷-1毫摩爾乙二胺四乙酸緩沖液中。
1.6.3.嵌合基因的限制性內(nèi)切酶消化將回收的PCR產(chǎn)物先后用SfiI和NotI進(jìn)行酶切。
SfiI酶切反應(yīng)純化的PCR產(chǎn)物(0.25-1微克) 70微升10X酶切緩沖液 8.5微升SfiI(10單位/微升) 5微升去離子水 1.5微升加入85微升的液體石蠟，于攝氏50度進(jìn)行4小時(shí)酶切反應(yīng)。反應(yīng)完畢后，置室溫平衡，瞬時(shí)離心，將管壁上的液體甩下。然后進(jìn)行NotI酶切。
NotI酶切反應(yīng)于上述酶切反應(yīng)液中加入3摩爾的氯化鈉 3.6微升10X酶切緩沖液 1.5微升NotI(10單位/微升) 6微升去離子水3.9微升攝氏37度酶切反應(yīng)4小時(shí)后，加入100微升酚—氯仿—異戊醇(25∶24∶1)，振蕩混合1分鐘，離心5分鐘。移上清至新的離心管中，加入10微升的3摩爾的pH5.2的醋酸鈉，然后在加入200微升的無(wú)水乙醇，于負(fù)攝氏20度放置16個(gè)小時(shí)。然后離心收集沉淀，再用75％的酒精洗一遍。于室溫下自然干燥。然后溶于50微升pH8.0的10毫摩爾三羥基氨基甲烷-1毫摩爾乙二胺四乙酸緩沖液中。
1.6.4.嵌合基因與pCANTAB-5-E的連接酶切的嵌合基因片段(150毫微克) 5微升10XT4DNA連接酶緩沖液 5微升酶切的pCANTAB-5-E(250毫微克) 5微升T4 DNA連接酶(1魏氏單位/微升) 3微升去離子水 31微升同時(shí)設(shè)一對(duì)照管，即僅有載體，無(wú)嵌合基因DNA片段。在攝氏16度連接1小時(shí)，置攝氏70度10分鐘滅活連接酶，乙醇沉淀，最后溶于20微升pH8.0的10毫摩爾三羥基氨基甲烷-1毫摩爾乙二胺四乙酸緩沖液中。于攝氏負(fù)20度保存。
1.6.5.嵌合基因與pCANTAB-5-E連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及表達(dá)產(chǎn)物的純化見(jiàn)Amersham Biosciences(目錄號(hào)27-9401-01和27-9402-01)的說(shuō)明。
權(quán)利要求
1.一種嵌合基因的構(gòu)建方法，在氨基酸序列合成時(shí)第一(或第二)鏈的方向?yàn)榘被说紧然送ㄟ^(guò)鏈接區(qū)鏈接第二(或第一)鏈，其特征是所述的第一鏈和第二鏈在合成時(shí)都以羧基端和鏈接區(qū)相連，所述的第二(或第一)鏈方向?yàn)轸然说桨被耍恍纬梢粭l完整的DNA鏈的嵌合基因序列的方向?yàn)榈谝?或第二)鏈的氨基端→羧基端→鏈接區(qū)→第二(或第一)鏈的羧基端→氨基端。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種嵌合基因的構(gòu)建方法，所述的第一鏈和第二鏈構(gòu)建成嵌合基因的基因片段，其特征是所述的基因片段是同種蛋白基因的全部基因或部分基因或是來(lái)自不同蛋白的基因片段，是來(lái)自生物體內(nèi)或是人工合成的基因片段；是確切的核苷酸序列，或是隨機(jī)的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種嵌合基因的構(gòu)建方法，其特征是所述的鏈接區(qū)由0-2000個(gè)氨基酸構(gòu)成，其最佳長(zhǎng)度為1-40個(gè)氨基酸序列，一般為苷氨酸和絲氨酸組成的鏈接序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種嵌合基因的構(gòu)建方法，其特征是所述的第二鏈的氨基端加入一個(gè)琥珀終止密碼子UAG，以使嵌合基因表達(dá)產(chǎn)物純化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種嵌合基因的構(gòu)建方法，其特征是在所述的琥珀終止密碼子UAG，的后面通過(guò)鏈接區(qū)連接噬菌體的基因片段，使其與外源性基因片段融合，并表達(dá)于噬菌體的表面，利于蛋白之間互相作用的深入研究。
6.一種嵌合基因的構(gòu)建方法的應(yīng)用，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄、聚合酶鏈反應(yīng)、拼接、測(cè)序和人工合成常見(jiàn)的分子生物學(xué)方法，證明用本發(fā)明的嵌合基因的構(gòu)建方法所構(gòu)成的嵌合基因，其特征是有更多的自由氨基端，有利于其與受體和配基的自由結(jié)合，和生物體內(nèi)天然存在的狀況類似，使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸，有利于細(xì)胞蛋白的合成，促進(jìn)構(gòu)建全新的分子的研究。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種嵌合基因的構(gòu)建方法，其氨基酸序列的連接方向?yàn)榈谝绘湹陌被恕然恕溄訁^(qū)→第二鏈的羧基端→氨基端，其中的一條鏈和傳統(tǒng)人工合成蛋白的方向相反，傳統(tǒng)方法的方向?yàn)榈谝绘湹陌被恕然恕溄訁^(qū)→第二鏈的氨基端→羧基端的序列，本發(fā)明序列的連接方式類似生物體內(nèi)天然存在的狀況，有更多的自由氨基端，有利于與受體和配基的自由組合，促進(jìn)構(gòu)建全新分子的研究。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1445371SQ0310061
公開(kāi)日2003年10月1日 申請(qǐng)日期2003年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月17日
發(fā)明者劉吉榮, 遲云發(fā) 申請(qǐng)人:北京神洲天才科技發(fā)展有限公司