專利名稱：Bibac基因文庫混合池的構(gòu)建方法及其混合池和基因的快速篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及植物基因文庫混合池的構(gòu)建方法及其混合池，以及植物基因的快速篩選方法。
背景技術(shù)：
構(gòu)建基因文庫是獲得特定基因的重要途徑之一，為適宜人和高等動(dòng)植物基因組及其復(fù)雜功能的研究，常通過人工染色體載體構(gòu)建基因文庫的方法獲得特定基因，如用雙元細(xì)菌人工染色體(binary BAC，BIBAC)構(gòu)建BIBAC基因文庫。所構(gòu)建的BIBAC基因文庫均是將供體基因組DNA的克隆貯存在一些文庫保存板中，每一塊文庫保存板通常有M列，每列有16個(gè)孔，共有384孔，每個(gè)孔用以貯存供體基因組DNA的單克隆菌液，因此，該文庫保存板也稱為384孔板，一個(gè)BIBAC基因文庫，根據(jù)供體材料的不同，常有幾十，甚至上百個(gè)文庫保存板，如云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所構(gòu)建的藥用野生稻BIBAC基因文庫，有140塊文庫保存板，包含53760個(gè)克隆。采用常規(guī)的BIBAC基因文庫篩選特異基因， 需要將該基因文庫包含的所有克隆一個(gè)一個(gè)或幾十個(gè)一起進(jìn)行PCR篩選，再去查找相應(yīng)的特異基因位置，會(huì)造成工作量很大的缺陷和不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有BIBAC基因文庫利用時(shí)存在工作量大的缺陷和不足，其發(fā)明目的提供一種BIBAC基因文庫混合池的構(gòu)建方法，本發(fā)明還提供用該方法所構(gòu)建的基因文庫混合池及其基因的快速篩選方法。為解決以上的技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案如下 一、BIBAC基因文庫混合池的構(gòu)建方法，包括如下步驟
(1)一級(jí)混合池的構(gòu)建
待BIBAC基因文庫的文庫保存板中的單克隆菌液完全融化后，將每一塊文庫保存板中每一列中的16個(gè)孔內(nèi)的單克隆菌液合并成一個(gè)一級(jí)混合池，將一級(jí)混合池標(biāo)記為(X)-y， X為文庫保存板的編號(hào)，X=l，2，3，……自然數(shù)，y為每一塊文庫保存板中列的編號(hào)，y=l， 2,3,……自然數(shù)，該一級(jí)混合池命名為(X) _y號(hào)一級(jí)混合池；
(2)二級(jí)混合池的構(gòu)建
將每一塊文庫保存板所對(duì)應(yīng)的一級(jí)混合池合并成一個(gè)二級(jí)混合池，將二級(jí)混合池標(biāo)記為X，X=l，2，3，……自然數(shù)，該二級(jí)混合池命名為X號(hào)二級(jí)混合池；X與文庫保存板的編號(hào)相同；
(3)三級(jí)混合池的構(gòu)建
按二級(jí)混合池編號(hào)順序從1號(hào)二級(jí)混合池開始，每10個(gè)二級(jí)混合池合并成為一個(gè)三級(jí)混合池，將三級(jí)混合池記為η，η =1，2，3，……自然數(shù)，該三級(jí)混合池命名為η號(hào)三級(jí)混合池。
二、一種BIBAC基因文庫混合池，所述的BIBAC基因文庫混合池是按上述技術(shù)方案 1所述的BIBAC基因文庫混合池的構(gòu)建方法構(gòu)建獲得。三、一種基因的快速篩選方法，包括以下步驟
(1)按上述技術(shù)方案1所述的BIBAC基因文庫混合池的構(gòu)建方法構(gòu)建一級(jí)混合池、二級(jí)混合池和三級(jí)混合池；
(2)根據(jù)目的基因的特異序列或同源基因序列設(shè)計(jì)引物，并合成該引物；
(3)以步驟(1)所構(gòu)建的三級(jí)混合池為第一步篩選的模板，用步驟(2)所獲得的引物按常規(guī)PCR方法進(jìn)行篩選，得到陽性克隆池；
(4)用步驟(3)所得到陽性克隆池所對(duì)應(yīng)的二級(jí)混合池為第二步篩選的模板，按照步驟(3)相同的PCR體系進(jìn)行篩選，得到陽性克隆池；
(5)用步驟(4)獲得的陽性克隆池所對(duì)應(yīng)的一級(jí)混合池作為第三步篩選的模板，按照步驟(3)相同的PCR體系進(jìn)行篩選，得到陽性克隆池；
(6)對(duì)步驟(5)所述的陽性克隆池所對(duì)應(yīng)的16個(gè)單克隆，按照步驟(3)相同的PCR體系進(jìn)行篩選，得到陽性克隆；
(7)，采用目的基因的特異序所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR時(shí)，如果步驟(3)到步驟(6)各步驟所得到的陽性克隆的片段大小相同，即可認(rèn)定步驟(6)獲得的陽性克隆為目的基因；采用同源基因序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR時(shí)，將步驟(6)得到陽性克隆回收純化，測序、進(jìn)行blast 比對(duì)，以比對(duì)結(jié)果確定目的基因。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是
1、本發(fā)明所述的BIBAC基因文庫混合池的構(gòu)建方法，構(gòu)建了一級(jí)混合池、二級(jí)混合池和三級(jí)混合池，能簡明清楚地記錄龐大的基因文庫各級(jí)混合池及其克隆的詳細(xì)位置，能準(zhǔn)確地找到任何單拷貝序列并且可以將其相對(duì)應(yīng)的克隆定位在基因文庫的具體位置，能為利用植物優(yōu)良基因提供可靠的材料，該方法易掌握。2、用本發(fā)明BIBAC基因文庫混合池的構(gòu)建方法所構(gòu)建的基因文庫混合池或用本發(fā)明的基因的快速篩選方法篩選基因，比用現(xiàn)有的BIBAC基因文庫直接篩選基因可結(jié)省大量工作量和大量成本，如實(shí)施例中的云南藥用野生稻BIBAC基因文庫包含53760個(gè)克隆，1 臺(tái)PCR機(jī)，按一次能擴(kuò)增96個(gè)單克隆計(jì)算，需進(jìn)行560次PCR，而用本發(fā)明BIBAC基因文庫混合池的構(gòu)建方法所構(gòu)建的基因文庫混合池或用本發(fā)明的基因的快速篩選方法篩選基因， 只需進(jìn)行4次PCR，節(jié)省500次PCR的工作量，大大提高了基因克隆效率。3、所構(gòu)建的基因文庫混合池還可重復(fù)用于多個(gè)基因的篩選。


圖1為雙元細(xì)菌人工染色體BIBAC2質(zhì)粒載體物理圖。圖2是一級(jí)混合池和二級(jí)混合池的構(gòu)建示意圖，圖中(X) -1 (X) -24，表示第X 塊文庫保存板中的M個(gè)一級(jí)混合池，X表示M個(gè)一級(jí)混合池合并成的一個(gè)二級(jí)混合池。圖3是三級(jí)混合池的構(gòu)建示意圖，圖中1 10表示1號(hào)二級(jí)混合池至10號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池合并構(gòu)建1個(gè)三級(jí)混合池，1表示1號(hào)三級(jí)混合池。圖4是本發(fā)明實(shí)施列3對(duì)14個(gè)三級(jí)混合池進(jìn)行)Ca21基因篩選的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果，圖中M為DL2000 Marker,泳道1是1號(hào)三級(jí)混合池；泳道2是2號(hào)三級(jí)混合池；泳道3是3號(hào)三級(jí)混合池；泳道4是4號(hào)三級(jí)混合池；泳道5是5號(hào)三級(jí)混合池；泳道6是6 號(hào)三級(jí)混合池；泳道7是7號(hào)三級(jí)混合池；泳道8是8號(hào)三級(jí)混合池；泳道9是9號(hào)三級(jí)混合池；泳道10是10號(hào)三級(jí)混合池；泳道11是11號(hào)三級(jí)混合池；泳道12是12號(hào)三級(jí)混合池；泳道13是13號(hào)三級(jí)混合池；泳道14是14號(hào)三級(jí)混合池，其中14號(hào)三級(jí)混合池是陽性克隆池。圖5是本發(fā)明實(shí)施列3對(duì)二級(jí)混合池進(jìn)行)Ca21基因篩選的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果， 圖中M為DL2000 Marker,泳道1是1；34 二級(jí)混合池；泳道2是135 二級(jí)混合池；泳道3是 136 二級(jí)混合池；泳道4是137 二級(jí)混合池，其中134號(hào)二級(jí)混合池是陽性克隆池。圖6是本發(fā)明實(shí)施列3對(duì)一級(jí)混合池進(jìn)行)Ca21基因篩選的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果， 圖中M為DL2000 Marker，泳道1是(1；34)_1號(hào)一級(jí)混合池；泳道2是(1；34)_2號(hào)一級(jí)混合池；泳道3是(1；34)-3號(hào)一級(jí)混合池；泳道4是(1；34)-4號(hào)一級(jí)混合池，其中(1；34)_4號(hào)一級(jí)混合池是陽性克隆池。圖7是本發(fā)明實(shí)施列3對(duì)(134) _4 —級(jí)混合池所對(duì)應(yīng)的16個(gè)單克隆進(jìn)行)Ca21基因篩選的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果，圖中M為DL2000 Marker,泳道1至16分別是第1個(gè)孔至第 16個(gè)孔中單克隆的電泳檢測結(jié)果，其中泳道4，泳道8，泳道15是陽性克隆。
具體實(shí)施例方式
藥用野生稻、Oryza officinalis Watt.)由于獨(dú)立起源和進(jìn)化，具有其它藥用野生稻不具有的結(jié)實(shí)率高等重要的特意優(yōu)良性狀，這些優(yōu)良性狀都是水稻育種的寶貴資源，是本領(lǐng)域常用的材料，以下實(shí)施例以云南藥用野生稻為供體材料對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，但不夠成限制本發(fā)明。當(dāng)然也可用其它供體植物材料按本發(fā)明方法構(gòu)建基因文庫文庫混合池和用本發(fā)明基因的快速篩選方法對(duì)基因進(jìn)行快速篩選。實(shí)施例1云南藥用野生稻BIBAC基因文庫的構(gòu)建
云南藥用野生稻BIBAC基因文庫的構(gòu)建是按照常規(guī)的BIBAC基因文庫的構(gòu)建方法構(gòu)建的。還可參照“云南藥用野生稻BIBAC文庫的構(gòu)建及分析”(作者侯思名等，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)第37卷第1期2011年2月，17-21)構(gòu)建。用現(xiàn)有的常規(guī)方法構(gòu)建的云南藥用野生稻BIBAC基因文庫的克隆載體是雙元細(xì)菌人工染色體BIBAC2，大小為23. 5kb,具有單克隆酶切位點(diǎn)BamHI，如圖1所示，對(duì)卡那霉素(Km)具有抗性，具有feci 基因，當(dāng)載體有外源片段插入，可以在含5%的蔗糖和卡那霉素(50mg/L)的LB培養(yǎng)基中生長；該云南藥用野生稻BIBAC基因文庫包括53760個(gè)克隆， 平均插入片段76 kb,保存在140塊文庫保存板中，每塊文庫保存板有M列，每列有16個(gè)孔，即每塊文庫保存板有384個(gè)孔用以貯存克隆菌液，用X表示文庫保存板的編號(hào)，X=l，2， 3，……140自然數(shù)；從第1塊文庫保存板開始，依次，命名為第1塊文庫保存板，第2塊文庫保存板，第3塊文庫保存板，第4塊文庫保存板，第5塊文庫保存板，……到第140塊文庫保存板，其基因文庫庫容相當(dāng)于云南藥用野生稻基因組的5. 86倍。實(shí)施例2 BIBAC基因文庫混合池的構(gòu)建方法及其混合池
將實(shí)施例1構(gòu)建的云南藥用野生稻BIBAC基因文庫，按以下步驟構(gòu)建BIBAC基因文庫混合池
(1) 一級(jí)混合池的構(gòu)建
①待云南藥用野生稻BIBAC基因文庫的文庫保存板中的單克隆菌液完全融化后，將每一塊文庫保存板中，每一列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并成一個(gè)一級(jí)混合池，每一塊文庫保存板有M列，共合并成M —個(gè)一級(jí)混合池，具體操作是用最大量程為10 μ 1的移液槍分別吸取文庫保存板的1列中的16個(gè)孔中單克隆菌液10 μ 1，合加在一個(gè)已裝有1.5ml培養(yǎng)基的離心管中，所述的培養(yǎng)基與構(gòu)建的云南藥用野生稻BIBAC基因文庫所采用的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件均相同，具體是所述的培養(yǎng)基是1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母膏，1.0% NaCl, 360mmol/LK2HP04, 132mmol/LKH2PO4, 17mmol/L, Na citrate 4mmol/L MgSO4 · 7H20，68 mmol /L (NH4)2S04，每次在吸取1個(gè)孔中的單克隆菌液之前先用移液槍將沉淀在板底的菌體重懸后再吸取菌液，每個(gè)單克隆菌液用一個(gè)無菌移液槍頭；將所建成的一級(jí)混合池放入 37°C恒溫?fù)u床中培養(yǎng)6 他(培養(yǎng)條件)；所述的百分?jǐn)?shù)為質(zhì)量分?jǐn)?shù)；
②將收集了的每一列的混合菌液離心管標(biāo)記為(X)_y，X為文庫保存板的編號(hào)，X=l， 2,3,……140自然數(shù);y為每一塊文庫保存板中列的編號(hào)，y=l，2，3，4，5，6，7，8，9，10，ll， 12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24 ；即每一塊文庫保存板有24個(gè)一級(jí)混合池(如圖2)，一級(jí)混合池命名為(X) -y號(hào)一級(jí)混合池；因云南藥用野生稻BIBAC基因文庫有140 塊文庫保存板，所以構(gòu)成3360個(gè)一級(jí)混合池(140XM=3360)；
以下以第1塊文庫保存板，第2塊文庫保存板，第3塊文庫保存板，第140塊文庫保存板為例，更具體地說明該文庫保存板中每一列16個(gè)孔的單克隆菌液合并在一個(gè)離心管中， 該離心管的標(biāo)記即一級(jí)混合池的標(biāo)記 第1塊文庫保存板
第1塊文庫保存板第1列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管記為(1)_1，命名為
-1號(hào)一級(jí)混合池，以下類推；(1) -2第1塊文庫保存板第2列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心售;標(biāo)記為(1)-2，第1塊文庫保存板第3列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心售;標(biāo)記為(1)-3，第1塊文庫保存板第4列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心售;標(biāo)記為(1)-4，第1塊文庫保存板第5列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心售;標(biāo)記為(1)-5，第1塊文庫保存板第6列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心售;標(biāo)記為(1)-6，第1塊文庫保存板第7列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心售;標(biāo)記為(1)-7，第1塊文庫保存板第8列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心售;標(biāo)記為(1)-8，第1塊文庫保存板第9列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心售;標(biāo)記為(1)-9，第1塊文庫保存板第10列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心<蒙標(biāo)記為(1)-10第1塊文庫保存板第11列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心<蒙標(biāo)記為(1)-11第1塊文庫保存板第12列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心-蒙標(biāo)記為(1)-12第1塊文庫保存板第13列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心-蒙標(biāo)記為(1)-13第1塊文庫保存板第14列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心-蒙標(biāo)記為(1)-14第1塊文庫保存板第15列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心-蒙標(biāo)記為(1)-15第1塊文庫保存板第16列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心-蒙標(biāo)記為(1)-16第1塊文庫保存板第17列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心-蒙標(biāo)記為(1)-17第1塊文庫保存板第18列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心-蒙標(biāo)記為(1)-18第1塊文庫保存板第19列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心-蒙標(biāo)記為(1)-19第1塊文庫保存板第20列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心-蒙標(biāo)記為(1)-20第1塊文庫保存板第21列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(1)-21， 第1塊文庫保存板第22列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(1)-22， 第1塊文庫保存板第23列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(1)-23， 第1塊文庫保存板第M列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(1) -24 ； 分別命名為(1) -1號(hào)一級(jí)混合池，(1)-2號(hào)一級(jí)混合池，(1)-3號(hào)一級(jí)混合池，(1)-4 號(hào)一級(jí)混合池，(1)-5號(hào)一級(jí)混合池，(1)-6號(hào)一級(jí)混合池，(1)-7號(hào)一級(jí)混合池，(1)-8號(hào)一級(jí)混合池，(1) -9號(hào)一級(jí)混合池，(1) -10號(hào)一級(jí)混合池，(1) -11號(hào)一級(jí)混合池，(1) -12 號(hào)一級(jí)混合池，(1) -13號(hào)一級(jí)混合池，(1) -14號(hào)一級(jí)混合池，(1) -15號(hào)一級(jí)混合池， (1)-6號(hào)一級(jí)混合池，(1) -17號(hào)一級(jí)混合池，(1) -18號(hào)一級(jí)混合池，(1) -19號(hào)一級(jí)混合池，(1) -20號(hào)一級(jí)混合池，(1)-21號(hào)一級(jí)混合池，(1)-22號(hào)一級(jí)混合池，(1) -23號(hào)一級(jí)混合池，(1)-24號(hào)一級(jí)混合池，以下類推； 第2塊文庫保存板
第2塊文庫保存板第1列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管記為(2) -1， 第2塊文庫保存板第2列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(2) -2， 第2塊文庫保存板第3列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(2) -3， 第2塊文庫保存板第4列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(2) -4， 第2塊文庫保存板第5列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(2) -5， 第2塊文庫保存板第6列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(2) -6， 第2塊文庫保存板第7列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(2) -7， 第2塊文庫保存板第8列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(2) -8， 第2塊文庫保存板第9列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(2) -9，
第2塊文庫保存板第10列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-10,第2塊文庫保存板第11列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-11,第2塊文庫保存板第12列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-12，第2塊文庫保存板第13列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-13，第2塊文庫保存板第14列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-14，第2塊文庫保存板第15列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-15，第2塊文庫保存板第16列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-16，第2塊文庫保存板第17列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-17，第2塊文庫保存板第18列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-18，第2塊文庫保存板第19列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-19，第2塊文庫保存板第20列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-20，第2塊文庫保存板第21列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-21，第2塊文庫保存板第22列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-22，第2塊文庫保存板第23列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)-23，第2塊文庫保存板第24列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(2)—24
第3塊文庫保存板
第3塊文庫保存板第1列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管記為(3)-1， 第3塊文庫保存板第2列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3) -2，第3塊文庫保存板第3列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3) -3 第3塊文庫保存板第4列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3) -4 第3塊文庫保存板第5列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3) -5 第3塊文庫保存板第6列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3) -6 第3塊文庫保存板第7列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3) -7 第3塊文庫保存板第8列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3) -8 第3塊文庫保存板第9列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(3) -9
第3塊文庫保存板第10列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(3)-10,第3塊文庫保存板第11列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(3)-11,第3塊文庫保存板第12列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(3)-12，第3塊文庫保存板第13列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(3)-13，第3塊文庫保存板第14列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(3)-14，第3塊文庫保存板第15列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(3)-15，第3塊文庫保存板第16列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(3)-16，第3塊文庫保存板第17列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(3)-17，第3塊文庫保存板第18列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(3)-18，第3塊文庫保存板第19列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(3)-19，第3塊文庫保存板第20列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(3)-20，第3塊文庫保存板第21列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(3)-21，第3塊文庫保存板第22列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(3)-22，第3塊文庫保存板第23列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(3)-23，第3塊文庫保存板第24列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離f標(biāo)記為(3)-24
依此類推，到第140塊文庫保存板時(shí)，合并單克隆菌液的離心管標(biāo)記是 第140塊文庫保存板第1列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管記為(140)-1， 第140塊文庫保存板第2列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-2， 第140塊文庫保存板第3列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-3， 第140塊文庫保存板第4列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-4， 第140塊文庫保存板第5列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-5， 第140塊文庫保存板第6列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-6， 第140塊文庫保存板第7列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-7， 第140塊文庫保存板第8列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-8， 第140塊文庫保存板第9列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-9， 第140塊文庫保存板第10列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-10 第140塊文庫保存板第11列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-11 第140塊文庫保存板第12列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-12 第140塊文庫保存板第13列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-13 第140塊文庫保存板第14列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-14 第140塊文庫保存板第15列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-15 第140塊文庫保存板第16列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-16庫保存板第17列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-17， 第140塊文庫保存板第18列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-18， 第140塊文庫保存板第19列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-19， 第140塊文庫保存板第20列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-20， 第140塊文庫保存板第21列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-21， 第140塊文庫保存板第22列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-22， 第140塊文庫保存板第23列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-23， 第140塊文庫保存板第M列中16個(gè)孔的單克隆菌液合并的離心管標(biāo)記為(140)-24 ； (2) 二級(jí)混合池的構(gòu)建
對(duì)步驟(1)的一級(jí)混合池再進(jìn)行組合，將每一塊文庫保存板所對(duì)應(yīng)的M個(gè)一級(jí)混合池合并成一個(gè)二級(jí)混合池(圖2)，具體操作是從第1文庫保存板開始，依次，將每一文庫保存板所對(duì)應(yīng)的M個(gè)一級(jí)混合池中的混合菌液分別用最大量程為200 μ 1移液槍吸取50 μ 1 混合菌液，合加在一個(gè)空的1. 5ml離心管中，將離心管標(biāo)記為X，X為文庫保存板的編號(hào)， X=l，2，3，……自然數(shù)，該混合池命名為X號(hào)二級(jí)混合池；每次吸取一個(gè)一級(jí)混合池的混合菌液之前，先用該移液槍充分混勻，并且每次更換無菌移液槍頭；將構(gòu)建成的二級(jí)混合池放入37°C恒溫?fù)u床中培養(yǎng)6 他；因每一塊文庫保存板所對(duì)應(yīng)的M個(gè)一級(jí)混合池合并成一個(gè)二級(jí)混合池，云南藥用野生稻BIBAC基因文庫有140塊文庫保存板，所以構(gòu)成140個(gè)二級(jí)混合池，即二級(jí)混合池的數(shù)為X，X=云南藥用野生稻BIBAC基因文庫的文庫保存板數(shù)；
以下以第1塊文庫保存板，第2塊文庫保存板，第3塊文庫保存板，第140塊文庫保存板為例，更具體地說明各文庫保存板所對(duì)應(yīng)的M個(gè)一級(jí)混合池合并成一個(gè)二級(jí)混合池及其標(biāo)記
第1塊文庫保存板所對(duì)應(yīng)的M個(gè)一級(jí)混合池分別是(I)-I號(hào)一級(jí)混合池，(1)-2號(hào)一級(jí)混合池，(1)-3號(hào)一級(jí)混合池，(1)-4號(hào)一級(jí)混合池，(1)-5號(hào)一級(jí)混合池，(1)-6號(hào)一級(jí)混合池，(1)-7號(hào)一級(jí)混合池，(1)-8號(hào)一級(jí)混合池，(1)-9號(hào)一級(jí)混合池，(I)-IO號(hào)一級(jí)混合池，(I)-Il號(hào)一級(jí)混合池，(1)-12號(hào)一級(jí)混合池，(1)-13號(hào)一級(jí)混合池，(1)-14號(hào)一級(jí)混合池，(1)-15號(hào)一級(jí)混合池，(1)-16號(hào)一級(jí)混合池，(1)-17號(hào)一級(jí)混合池，(1)-18號(hào)一級(jí)混合池，(1)-19號(hào)一級(jí)混合池，(1)-20號(hào)一級(jí)混合池，(1)-21號(hào)一級(jí)混合池，(1)-22 號(hào)一級(jí)混合池，(1) -23號(hào)一級(jí)混合池，(1)-24號(hào)一級(jí)混合池；將這M個(gè)一級(jí)混合池按上述方法合并后的二級(jí)混合池標(biāo)記是1，X=I ；命名為1號(hào)二級(jí)混合池
第2塊文庫保存板所對(duì)應(yīng)的M個(gè)一級(jí)混合池分別是(2)-1號(hào)一級(jí)混合池，(2)-2號(hào)一級(jí)混合池，(2)-3號(hào)一級(jí)混合池，(2)-4號(hào)一級(jí)混合池，(2)-5號(hào)一級(jí)混合池，(2)-6號(hào)一級(jí)混合池，(2)-7號(hào)一級(jí)混合池，(2)-8號(hào)一級(jí)混合池，(2)-9號(hào)一級(jí)混合池，(2)-10號(hào)一級(jí)混合池，(2)-11號(hào)一級(jí)混合池，(2)-12號(hào)一級(jí)混合池，(2)-13號(hào)一級(jí)混合池，(2)-14號(hào)一級(jí)混合池，(2)-15號(hào)一級(jí)混合池，(2)-16號(hào)一級(jí)混合池，(2)-17號(hào)一級(jí)混合池，(2)-18號(hào)一級(jí)混合池，(2)-19號(hào)一級(jí)混合池，(2)-20號(hào)一級(jí)混合池，(2)-21號(hào)一級(jí)混合池，(2)-22 號(hào)一級(jí)混合池，(2) -23號(hào)一級(jí)混合池，(2) -24號(hào)一級(jí)混合池；將這M個(gè)一級(jí)混合池按上述方法合并后的二級(jí)混合池的標(biāo)記是2，X=2 ；命名為2號(hào)二級(jí)混合池；
第3塊文庫保存板所對(duì)應(yīng)的M個(gè)一級(jí)混合池分別是(3) -1號(hào)一級(jí)混合池，(3) -3號(hào)一級(jí)混合池，(3) -4號(hào)一級(jí)混合池，(3) -5號(hào)一級(jí)混合池，(3) -6號(hào)一級(jí)混合池，(3) -7號(hào)一級(jí)混合池，(3)-8號(hào)一級(jí)混合池，(3)-9號(hào)一級(jí)混合池，(3)-10號(hào)一級(jí)混合池，(3)-11 號(hào)一級(jí)混合池，(3) -12號(hào)一級(jí)混合池，(3) -13號(hào)一級(jí)混合池，(3) -14號(hào)一級(jí)混合池， (3) -15號(hào)一級(jí)混合池，(3) -16號(hào)一級(jí)混合池，(3) -17號(hào)一級(jí)混合池，(3) -18號(hào)一級(jí)混合池，(3) -19號(hào)一級(jí)混合池，(3) -20號(hào)一級(jí)混合池，(3) -21號(hào)一級(jí)混合池，(3) -22號(hào)一級(jí)混合池，(3) -23號(hào)一級(jí)混合池，(3) -24號(hào)一級(jí)混合池；將這M個(gè)一級(jí)混合池按上述方法合并后的二級(jí)混合池的標(biāo)記是3，X=3 ；命名為3號(hào)二級(jí)混合池；
依此類推，到第140塊文庫保存板時(shí)，第140塊文庫保存板所對(duì)應(yīng)的M個(gè)一級(jí)混合池分別是(140) -1號(hào)一級(jí)混合池，(140) -2號(hào)一級(jí)混合池，(140) -3號(hào)一級(jí)混合池，(140) -4 號(hào)一級(jí)混合池，(140) -5號(hào)一級(jí)混合池，(140) -6號(hào)一級(jí)混合池，(140) -7號(hào)一級(jí)混合池， (140) -8號(hào)一級(jí)混合池，(140) -9號(hào)一級(jí)混合池，(140) -10號(hào)一級(jí)混合池，(140) -11號(hào)一級(jí)混合池，(140) -12號(hào)一級(jí)混合池，(140) -13號(hào)一級(jí)混合池，(140) -14號(hào)一級(jí)混合池， (140)-15號(hào)一級(jí)混合池，(140)-16號(hào)一級(jí)混合池，(140)-17號(hào)一級(jí)混合池，(140)-18號(hào)一級(jí)混合池，(140) -19號(hào)一級(jí)混合池，(140) -20號(hào)一級(jí)混合池，(140) -21號(hào)一級(jí)混合池， (140) -22號(hào)一級(jí)混合池，(140) -23號(hào)一級(jí)混合池，(140) -24號(hào)一級(jí)混合池；將這M個(gè)一級(jí)混合池按上述方法合并后的二級(jí)混合池的標(biāo)記是140，X=140 ；命名為140號(hào)二級(jí)混合池；
(3)三級(jí)混合池的構(gòu)建
按步驟(2)的二級(jí)混合池編號(hào)順序從1號(hào)二級(jí)混合池開始，每10個(gè)二級(jí)混合池合并成為一個(gè)三級(jí)混合池(圖3)，將每10個(gè)二級(jí)混合池中混合菌液分別用最大量程為200 μ 1移液槍吸取100 μ 1混合菌液，合加在一個(gè)空的1. 5mL離心管中，將離心管標(biāo)記為1，即n=l，該混合池命名為1號(hào)三級(jí)混合池，共構(gòu)成X/10個(gè)三級(jí)混合池，X與文庫保存板的編號(hào)相同，云南藥用野生稻BIBAC基因文庫有140塊文庫保存板，即X=140，X/10=140/10=14，所以構(gòu)成 14個(gè)三級(jí)混合池；
以下從1號(hào)二級(jí)混合池開始，將1號(hào)二級(jí)混合池至10號(hào)二級(jí)混合池的10個(gè)二級(jí)混合池合并成一個(gè)三級(jí)混合池，依次，至140號(hào)二級(jí)混合池的合并及標(biāo)記如下
將1號(hào)二級(jí)混合池，2號(hào)二級(jí)混合池，3號(hào)二級(jí)混合池，4號(hào)二級(jí)混合池，5號(hào)二級(jí)混合池，6號(hào)二級(jí)混合池，7號(hào)二級(jí)混合池，8號(hào)二級(jí)混合池，9號(hào)二級(jí)混合池和10號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為1，n=l，該混合池命名為1號(hào)三級(jí)混合池；
將11號(hào)二級(jí)混合池，12號(hào)二級(jí)混合池，13號(hào)二級(jí)混合池，14號(hào)二級(jí)混合池，15號(hào)二級(jí)混合池，16號(hào)二級(jí)混合池，17號(hào)二級(jí)混合池，18號(hào)二級(jí)混合池，19號(hào)二級(jí)混合池和20號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為2，n=2, 該混合池命名為2號(hào)三級(jí)混合池；
將21號(hào)二級(jí)混合池，22號(hào)二級(jí)混合池，23號(hào)二級(jí)混合池，M號(hào)二級(jí)混合池，25號(hào)二級(jí)混合池J6號(hào)二級(jí)混合池，27號(hào)二級(jí)混合池，觀號(hào)二級(jí)混合池，四號(hào)二級(jí)混合池和30號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為3，n=3, 該混合池命名為3號(hào)三級(jí)混合池；
將31號(hào)二級(jí)混合池，32號(hào)二級(jí)混合池，33號(hào)二級(jí)混合池，34號(hào)二級(jí)混合池，35號(hào)二級(jí)混合池，36號(hào)二級(jí)混合池，37號(hào)二級(jí)混合池，38號(hào)二級(jí)混合池，39號(hào)二級(jí)混合池和40號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為4，n=4, 該混合池命名為4號(hào)三級(jí)混合池；
將41號(hào)二級(jí)混合池，42號(hào)二級(jí)混合池，43號(hào)二級(jí)混合池，44號(hào)二級(jí)混合池，45號(hào)二級(jí)混合池，46號(hào)二級(jí)混合池，47號(hào)二級(jí)混合池，48號(hào)二級(jí)混合池，49號(hào)二級(jí)混合池和50號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為5，n=5, 該混合池命名為5號(hào)三級(jí)混合池；
將51號(hào)二級(jí)混合池，52號(hào)二級(jí)混合池，53號(hào)二級(jí)混合池，54號(hào)二級(jí)混合池，55號(hào)二級(jí)混合池，56號(hào)二級(jí)混合池，57號(hào)二級(jí)混合池，58號(hào)二級(jí)混合池，59號(hào)二級(jí)混合池和60號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為6，n=6, 該混合池命名為6號(hào)三級(jí)混合池；
將61號(hào)二級(jí)混合池，62號(hào)二級(jí)混合池，63號(hào)二級(jí)混合池，64號(hào)二級(jí)混合池，65號(hào)二級(jí)混合池，66號(hào)二級(jí)混合池，67號(hào)二級(jí)混合池，68號(hào)二級(jí)混合池，69號(hào)二級(jí)混合池和70號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為7，n=7, 該混合池命名為7號(hào)三級(jí)混合池；
將71號(hào)二級(jí)混合池，72號(hào)二級(jí)混合池，73號(hào)二級(jí)混合池，74號(hào)二級(jí)混合池，75號(hào)二級(jí)混合池，76號(hào)二級(jí)混合池，77號(hào)二級(jí)混合池，78號(hào)二級(jí)混合池，79號(hào)二級(jí)混合池和80號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為8，n=8, 該混合池命名為8號(hào)三級(jí)混合池；
將81號(hào)二級(jí)混合池，82號(hào)二級(jí)混合池，83號(hào)二級(jí)混合池，84號(hào)二級(jí)混合池，85號(hào)二級(jí)混合池，86號(hào)二級(jí)混合池，87號(hào)二級(jí)混合池，88號(hào)二級(jí)混合池，89號(hào)二級(jí)混合池和90號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為9，n=9, 該混合池命名為9號(hào)三級(jí)混合池；
將91號(hào)二級(jí)混合池，92號(hào)二級(jí)混合池，93號(hào)二級(jí)混合池，94號(hào)二級(jí)混合池，95號(hào)二級(jí)混合池，96號(hào)二級(jí)混合池，97號(hào)二級(jí)混合池，98號(hào)二級(jí)混合池，99號(hào)二級(jí)混合池和100號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為10， n=10，該混合池命名為10號(hào)三級(jí)混合池；
將101號(hào)二級(jí)混合池，102號(hào)二級(jí)混合池，103號(hào)二級(jí)混合池，104號(hào)二級(jí)混合池，105號(hào)二級(jí)混合池，106號(hào)二級(jí)混合池，107號(hào)二級(jí)混合池，108號(hào)二級(jí)混合池，109號(hào)二級(jí)混合池和 110號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為 11，n=ll，該混合池命名為11號(hào)三級(jí)混合池；
將111號(hào)二級(jí)混合池，112號(hào)二級(jí)混合池，113號(hào)二級(jí)混合池，114號(hào)二級(jí)混合池，115號(hào)二級(jí)混合池，116號(hào)二級(jí)混合池，117號(hào)二級(jí)混合池，118號(hào)二級(jí)混合池，119號(hào)二級(jí)混合池和 120號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為 12，n=12，該混合池命名為12號(hào)三級(jí)混合池；
將121號(hào)二級(jí)混合池，122號(hào)二級(jí)混合池，123號(hào)二級(jí)混合池，124號(hào)二級(jí)混合池，125 號(hào)二級(jí)混合池，126號(hào)二級(jí)混合池，127號(hào)二級(jí)混合池，128號(hào)二級(jí)混合池，129號(hào)二級(jí)混合池和130號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為13，n=13，該混合池命名為13號(hào)三級(jí)混合池；
將131號(hào)二級(jí)混合池，132號(hào)二級(jí)混合池，133號(hào)二級(jí)混合池，134號(hào)二級(jí)混合池，135號(hào)二級(jí)混合池，136號(hào)二級(jí)混合池，137號(hào)二級(jí)混合池，138號(hào)二級(jí)混合池，139號(hào)二級(jí)混合池和 140號(hào)二級(jí)混合池共10個(gè)二級(jí)混合池按上述方法合并成一個(gè)三級(jí)混合池，其離心管標(biāo)記為 14，n=14，該混合池命名為14號(hào)三級(jí)混合池。按上述方法所構(gòu)建的混合池為本發(fā)明所述的BIBAC基因文庫混合池。實(shí)施例3 —種基因的快速篩選的方法
本實(shí)施列以篩選抗白葉枯病基因)(a21為例，闡述本發(fā)明所述的一種基因的快速篩選的方法，其步驟如下
(1)、按實(shí)施例2構(gòu)建云南藥用野生稻BIBAC基因文庫一級(jí)混合池、二級(jí)混合池和三級(jí)混合池；
(2)、根據(jù)抗白葉枯病基因)Ca21的序列設(shè)計(jì)引物，并合成該引物
根據(jù)在Genbank查找抗白葉枯病基因辦21的序列設(shè)計(jì)特異引物，所述的特異引物的堿基序列是
5 ‘ -AGACGCGGAAGGGTGGTTCCCGGA-3‘； 5 ‘ -AGACGCGGTAATCGAAAGATGAAA-3‘ 上述引物對(duì)委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；
(3)以步驟(1)所構(gòu)建的三級(jí)混合池為第一步篩選的模板，用步驟(2)所獲得的引物按常規(guī)PCR方法進(jìn)行篩選，得到陽性克隆池；
所述的第一步篩選的模板分別是云南藥用野生稻BIBAC基因文庫混合池的如下14個(gè)三級(jí)混合池
1號(hào)三級(jí)混合池；2號(hào)三級(jí)混合池；3號(hào)三級(jí)混合池；4號(hào)三級(jí)混合池；5號(hào)三級(jí)混合池； 6號(hào)三級(jí)混合池；7號(hào)三級(jí)混合池；8號(hào)三級(jí)混合池；9號(hào)三級(jí)混合池；10號(hào)三級(jí)混合池；11 號(hào)三級(jí)混合池；12號(hào)三級(jí)混合池；13號(hào)三級(jí)混合池；14號(hào)三級(jí)混合池。經(jīng)試驗(yàn)，確定最佳PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表1，PCR反應(yīng)總體系為20 μ 1 ；
權(quán)利要求
1.BIBAC基因文庫混合池的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)一級(jí)混合池的構(gòu)建待BIBAC基因文庫的文庫保存板中的單克隆菌液完全融化后，將每一塊文庫保存板中每一列中的16個(gè)孔內(nèi)的單克隆菌液合并成一個(gè)一級(jí)混合池，將一級(jí)混合池標(biāo)記為(X)-y， X為文庫保存板的編號(hào)，X=l，2，3，……自然數(shù)，y為每一塊文庫保存板中列的編號(hào)，y=l， 2,3,……自然數(shù)，該一級(jí)混合池命名為(X) _y號(hào)一級(jí)混合池；(2)二級(jí)混合池的構(gòu)建將每一塊文庫保存板所對(duì)應(yīng)的一級(jí)混合池合并成一個(gè)二級(jí)混合池，將二級(jí)混合池標(biāo)記為X，X=l，2，3，……自然數(shù)，該二級(jí)混合池命名為X號(hào)二級(jí)混合池；X與文庫保存板的編號(hào)相同；(3)三級(jí)混合池的構(gòu)建按二級(jí)混合池編號(hào)順序從1號(hào)二級(jí)混合池開始，每10個(gè)二級(jí)混合池合并成為一個(gè)三級(jí)混合池，將三級(jí)混合池記為η，η =1,2,3,……自然數(shù)，該三級(jí)混合池命名為η號(hào)三級(jí)混合池。
2.—種BIBAC基因文庫混合池，所述的BIBAC基因文庫混合池是按權(quán)利要求1所述的 BIBAC基因文庫混合池的構(gòu)建方法構(gòu)建獲得。
3.一種基因的快速篩選方法，包括以下步驟(1)按上述技術(shù)方案1所述的BIBAC基因文庫混合池的構(gòu)建方法構(gòu)建一級(jí)混合池、二級(jí)混合池和三級(jí)混合池；(2)根據(jù)目的基因的特異序列或同源基因序列設(shè)計(jì)引物，并合成該引物；(3)以步驟(1)所構(gòu)建的三級(jí)混合池為第一步篩選的模板，用步驟(2)所獲得的引物按常規(guī)PCR方法進(jìn)行篩選，得到陽性克隆池；(4)用步驟(3)所得到陽性克隆池所對(duì)應(yīng)的二級(jí)混合池為第二步篩選的模板，按照步驟(3)相同的PCR體系進(jìn)行篩選，得到陽性克隆池；(5)用步驟(4)獲得的陽性克隆池所對(duì)應(yīng)的一級(jí)混合池作為第三步篩選的模板，按照步驟(3)相同的PCR體系進(jìn)行篩選，得到陽性克隆池；(6)對(duì)步驟(5)所述的陽性克隆池所對(duì)應(yīng)的16個(gè)單克隆，按照步驟(3)相同的PCR體系進(jìn)行篩選，得到陽性克?。?7)，采用目的基因的特異序所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR時(shí)，如果步驟(3)到步驟(6)各步驟所得到的陽性克隆的片段大小相同，即可認(rèn)定步驟(6)獲得的陽性克隆為目的基因；采用同源基因序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR時(shí)，將步驟(6)得到陽性克隆回收純化，測序、進(jìn)行blast 比對(duì)，以比對(duì)結(jié)果確定目的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了BIBAC基因文庫混合池的構(gòu)建方法及其混合池和基因的快速篩選方法，BIBAC基因文庫混合池的構(gòu)建是將每一塊文庫保存板中每一列中的16個(gè)孔內(nèi)的單克隆菌液合并成一個(gè)一級(jí)混合池；將每一塊文庫保存板所對(duì)應(yīng)的一級(jí)混合池合并成一個(gè)二級(jí)混合池；每10個(gè)二級(jí)混合池合并成為一個(gè)三級(jí)混合池?；虻目焖俸Y選方法是以三級(jí)混合池為第一步篩選的模板，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR，篩選得到陽性克隆池；然后逐一以得到陽性克隆池所對(duì)應(yīng)的混合池為篩選的模板，最后得到陽性克??；根據(jù)各步驟所得到的陽性克隆的片段大小或測序比對(duì)，確定目的基因。所構(gòu)建混合池能準(zhǔn)確地找到任何單拷貝序列，基因的快速篩選方法可節(jié)省大量工作量和大量成本。
文檔編號(hào)C40B50/06GK102443854SQ201110256870
公開日2012年5月9日 申請日期2011年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月2日
發(fā)明者付堅(jiān), 余騰瓊, 侯思名, 張敦宇, 張薇, 李娥賢, 李定琴, 李維蛟, 殷富有, 王玲仙, 程在全, 蔣聰, 郭怡卿, 鐘巧芳, 陳玲, 黃興奇 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所