專利名稱：Hcv病毒體外培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種全新的體外培養(yǎng)丙型肝炎病毒的方法。
丙型肝炎病毒是通過輸血獲得肝炎的主要原因。丙型肝炎病毒也可以通過其他經(jīng)皮途徑(例如通過靜脈注射毒品)傳播。而且，從事健康方面的職業(yè)人士被感染的風(fēng)險(xiǎn)也是不可以被忽視的。
丙型肝炎有別于其他形式的與病毒相關(guān)的肝臟疾病，例如甲型肝炎、乙型肝炎和丁型肝炎。丙型肝炎病毒(HCV)的感染通常為慢性，在大量病例中導(dǎo)致諸如肝炎、腹瀉和癌癥等肝臟疾病。
盡管通過輸血傳播的風(fēng)險(xiǎn)由于選擇供血者而降低，丙型肝炎病例的頻數(shù)仍然保持為高水平。目前，全世界約有1.7億人被HCV慢性感染。高危人群主要發(fā)現(xiàn)于曾進(jìn)行輸血或靜脈藥物使用者的個(gè)體，但是也存在不屬于這些高危群體、體內(nèi)發(fā)現(xiàn)循環(huán)抗HCV抗體的無癥狀供血者。對(duì)于后者，感染途徑尚未確定。
HCV是第一個(gè)使用分子生物學(xué)技術(shù)分離的趨肝病毒(hepatotropicvirus)。病毒基因組序列在未觀察到病毒顆粒的情況下得到克隆。
目前，即使已知存在其他形式的含有病毒RNA的顆粒，出現(xiàn)在感染患者血液中的僅有的天然病毒顆粒以無包膜的衣殼為特征。
出于方便起見，在本申請(qǐng)中，“病毒”這一術(shù)語將用來指任何含有HCV病毒RNA的顆粒。這兩個(gè)術(shù)語的使用也沒有區(qū)別。
HCV為約9.5kb的單鏈正鏈RNA病毒，通過互補(bǔ)RNA的拷貝進(jìn)行復(fù)制，翻譯產(chǎn)物為一個(gè)單獨(dú)的、約3000個(gè)氨基酸的多聚蛋白質(zhì)。HCV基因組的5’末端對(duì)應(yīng)為非翻譯區(qū)，與編碼結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、核衣殼核心蛋白質(zhì)和兩種包膜糖蛋白E1和E2的基因毗鄰。在不同基因型中，5’非翻譯區(qū)和核心基因相對(duì)高度保守，但是E2包膜蛋白質(zhì)則由高變異區(qū)編碼，此高變異區(qū)在各分離株均不同。HCV基因組3’末端含有編碼非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(NS)的基因和高度保守的3′非編碼區(qū)。
由于基因組結(jié)構(gòu)和假設(shè)的復(fù)制模式，HCV被分類為黃病毒科的一個(gè)新的屬hepaciviruses。
術(shù)語“HCV病毒”指人類致病株、減毒株、以及來源于上述病毒株的缺陷株等任何病毒種類。當(dāng)然，已知RNA病毒呈現(xiàn)高度自發(fā)突變率。因此存在具有更高或更低毒力的眾多病毒株。鑒定這些病毒株在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)，例如，通過其關(guān)于參照毒株的核酸和/或肽序列同源性、和/或通過形態(tài)學(xué)和/或免疫學(xué)標(biāo)準(zhǔn)鑒定株系或分離物。
用于診斷HCV的許多技術(shù)得到了發(fā)展。例如，實(shí)施診斷性免疫試驗(yàn)，檢測(cè)患者血清中抗HCV蛋白質(zhì)的抗體。以病毒RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA以及PCR擴(kuò)增同樣用于檢測(cè)HCV基因組，例如對(duì)慢性感染者或?qū)?shí)驗(yàn)感染的黑猩猩的血清中隱性感染的病毒進(jìn)行間接測(cè)量。此外，在基因克隆的基礎(chǔ)上，使用DNA探針的雜交技術(shù)也得到發(fā)展。
然而，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，現(xiàn)有的診斷技術(shù)缺乏靈敏性和/或特異性和/或受累于其操作困難。例如，使用探針雜交方法，不可能將具有低感染能力的病毒與具有高感染能力的病毒區(qū)分開來。所以，有必要用待檢驗(yàn)的病毒接種黑猩猩來檢測(cè)對(duì)動(dòng)物的感染結(jié)果，但是卻難以實(shí)施。
因此，從公共衛(wèi)生角度而言，最為重要的是能夠發(fā)展特異、靈敏且可行的方案來診斷和篩查HCV攜帶者。一種解決方法可以是產(chǎn)生一個(gè)體外培養(yǎng)HCV的有效系統(tǒng)，從而使實(shí)現(xiàn)病毒繁殖成為可能，尤其是用于研究復(fù)制機(jī)制、檢測(cè)中和抗體或抗病毒試劑，同時(shí)用來發(fā)展生物材料、診斷檢測(cè)物和疫苗制劑。事實(shí)上，盡管HCV的完整序列自從1989年即可獲得(Q.L.Choo等，Science 244，359(1989))，有關(guān)HCV生活周期和復(fù)制模式的認(rèn)識(shí)卻由于缺乏適宜的體外培養(yǎng)系統(tǒng)而受到阻礙。Ito等人(J.Gen.Virol.771043-1054(1996))真正證實(shí)了在人類肝細(xì)胞原代培養(yǎng)中HCV保持復(fù)制，其中這些細(xì)胞來自攜帶HCV、緩慢起病和傳遞感染的病人，但是關(guān)于病毒的繁殖(長(zhǎng)期培養(yǎng)的不確定性)的問題仍然存在，而且所發(fā)展的系統(tǒng)由于費(fèi)力且需要人類肝臟供應(yīng)而受到限制。另外，關(guān)于HCV的向性至今尚未形成普遍認(rèn)可，而且，并非該病毒的所有細(xì)胞受體均得到鑒定。
在HCV感染者血漿中，發(fā)現(xiàn)含有病毒RNA的顆粒密度具有很強(qiáng)的異質(zhì)性。含有病毒RNA的顆粒的密度異質(zhì)性歸結(jié)于這些顆粒與不同比例的脂蛋白結(jié)合(Thomsen等，1993，Med.Microbiol.Immunol.182639)。在本發(fā)明申請(qǐng)的描述中，發(fā)明者將這些雜合顆粒稱為L(zhǎng)VPs(脂-病毒-顆粒)。每個(gè)患者中各種形式顆粒的密度梯度分布均有不同?，F(xiàn)有的對(duì)低密度顆粒的分析顯示，其密度包括LDLs(低密度脂蛋白)和VLDLs(極低密度脂蛋白)的密度。
含有病毒RNA的LVPs的性質(zhì)現(xiàn)在尚無精確的認(rèn)識(shí)。
專利申請(qǐng)WO 01/09289描述了一種使用具有內(nèi)吞途徑的細(xì)胞對(duì)病毒(例如HCV)進(jìn)行體外培養(yǎng)的方法，病毒來自感染者血清或血漿LVPs的至少一個(gè)級(jí)分，細(xì)胞的內(nèi)吞途徑依賴至少一種脂蛋白受體，且可以被激活劑調(diào)節(jié)。此方法尤其致力于促進(jìn)級(jí)分在培養(yǎng)基中進(jìn)入細(xì)胞。然而，病毒復(fù)制仍然受限，因而必須優(yōu)化。
專利申請(qǐng)WO 02/10353描述了一種與已知數(shù)據(jù)相反(Hijikata等，1993，J.Virol.，1953-1958)的由結(jié)合人免疫球蛋白的LVPs組成的復(fù)合物，密度小于或等于1.063g/ml，主要含有HCV病毒RNA。事實(shí)上，Hijikata等顯示，當(dāng)顆粒密度小于1.06g/ml時(shí)，對(duì)黑猩猩具有高度傳染性，因此這種類型的低密度顆粒中不可能含有密度很大的人免疫球蛋白。這些復(fù)合物組成了具有很強(qiáng)的感染性的HCV病毒的一種特殊形式。
在那個(gè)專利申請(qǐng)中同樣描述了一種由LVP/免疫球蛋白復(fù)合體體外培養(yǎng)HCV的方法，該方法中使用的細(xì)胞其表面至少有一種類型的免疫球蛋白Fc片段受體、或具有免疫球蛋白結(jié)合能力的一種受體。此方法再次促進(jìn)了復(fù)合物在培養(yǎng)基中進(jìn)入細(xì)胞，但是卻不允許病毒的大量繁殖。
現(xiàn)在，本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了一種全新的HCV體外培養(yǎng)方法，可以解決上述缺點(diǎn)，即，使用兼具促成含有HCV病毒RNA的顆粒進(jìn)入和促進(jìn)復(fù)制、繁殖能力的細(xì)胞。
事實(shí)上，本發(fā)明者令人驚訝的證實(shí)了稱為L(zhǎng)VPs的含有HCV RNA的顆粒-是完整的球狀單位顆粒；因此它們并不是像現(xiàn)有技術(shù)所提示的結(jié)合到正常脂蛋白上的病毒體團(tuán)塊，-含有載脂蛋白B和載脂蛋白E以及甘油三酯它們因此具有脂蛋白結(jié)構(gòu)，尤其是VLDL或乳糜微粒的結(jié)構(gòu)類型，和-含有病毒包膜和RNA它們因此有別于通常發(fā)現(xiàn)于人類的脂蛋白，并組成病毒的非常規(guī)形式。
由于LVPs是雜合顆粒，即含有病毒組件的脂蛋白，因此使用能夠合成脂蛋白的細(xì)胞可以出乎意料的促進(jìn)復(fù)制。
因此，本發(fā)明的主題為HCV的體外培養(yǎng)方法，包括步驟有在促進(jìn)脂蛋白合成和分泌的適宜的培養(yǎng)基中，將含有丙型肝炎病毒RNA的顆粒與能夠合成并且分泌脂蛋白的細(xì)胞接觸，以及收集由此得到的病毒。
詞語“含有HCV RNA的顆?！币鉃椴《绢w粒，尤其是諸如LVP/免疫球蛋白復(fù)合物形式，或出現(xiàn)在HCV檢測(cè)陽性并且含有這樣顆粒的形式的患者血清或血液中，以及含有病毒RNA的接種物，無論上述接種物中病毒RNA的制備模式如何。
LVP/免疫球蛋白復(fù)合物以及從HCV感染者血清或血漿樣品中純化該復(fù)合物的方法已經(jīng)在專利申請(qǐng)WO 02/10353中描述。
然而，那個(gè)文件中既沒有描述也沒有提示脂蛋白類型中這些LVPs的獨(dú)特性質(zhì)，即它們是否具有甘油三酯、載脂蛋白B以及可選的載脂蛋白E。
載脂蛋白B是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合的人類蛋白，它引發(fā)VLDLs組裝，在微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白出現(xiàn)時(shí)啟動(dòng)甘油三酯的轉(zhuǎn)入，還引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)VLDLs的組裝。該載脂蛋白具有兩種形式，apo B 100和apo B 48，在肝臟和腸內(nèi)合成。
載脂蛋白E可以被許多細(xì)胞合成，尤其是肝細(xì)胞。而且，它可以在血流中被VLDLs獲得。
本發(fā)明方法中使用的細(xì)胞是具有合成和分泌脂蛋白能力的所有細(xì)胞。
這些細(xì)胞既可以是原代細(xì)胞也可以是細(xì)胞系。
術(shù)語“細(xì)胞系”指建立的自發(fā)或人工永生化細(xì)胞系。在實(shí)踐中，為了培養(yǎng)感興趣的病毒，需要在培養(yǎng)基中易于維持的允許細(xì)胞(permissivecells)。因此，細(xì)胞株優(yōu)選是已經(jīng)建立的或者通過各種方法永生化的細(xì)胞系。這可以通過下列進(jìn)行(i)通過將允許細(xì)胞與具有相同性質(zhì)的腫瘤化允許細(xì)胞共培養(yǎng)，建立穩(wěn)定、確立的持續(xù)細(xì)胞系，所述腫瘤化允許細(xì)胞可以無限繁殖并保證病毒在培養(yǎng)基中繁殖，病毒接種發(fā)生在培養(yǎng)基中，(ii)使用病毒感染的原代細(xì)胞，接著與腫瘤化允許細(xì)胞共培養(yǎng)，該腫瘤化允許細(xì)胞保證了病毒在由此建立的細(xì)胞系培養(yǎng)物中的繁殖，(iii)用病毒感染細(xì)胞系，例如使用Epstein-Barr病毒感染永生化B淋巴細(xì)胞系，或(iv)修飾端粒酶活性。
詞語“本發(fā)明中使用的具有合成和分泌脂蛋白能力的細(xì)胞”特別是指自發(fā)具有這種能力的細(xì)胞，以及在促進(jìn)細(xì)胞分化或再分化的培養(yǎng)基質(zhì)中經(jīng)誘導(dǎo)、或者轉(zhuǎn)染合成載脂蛋白B和微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白MTP基因后獲得這種能力的細(xì)胞。
適于本發(fā)明目的、具有合成和分泌脂蛋白能力的細(xì)胞的實(shí)例有腸細(xì)胞型的腸上皮細(xì)胞、腦細(xì)胞和肝臟細(xì)胞。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所用的細(xì)胞是能在促進(jìn)該細(xì)胞分化或再分化的培養(yǎng)基中經(jīng)誘導(dǎo)而合成和分泌脂蛋白的細(xì)胞。
事實(shí)上，一些細(xì)胞(例如肝細(xì)胞)喪失了產(chǎn)生脂蛋白的能力，或者其他細(xì)胞(例如腸上皮細(xì)胞)此能力可以增強(qiáng)。為了克服這些障礙，可以將這些細(xì)胞與適宜的、促進(jìn)分化或再分化的培養(yǎng)基接觸，來誘導(dǎo)細(xì)胞的分化或再分化。
根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方案，適用于本發(fā)明目的的細(xì)胞是腸上皮細(xì)胞，特別是Caco-2細(xì)胞(Van Greevenbroeck，M.M.J.等，2000，Atherosclerosis，25-31)。
為了提高其合成和分泌脂蛋白的能力，可以在包被膠原或者置于半透膜之下的培養(yǎng)皿中，將腸上皮細(xì)胞(例如Caco-2)在添加10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中預(yù)先培養(yǎng)3周。
肝臟細(xì)胞可以是肝細(xì)胞(Moshage，H.等，1992，Journal ofHepatology，15，404-413)和肝癌，例如Hep G2細(xì)胞(Gherardi，E，等，1992，Journal of Cell Science，103，531-539)。
根據(jù)另一個(gè)特定的實(shí)施方案，本發(fā)明方法中使用的細(xì)胞是肝癌細(xì)胞。
然而，在此例中，這些細(xì)胞可以通過與改良的DMEM培養(yǎng)基接觸(即含有至少一種誘導(dǎo)脂蛋白合成的試劑)，來提高其合成和分泌脂蛋白的能力。這些細(xì)胞優(yōu)選是Hep G2細(xì)胞。
至于誘導(dǎo)脂蛋白合成的試劑，可以以各種脂類為例，例如脂肪酸，優(yōu)選C18或C20脂肪酸，例如油酸(Luchoomun，J.等，1999，The Journalof Biological Chemistry，Vol 274(28)，19565-19572))，和磷脂(例如溶血磷脂酰膽堿(Zhou，Z.，1998，Biochimica et Biophysica Acta，1391，13-24))。
在肝癌細(xì)胞再分化培養(yǎng)基中使用油酸組成本發(fā)明一個(gè)特定的實(shí)施方案。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，除DMEM(Gibco BRL)和誘導(dǎo)脂蛋白合成的試劑之外，改良DMEM培養(yǎng)基還由1％HEPES(Gibco)、1％谷氨酰胺(Gibco)、0.25mg/ml慶大霉素(Gibco)、1.5％Ultroser-G(Gibco)、5×10-6M毛喉素(ICN)、1.6×10-7M PMA(4-α-佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)(Sigma)、5.6IU/ml醋酸維生素A(Sigma)、0.5×10-3M丁酸鈉(Sigma)、10-2M niacidamide(ICN)、2×10-6g/mlPolybrene(Sigma)、2.9×10-8M亞硒酸鈉(ICN)和1×10-9M三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽(ICN)。
本發(fā)明方法中使用的其他類型的細(xì)胞由轉(zhuǎn)染基因后獲得的細(xì)胞組成，其中轉(zhuǎn)染的基因合成載脂蛋白apo B，可選的apo E和微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。這些細(xì)胞可以以轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞系為例，該細(xì)胞系見D.G.Gretch等在Journal of Biological Biochemistry，1998，Vol 271(15)，8682-8691中的描述。
當(dāng)與具有合成和分泌脂蛋白能力的細(xì)胞接觸后，含有HCV RNA的顆粒既可以經(jīng)過上述細(xì)胞的LDL受體類型中的脂蛋白受體(如以LVPs為例的情況)進(jìn)入這些細(xì)胞、也可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)經(jīng)轉(zhuǎn)染內(nèi)化(如以病毒RNA制劑為例的情況)而進(jìn)入細(xì)胞。
本發(fā)明方法中因此使用促進(jìn)脂蛋白合成和分泌的培養(yǎng)基，所述脂蛋白優(yōu)選為VLDL或乳糜微粒類型。
選用的適宜的培養(yǎng)基是改良的DMEM，其內(nèi)添加了在培養(yǎng)中促進(jìn)細(xì)胞代謝的試劑，還有至少一種誘導(dǎo)脂蛋白合成的試劑。
促進(jìn)細(xì)胞代謝的試劑，可以以地塞米松和胰島素為例。
優(yōu)選的改良DMEM培養(yǎng)基如上文所定義，并且添加地塞米松和胰島素。
誘導(dǎo)脂蛋白合成的試劑例如有各種脂類，比如脂肪酸(優(yōu)選C18或C20脂肪酸，例如油酸)、磷脂(例如溶血磷脂酰膽堿)，還有22-羥-膽固醇或25-羥-膽固醇。
使用油酸誘導(dǎo)脂蛋白合成(可選地與22-羥-膽固醇或25-羥-膽固醇聯(lián)合使用)組成本發(fā)明另一個(gè)特定的實(shí)施方案。
因此，使用本發(fā)明方法培養(yǎng)的病毒可以通過諸如離心(例如密度梯度離心)、使用抗apo B和/或apo E抗體的免疫沉淀等各種方法收獲。
本發(fā)明還涉及了至少包括根據(jù)本發(fā)明方法獲得的病毒顆?；蚱浣M分為抗原來源的診斷組合物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠根據(jù)使用的診斷技術(shù)確定所使用的病毒顆粒的數(shù)量。
本發(fā)明還涉及用來篩選和/或選擇至少一種抗病毒分子的方法，包括步驟在本發(fā)明培養(yǎng)方法過程中，將上述抗病毒分子與培養(yǎng)基接觸。
對(duì)抗病毒分子的選擇，通過廣為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)完成，例如細(xì)胞內(nèi)病毒RNA數(shù)量的減少、和/或在存在不同濃度的各種抑制劑時(shí)分泌到上清中的感染性病毒顆粒數(shù)量的減少。
這些抑制劑可以是核苷酸或核苷類似物，或者是病毒蛋白酶的抑制劑或干擾其他病毒蛋白質(zhì)功能的別的分子的抑制劑。
然而，本發(fā)明還開辟了其他的治療前景，使開發(fā)能定性和/或定量影響HCV體內(nèi)復(fù)制和增殖的治療組合物成為可能，該組合物的特征在于，它包含能夠調(diào)節(jié)、壓制或抑制脂蛋白合成的試劑(例如微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑)以及其他物質(zhì)。
詞語“能夠調(diào)節(jié)、壓制或抑制脂蛋白合成的試劑”意指任何可能分別控制、降低或抑制HCV體內(nèi)增殖和復(fù)制的分子。
這些試劑可以從經(jīng)驗(yàn)證對(duì)脂類代謝具有藥理學(xué)活性的分子文庫中篩查而選擇。
能夠抑制脂蛋白合成的試劑，可以以微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑為例。
通過下面給出的用作非限制性說明的實(shí)施例，以及附加的

圖1至圖3，本發(fā)明將得到更加全面的理解。
圖1描繪的圖形，顯示培養(yǎng)條件(添加油酸的改良DMEM培養(yǎng)基與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基)對(duì)Hep G2細(xì)胞分泌HCV病毒顆粒的影響，HCV病毒顆粒的分泌通過對(duì)培養(yǎng)上清中病毒RNA定量來評(píng)價(jià)，并且是時(shí)間的函數(shù)；圖2描繪的圖形，顯示在改良DMEM培養(yǎng)基中添加油酸對(duì)病毒顆粒的分泌的影響，病毒顆粒的分泌通過對(duì)培養(yǎng)上清中HCV RNA定量來評(píng)價(jià)，并且是時(shí)間的函數(shù)；圖3描繪的圖形，顯示由Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)3周分化后產(chǎn)生的HCV病毒，上述產(chǎn)物通過培養(yǎng)上清中病毒RNA的數(shù)量來證明，并且是時(shí)間的函數(shù)。
實(shí)施例1LVPs的表征1.1 LVPs完整球狀形式的證實(shí)來自丙型肝炎病毒檢測(cè)陽性的病人血清中的LVPs按照專利申請(qǐng)WO02/10353的說明進(jìn)行純化。
純化的LVPs以及去除LVPs的低密度(LDL)級(jí)分以PBS稀釋，在200目的銅網(wǎng)上形成樣品浮滴后，其中該銅網(wǎng)在室溫下已用Formvar支持膜(Electron Microscopy Science，PA)包被3分鐘，在以NaOH緩沖的pH7.2的4％(質(zhì)量/體積)光鎢酸介質(zhì)中漂洗染色3分鐘，干燥后使用電子顯微鏡(JEOL device，Centre Commun d’Imagerie deLaennec，Lyon，F(xiàn)rance)觀察。
與正常LDL一樣，LDL級(jí)分由具有同質(zhì)球狀結(jié)構(gòu)、平均直徑為25nm的顆粒組成。
另一方面，純化的LVPs為平均半徑100nm的異常巨大的球狀結(jié)構(gòu)。
1.2檢測(cè)LVP組成a)測(cè)定LVPs脂質(zhì)濃度按照生產(chǎn)廠商介紹，使用膽固醇RTU、磷脂酶促PAP 150和甘油三酯酶促PAP 150試劑盒(bioMérieux，Marcy l’Etoile，F(xiàn)rance)以及建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)總膽固醇、磷脂和甘油三酯濃度進(jìn)行測(cè)定。
b)測(cè)定LVPs中apo B濃度使用ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定純化的LVPs中載脂蛋白apo B的濃度。為進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)，將96孔平底ELISA板(Maxisorb；Nunc)用抗人apo B單克隆抗體(5ul/ml；clone 1609；Biodesign，Saco，Maine)的PBS(磷酸鹽緩沖液)100ul包被。將板置于4℃過夜，然后用2％BSA(牛血清白蛋白)封閉反應(yīng)。
首先在添加10ug/ml人IgG的PBS-0.2％BSA混合液中，將樣品在室溫下孵育30分鐘，然后按照100ul/孔的比例加到板上。
經(jīng)過37℃孵育2小時(shí)并使用PBS-0.05％Tween 20溶液清洗后，按照100ul/孔的比例，加入含有綴合過氧化酶的山羊抗人apo B抗體(1.6μg/ml；Biodesign)的PBS-0.2％BSA混合液，將板于37℃孵育90分鐘。
將板清洗后，按照150ul/孔的比例加入鄰-苯二胺(Sigma)。反應(yīng)可以進(jìn)行10分鐘，在490nm讀取結(jié)果。
c)結(jié)果結(jié)果按照甘油三酯/膽固醇(TG/Chol)和甘油三酯/apo B(TG/apo B)比值在下表中給出。此表同樣包括了患者正常脂蛋白(即提取LVPs后獲得的脂蛋白)的同種比值，以作比較。
表
ap≤0.04bp≤0.01在密度不同的兩個(gè)級(jí)分(即低密度和極低密度)中發(fā)現(xiàn)的LVPs比同種級(jí)分中正常脂蛋白含有更多的甘油三酯(基于每分子apo B計(jì)算)。
這些數(shù)據(jù)證明-LVPs的確含有脂質(zhì)，-LVPs的脂質(zhì)濃度與正常脂蛋白不同，因此排除了任何污染；以及-LVPs含有apo B。
1.3存在載脂蛋白B和E按照如下方法封閉PLC細(xì)胞apo B和apo E受體結(jié)合位點(diǎn)后，阻止了LVPs進(jìn)入PLC細(xì)胞，這證實(shí)apo B和apo E的存在將5×105PLC/PFR/5人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系細(xì)胞(ATCC CRL 8024)(Alexander細(xì)胞)(人肝細(xì)胞瘤)在96孔板內(nèi)，在添加10％胎牛血清(Biowhittaker，Emerainville，F(xiàn)rance)、2mM HEPES(Gibco/BRL)、1％非必需氨基酸(Gibco/BRL)和50IU青霉素/鏈霉素(Gibco/BRL)的DMEM(Gibco，BRL)/ml培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24小時(shí)。
首先，使用抗apo B受體結(jié)合位點(diǎn)的單克隆抗體(4G3和5E11；OttawaHeart Institute Research Corporation，Ottawa，Ontario Canada)封閉apo B受體結(jié)合位點(diǎn)，然后用單克隆抗體1D7(Ottawa HeartInstitute Research Corporation)封閉apo E受體結(jié)合位點(diǎn)。PLC細(xì)胞用PBS洗滌3次后，與純化的LVPs孵育3小時(shí)。細(xì)胞經(jīng)洗滌后，使用Rneasy試劑盒(Qiagen)中的裂解液350ul收獲，按照上文說明提取RNA。
通過封閉apo B和apo E識(shí)別位點(diǎn)阻斷了LVPs的識(shí)別，說明LVPs含有載脂蛋白，并證實(shí)了LVPs的脂蛋白結(jié)構(gòu)。
1.4 LVPs中存在由核心蛋白和病毒RNA組成的衣殼通過將LVPs在85％醚-15％丁醇溶液中孵育30分鐘，同時(shí)輕柔攪拌，將純化的LVPs去脂化，證實(shí)了衣殼的存在。按照上文1.1節(jié)中說明，使用電子顯微鏡(JEOL device，Centre Commun d’Imagerie de Laennec，Lyon，F(xiàn)rance)顯示衣殼的存在。
將上文所述去脂化的LVPs與抗-HCV核心蛋白單克隆抗體(19D9D6；Jolivet-Reynaud，C.P.，等，1998，J.Med.Virol.，56，300-309)和10nm-金標(biāo)記二抗接觸，在3％乙酸雙氧鈾中漂洗、負(fù)染進(jìn)行免疫檢測(cè)，如上所述用銅網(wǎng)觀察，從而通過Western印跡證實(shí)了HCV病毒核心蛋白的存在。
最后，使用QIAamp試劑盒(Qiagen S.A.Courtaboeuf，F(xiàn)rance)提取已純化并去脂化的LVPs，證實(shí)了病毒RNA的存在。
實(shí)施例2培養(yǎng)條件對(duì)Hep G2細(xì)胞產(chǎn)生HCV的影響首先，將Hep G2細(xì)胞在專利申請(qǐng)WO 01/09289中所述的由DMEM和10％胎牛血清組成的培養(yǎng)基(標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基)中培養(yǎng)或在改良DMEM培養(yǎng)基(即含有添加1％HEPES、1％谷氨酰胺、0.25mg/ml慶大霉素、1.5％Ultroser-G、5×10-6M毛喉素、1.6×10-7M PMA、5.6IU/ml醋酸維生素A、0.5×10-3M丁酸鈉、10-2M niacidamide、2×10-6g/mlPolybrene、2.9×10-8M亞硒酸鈉和1×10-9M三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽的DMEM)中培養(yǎng)。
按照150 000細(xì)胞/孔的比例，將細(xì)胞與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基或改良DMEM培養(yǎng)基接種于Falcon 24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24小時(shí)。
吸去培養(yǎng)基，在病毒存在下(按照500 000 HCV RNAs/孔的比例)，將細(xì)胞在添加0.2％BSA的DMEM中培養(yǎng)6小時(shí)。
細(xì)胞以PBS洗滌后，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基或改良培養(yǎng)基(如前文說明，但是還添加了hexamethasone、胰島素和含有0.15mM油酸的油酸-BSA混合物)中培養(yǎng)。
所有的培養(yǎng)都在含5％CO2的空氣及37℃下進(jìn)行。
然后從孔中取上清樣品(三份)，根據(jù)Komurian-Pradel，F(xiàn).在J.Virol.Methods，2001，95，111-119中說明的程序，使用RT-PCR對(duì)HCVRNA定量。
圖1中給出的結(jié)果(每毫升上清中的RNA拷貝數(shù)，其為時(shí)間的函數(shù))，菱形代表使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，正方形代表使用促進(jìn)脂蛋白合成和分泌的培養(yǎng)基。
此圖證明，使用具有分泌和合成脂蛋白能力的細(xì)胞、以及將細(xì)胞至于有利條件下，促進(jìn)了病毒的復(fù)制及分泌。
實(shí)施例3在培養(yǎng)基中加入脂質(zhì)對(duì)于促進(jìn)脂蛋白合成和分泌的重要性首先將Hep G2細(xì)胞于前文實(shí)施例2中所說明的改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，按照每孔150 000個(gè)細(xì)胞的比例加入Falcon 24孔培養(yǎng)板。
在病毒存在下(比例為每孔400 000 HCV RNAs)，將細(xì)胞在添加0.2％BSA的DMEM中單獨(dú)培養(yǎng)或與0.1μm25-羥-膽固醇共同培養(yǎng)6小時(shí)。
按照前文實(shí)施例2指示洗滌細(xì)胞，并在改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
細(xì)胞接種3天后，加入含有0.15mM油酸的油酸-BSA混合液。
收集上清，通過RT-PCR對(duì)HCV RNA進(jìn)行定量。
圖2給出了證明使用油酸的重要性的結(jié)果，菱形代表僅使用改良培養(yǎng)基，正方形代表使用添加了油酸和25-OH-膽固醇的改良培養(yǎng)基。
實(shí)施例4使用Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)病毒Caco-2細(xì)胞在24孔板內(nèi)的半透膜(Transwell，Costar)上，于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(添加10％胎牛血清的DMEM)中分化3周。
由此制備的細(xì)胞在比例為200 000HCV RNAs/孔的病毒顆粒中孵育6小時(shí)。
細(xì)胞經(jīng)洗滌后，在DMEM中培養(yǎng)，所述DMEM中添加了10％胎牛血清、以及含0.15mM油酸的油酸-?；悄懰帷?br> 取插入物上方的上清，通過RT-PCR對(duì)病毒RNA進(jìn)行定量。
圖3給出證明在促進(jìn)脂蛋白合成和分泌的培養(yǎng)基中使用腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)HCV病毒方法的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.丙型肝炎病毒體外培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟在促進(jìn)脂蛋白合成和分泌的適宜的培養(yǎng)基中，將含有丙型肝炎病毒RNA的顆粒與具有合成并且分泌脂蛋白能力的細(xì)胞接觸，以及收集由此得到的病毒。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，含有丙型肝炎病毒RNA的所述顆粒為L(zhǎng)VP脂-病毒-顆粒。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，具有合成和分泌脂蛋白能力的細(xì)胞選自自發(fā)具有該能力的細(xì)胞、以及在促進(jìn)細(xì)胞分化或再分化的培養(yǎng)基中經(jīng)誘導(dǎo)后獲得該能力或者轉(zhuǎn)染了合成載脂蛋白B和微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因后而獲得該能力的細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3的方法，其特征在于，使用的細(xì)胞為在促進(jìn)該細(xì)胞分化或再分化的培養(yǎng)基中經(jīng)誘導(dǎo)后獲得合成和分泌脂蛋白能力的細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述細(xì)胞為腸上皮細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其特征在于，所述細(xì)胞為Caco-2細(xì)胞。
7.權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的方法，其特征在于細(xì)胞用添加10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基預(yù)處理3周。
8.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述細(xì)胞為肝細(xì)胞癌細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的方法，其特征在于，所述肝細(xì)胞癌細(xì)胞為Hep G2細(xì)胞。
10.權(quán)利要求8和9中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，預(yù)先將所述細(xì)胞與含有誘導(dǎo)脂蛋白合成的試劑的改良DMEM培養(yǎng)基接觸。
11.權(quán)利要求10的方法，其特征在于，誘導(dǎo)脂蛋白合成的所述試劑為油酸。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，促進(jìn)該脂蛋白合成和分泌的所述培養(yǎng)基來源于改良的DMEM培養(yǎng)基，其中添加了促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞代謝的試劑以及至少一種誘導(dǎo)脂蛋白合成的試劑。
13.權(quán)利要求12的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括作為脂蛋白合成誘導(dǎo)試劑的油酸。
14.權(quán)利要求13的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基還含有作為另一脂蛋白合成誘導(dǎo)試劑的22-羥-膽固醇或25-羥-膽固醇。
15.用于篩選和/或選擇至少一種抗病毒分子的方法，其特征在于，它包括在權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的培養(yǎng)方法的過程中將所述抗病毒分子與培養(yǎng)基接觸這一步驟。
16.可以定性和/或定量影響HCV在體內(nèi)繁殖和復(fù)制的治療組合物，其特征在于，該組合物包括能夠調(diào)節(jié)、壓制或抑制脂蛋白合成的試劑以及其它物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種體外培養(yǎng)HCV病毒的方法，包括步驟在促進(jìn)脂蛋白合成和分泌的適宜的培養(yǎng)環(huán)境下，將含有丙型肝炎病毒RNA的顆粒與能夠合成并且分泌脂蛋白的細(xì)胞接觸，以及收集由此得到的病毒。本發(fā)明具有診斷和治療應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N7/02GK1662646SQ03814092
公開日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2003年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月18日
發(fā)明者P·安德烈, F·克姆里安-普拉德爾, V·勒特奧, G·帕蘭赫斯-巴卡拉 申請(qǐng)人:拜奧默里克斯公司, 國家健康醫(yī)學(xué)研究所