Pg-rca檢測(cè)ev71的引物組及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測(cè)腸道病毒71型（EV71)的引物組及檢測(cè)方法，特別涉及PG-RCA檢 測(cè)EV71的引物組及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸道病毒71型（enterovirus71，EV71)是小RNA病毒科、腸道病毒屬成員，是引 起嬰幼兒手足口?。╤and-foot-mouthdisease，HFMD)的主要病原體，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有極 高的感染性，重癥患者比例明顯高于其他腸道病毒，在世界范圍內(nèi)已引起10余次的爆發(fā)和 流行。
[0003] 常規(guī)的EV71診斷技術(shù)包括免疫學(xué)方法、病毒分離培養(yǎng)、PCR方法等，但大多存在難 以早期診斷或敏感性或特異性低等缺陷。
[0004] 腸道病毒的傳統(tǒng)檢測(cè)方法為先將病毒分離培養(yǎng)，然后進(jìn)行血清中和試驗(yàn)定型分 類，此法繁瑣、耗時(shí)、費(fèi)力，雖然多數(shù)培養(yǎng)結(jié)果可在1周內(nèi)得到，但中和試驗(yàn)卻十分費(fèi)時(shí)、昂 貴，甚至有時(shí)無法定型。
[0005] PCR方法具有快速、敏感性強(qiáng)、特異性高等諸多優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用于腸道病毒的檢測(cè)，但 常規(guī)檢測(cè)EV71RNA的RT-PCR方法需要精密的實(shí)時(shí)熒光PCR儀，對(duì)操作分析人員技術(shù)要求 較高，且需逆轉(zhuǎn)錄及PCR兩個(gè)實(shí)驗(yàn)才能完成檢測(cè)，因而使其不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及基層 普及應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種PG-RCA檢測(cè)EV71的引物組及檢測(cè)方法，適用于現(xiàn)場(chǎng)快 速檢測(cè)及基層普及應(yīng)用，能夠快速、高效的檢測(cè)EV71。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種PG-RCA檢測(cè)EV71的引物 組，包括：
[0008] 引物模板T:
[0009] TGCTCAAGGTGTGTGAATGCTTTTTCATAATCTGAGGGCTCTGCTCACGCTATCTTTTT；
[0010] 引物P:GGTGCTGGTAGAGCGTGAGGATTATG;以及
[0011] 環(huán)狀探針CP前體：
[0012] GCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATo
[0013] 相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了應(yīng)用上述PG-RCA檢測(cè)EV71的引物組檢測(cè)EV71的方法， 包括以下步驟：
[0014] (1)提取待檢測(cè)樣品中的病毒RNA;
[0015] (2) 0. 5yL的所述病毒RNA、引物模板T、引物P、1XVent(exo_)DNA聚合酶緩沖液 補(bǔ)足5yL，80°C變性3min，37°C退火；
[0016] (3)然后加入5yL的PG-RCA反應(yīng)體系，60°C恒溫?cái)U(kuò)增，監(jiān)測(cè)反應(yīng)熒光強(qiáng)度2~3小 時(shí)，得出檢測(cè)結(jié)果，其中，PG-RCA反應(yīng)體系包含：dNTP、環(huán)狀探針CP、0. 05UVent(ex〇-)DNA 聚合酶、1UNb.BsmI(切割酶的一種）、SYBRGreenI(染料）、lXVent(ex〇-)DNA聚合酶緩 沖液補(bǔ)足5yL。
[0017] 在一些實(shí)施方式中，在步驟（2)中，變性反應(yīng)前，引物模板T和引物P的終濃度為 lnM〇
[0018] 在一些實(shí)施方式中，在步驟（3)中，dNTP終濃度為0. 8mM，環(huán)狀探針CP終濃度為 15nM。
[0019] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明的引物模板T、引物P以及環(huán)狀探針CP根據(jù)EV71 VP1基因區(qū)保守序列設(shè)計(jì)，建立了三向連接構(gòu)造（Three-wayjunctionformation，3WJ) 組合引物介導(dǎo)的滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Primergeneration-rollingcircleamplification， PG-RCA)技術(shù)用于檢測(cè)EV71的方法，能檢測(cè)到amol(10_18mol)級(jí)的EV71合成RNA，檢測(cè)臨 床標(biāo)本時(shí)特異性強(qiáng)、敏感度好。
[0020] 本發(fā)明的檢測(cè)方法具備如下優(yōu)點(diǎn)：
[0021] 1、PG-RCA反應(yīng)前一次加完所有試劑，操作簡(jiǎn)單步驟少；
[0022] 2、本檢測(cè)方法只需一個(gè)恒溫設(shè)備和一個(gè)信號(hào)收集設(shè)備，在實(shí)驗(yàn)中僅利用了實(shí)時(shí)熒 光PCR儀的恒溫及收集熒光的功能，使檢測(cè)操作簡(jiǎn)單；
[0023] 3、本檢測(cè)方法在檢測(cè)過程中不需打開試管蓋，擴(kuò)增的單鏈引物片段易降解，在很 大程度上降低PCR過程中的污染概率。
[0024] 因此，本檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、快速、高效，適合各個(gè)層面的衛(wèi)生醫(yī)療單位普及應(yīng)用。
【附圖說明】
[0025] 圖1為本發(fā)明的實(shí)施例1中15%聚丙烯酰胺凝膠電泳成像；
[0026] 圖2為本發(fā)明的實(shí)施例2中PG-RCA檢測(cè)EV71的方法的靈敏度測(cè)試結(jié)果圖；
[0027] 圖3為本發(fā)明的實(shí)施例2中PG-RCA檢測(cè)EV71的原理圖；
[0028] 圖4為本發(fā)明的實(shí)施例3中PG-RCA檢測(cè)EV71的方法檢測(cè)臨床樣本的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] (1)引物模板、引物及探針的設(shè)計(jì)。
[0032]在NCBI((NationalCenterforBiotechnologyInformation，是指美國(guó)國(guó)立生 物技術(shù)信息中心）搜索20個(gè)EV71VP1基因序列。對(duì)上述20條序列進(jìn)行比對(duì)，在其保守區(qū) 選取50堿基的保守序列作為靶序列，命名為RNA71，同時(shí)根據(jù)RNA71序列PrimerPremier 5軟件設(shè)計(jì)引物模板T、引物P以及環(huán)狀探針CP前體。RNA71、引物模板T、引物P序列見表 1〇
[0033] 表 1
[0034]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. PG-RCA檢測(cè)EV71的引物組，其特征在于，包括： 引物模板T : TGCTCAAGGTGTGTGAATGCTTTTTCATAATCTGAGGGCTCTGCTCACGCTATCTTTTT ； 引物 P:GGTGCTGGTAGAGCGTGAGGATTATG;以及 環(huán)狀探針CP : GCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATo
2. 應(yīng)用權(quán)利要求1所述PG-RCA檢測(cè)EV71的引物組檢測(cè)EV71的方法，其特征在于，包 括以下步驟： (1) 提取待檢測(cè)樣品中的病毒RNA ; (2) 0. 5 y L的所述病毒RNA、引物模板T、引物P、I X Vent (exo-) DNA聚合酶緩沖液補(bǔ)足 5yL，80°C變性 3min，37°C退火； (3)然后加入5yL的PG-RCA反應(yīng)體系，60°C恒溫?cái)U(kuò)增，監(jiān)測(cè)反應(yīng)熒光強(qiáng)度2~3小時(shí)， 得出檢測(cè)結(jié)果，其中，PG-RCA反應(yīng)體系包含：dNTP、環(huán)狀探針CP、0. 05UVent(ex〇-)DNA聚合 酶、IUNb.BsmI、SYBRGreenI、IXVent(exo_)DNA聚合酶緩沖液補(bǔ)足5yL0
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的PG-RCA檢測(cè)EV71的引物組檢測(cè)EV71的方法，其特征在于， 在步驟（2)中，變性反應(yīng)前，所述引物模板T和引物P的終濃度為InM。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的PG-RCA檢測(cè)EV71的引物組檢測(cè)EV71的方法，其特征在于， 在步驟（3)中，所述dNTP終濃度為0. 8mM，所述環(huán)狀探針CP終濃度為15nM。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種PG-RCA檢測(cè)EV71的引物組及檢測(cè)方法。引物模板T、引物P以及環(huán)狀探針CP根據(jù)EV71VP1基因區(qū)保守序列設(shè)計(jì)，建立了3WJ組合PG-RCA技術(shù)用于檢測(cè)EV71的方法，能檢測(cè)到amol(10-18mol)級(jí)的EV71合成RNA，檢測(cè)臨床標(biāo)本時(shí)特異性強(qiáng)、敏感度好。檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、快速、高效，適合各個(gè)層面的衛(wèi)生醫(yī)療單位普及應(yīng)用。
【IPC分類】C12Q1-70, C12Q1-68, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104846123
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510247029
【發(fā)明人】張宏萍, 陸仁飛
【申請(qǐng)人】張宏萍
【公開日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年5月14日