專利名稱：預(yù)防動脈硬化的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可通過有機(jī)溶劑萃取，從脫脂后的植物種子中獲得的預(yù)防動脈硬化的組合物，以及含有該預(yù)防動脈硬化的組合物的食品和藥物組合物。
背景技術(shù)：
近年來，隨著生活方式的歐化，心絞痛、間歇性跛行、心肌梗塞、腦梗塞等動脈硬化性疾病與癌并列，成為日本人死亡病因的首位。這些疾病一旦發(fā)病，非常難治愈，QQL(生活質(zhì)量)顯著降低，因此毋庸諱言，其預(yù)防、或?qū)ΣB(tài)發(fā)展的控制方案，對于社會來講是極為重要的。動脈硬化灶形成早期，LDL(低密度脂蛋白)的氧化起了重要的作用，這是幾乎一致的結(jié)論，因此不僅要將血液中的膽固醇水平控制在適當(dāng)?shù)姆秶?，還要控制氧化LDL的生成，其重要性在最近得到了人們的認(rèn)識。已知食品、特別是來自植物的食品中含有豐富的抗氧化物質(zhì)，有人推斷綠茶、紅葡萄酒中含有的抗氧化物質(zhì)被攝取到LDL中(或其附近)，通過消除自由基，應(yīng)可以防止氧化LDL的生成(Fuhrman等人、Am.J.Clin.Nutr.，61549-54頁，1995)。也有了關(guān)于主動攝取這些食品來抑制癌癥、心臟病的流行病學(xué)研究(Renaud等人、Lancet，3391523-26頁，1992)。
其中，有報告指出芝麻種子中的木酚素、葡萄種子中的多酚等來自特定種子的特定成分對實驗動物顯示抗動脈硬化作用(Kang等人、J.Nutr.，1291885-90頁，1999)(Yamakoshi等人、Atherosclerosis142139-49頁，1999)。但是，像這樣已明確植物種子成分在動物實驗水平具有抗動脈硬化性的例子還為數(shù)不多，目前的現(xiàn)狀是很多研究還停留于試管水平。例如日本特開平8-337536號公報中公開了焙烤植物種子，然后發(fā)酵，由其中萃取的抗活性氧作用劑。該技術(shù)雖然是利用植物種子作為原料，但需要背靠、發(fā)酵處理等操作，因此通用性低，并不是實用的方法。另外，也未明確表示抑制動脈硬化的效果。另外，Zhang等人(Chem.Pharm.Bull.，451910-14頁，1997)給出了通過各種溶劑的分配操作，由紅花油的油粕中萃取的化合物組，并指出其中有具有體外抗氧化活性的物質(zhì)。但是，目前并不明確這些具有抗氧化活性的化合物是否對于預(yù)防動脈硬化有效?？紤]到目前已知體外的抗氧化活性未必與生物體內(nèi)的抗動脈硬化活性有關(guān)(Fruebis等人、J.Lipid Res.，382455-64頁，1997；Fruebis等人、Atherosclerosis 117217-24頁，1995；Mundy等人、Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.，18114-19頁，1998；Wagberg等人、J.Pharmacol.Exp.Ther.，29976-82頁，2001)，則至少需要在實驗動物水平驗證植物種子中的抗氧化物質(zhì)是否具有抗動脈硬化性。
發(fā)明說明本發(fā)明的目的在于提供對預(yù)防生活方式病之一的動脈硬化有效的組合物、以及含有該組合物的食品和藥物組合物。
本發(fā)明人為了實現(xiàn)上述目的，進(jìn)行了深入地研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過有機(jī)溶劑萃取，從脫脂后的植物種子中萃取的組合物不僅具有體外抗氧化作用，在實驗動物中有動脈硬化預(yù)防作用，從而根據(jù)該認(rèn)識完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供以下內(nèi)容。即，(1)預(yù)防動脈硬化組合物，該組合物可通過有機(jī)溶劑萃取，從脫脂后的植物種子中得到。
(2)上述(1)的組合物，其中植物種子為紅花或油菜的種子。
(3)上述(1)或(2)的組合物，其中有機(jī)溶劑萃取包括用低級醇從脫脂后的植物種子中萃取。
(4)上述(3)的組合物，其中有機(jī)溶劑萃取包括用低級醇萃取后，用乙酸酯萃取。
(5)上述(3)或(4)的組合物，其中有機(jī)溶劑萃取包括用低級醇萃取后，餾去低級醇，加入水，用非極性溶劑洗滌水相。
(6)上述(3)-(5)中任一項的組合物，其中低級醇為乙醇或甲醇。
(7)上述(4)-(6)中任一項的組合物，其中乙酸酯為乙酸乙酯、乙酸甲酯或乙酸丙酯。
(8)上述(5)-(7)中任一項的組合物，其中非極性溶劑為正己烷。
(9)食品，該食品含有上述(1)-(8)中任一項的預(yù)防動脈硬化的組合物。
(10)藥物組合物，該組合物含有上述(1)-(8)中任一項的預(yù)防動脈硬化的組合物。


圖1是表示實施例1中，各試樣影響LDL的被氧化性的效果圖。
圖2是表示實施例2中，紅花粕萃取的組合物、油菜粕萃取的組合物具有抑制apoE(-/-)小鼠[動脈硬化模型小鼠](給予第5周、14周齡)主動脈的動脈硬化的效果的照片，(a)表示對照組，(b)表示紅花組，(c)表示油菜組。
圖3是圖2的概略圖。(a-1)是圖2(a)的概略圖，(b-1)是圖2(b)的概略圖，(c-1)是圖2(c)的概略圖。圖2原本是彩色照片，染成紅色的部分是粥樣斑。為了明確圖2染成紅色的部分，將圖2的照片制成圖，圖3是將染成紅色的部分涂成黑色表示的概略圖。
圖4是表示添加V70而誘導(dǎo)出的LDL氧化曲線(過氧化脂質(zhì)生成曲線)的圖。
圖5是表示實施例3中，給予各試樣第15周時apoE基因敲除小鼠(21周齡、雄性)的主動脈起始部分病變面積的圖。圖中，SFM表示紅花粕萃取的組合物，CS表示對香豆酰5-羥色胺(p-coumaroylserotonin)，F(xiàn)S表示阿魏酰5-羥色胺(feruloylserotonin)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明中使用的植物種子可以是任何植物的種子，例如有紅花、油菜、大豆等種子，優(yōu)選紅花或油菜的種子。本發(fā)明中，植物種子可以是構(gòu)成植物種子的全部或其部分，例如可以使用取出種皮、胚乳、胚芽等的種子，也可以是它們的混合物。
本發(fā)明中，使用脫脂后的植物種子，即脫脂物(粕)作為原料。植物種子的脫脂物可以通過公知的方法將植物種子脫脂而得到，例如可將種子壓榨萃取，或向種子的破碎物中加入正己烷等進(jìn)行萃取，然后由萃取體系中取出固體部分，將該固體部分干燥得到。脫脂程度通常為6成或以上，優(yōu)選8成或以上。
下面對本說明書中所使用的“有機(jī)溶劑萃取”進(jìn)行說明。本發(fā)明中使用的有機(jī)溶劑萃取中，作為第1階段——從脫脂后的種子中進(jìn)行萃取的階段中所使用的溶劑，例如有低級醇(也包括含水低級醇)、丙酮(也包括含水丙酮)、乙腈(也包括含水乙腈)以及它們的混合溶劑等，但并不限于這些。優(yōu)選低級醇。低級醇例如有碳原子數(shù)1-4的醇，具體的例子有甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇等，但并不限于這些。低級醇優(yōu)選乙醇或甲醇(包括含水乙醇或含水甲醇)。用這些溶劑萃取出的組合物，以該純度即可作為本發(fā)明的組合物使用，但也可以進(jìn)一步提高純度(可以純化)。
進(jìn)一步提高純度(純化)的一個例子如下所述，但并不限于此。餾去上述第1階段的溶劑萃取物中的有機(jī)溶劑(特別是減壓餾去)，向得到的萃取物中加入水，使其懸浮，將該懸浮液(水相)用非極性溶劑例如正己烷、正庚烷、正辛烷等、優(yōu)選正己烷洗滌，將洗滌后的水層用可分成兩層并可萃取目標(biāo)組合物的溶劑、例如乙酸酯、正丁醇等，優(yōu)選乙酸酯，特別優(yōu)選乙酸乙酯、乙酸甲酯或乙酸丙酯萃取。接著，將萃取液用飽和食鹽水等洗滌，得到有機(jī)層。用乙酸酯萃取時，將該有機(jī)層用例如無水硫酸鎂等進(jìn)行脫水，接著減壓濃縮，得到固形物(組合物)。在以上的任一階段均可停止純化，可以省略任一步驟，也可以加一些改變，還可以更進(jìn)一步純化。也可以改變上述溶液的種類等來使用多級萃取法、逆流分配法等。
由上述方法得到的本發(fā)明的組合物作為食品、藥物(動脈硬化預(yù)防劑等)使用時，當(dāng)組合物存在于對生理有害的溶劑中時，可使用干燥物、或使該干燥物溶解、混懸或乳化于生理上可接受的溶劑中形成的物質(zhì)。組合物的形式包括水性溶液等液體、減壓濃縮并干燥固化的固體、凍干品等固形物。
本發(fā)明的預(yù)防動脈硬化的組合物可在體外抑制人血漿中的LDL(低密度脂蛋白)的氧化。特別是由紅花和油菜的種子得到的組合物尤其強(qiáng)烈抑制LDL的氧化。特別值得一提的是本發(fā)明的該組合物在體內(nèi)抑制形成于小鼠血管內(nèi)壁上的粥樣斑(動脈粥樣斑)的形成，在實驗動物中顯示抗動脈硬化作用。以上表明，本發(fā)明的該組合物作為動脈硬化預(yù)防劑等藥物、預(yù)防動脈硬化的食品有效。
本發(fā)明的組合物預(yù)防動脈硬化的結(jié)果是對于預(yù)防起因于動脈硬化的疾病例如心絞痛、心肌梗塞、間歇性跛行、腦梗塞等有效。
本發(fā)明的“食品”是指全部食品，除包括所謂的保健食品在內(nèi)的常規(guī)食品外，還包含日本厚生勞動省保健機(jī)能食品制度中規(guī)定的特定保健食品、營養(yǎng)機(jī)能食品，進(jìn)一步包含營養(yǎng)品。
可以使用本發(fā)明的上述組合物本身作為食品或藥物組合物。還可以使本發(fā)明的上述組合物含在各種食品例如調(diào)味汁、蛋黃醬等常規(guī)食品(包括所謂的保健食品)中。還可以將本發(fā)明的組合物與賦形劑(例如乳糖、蔗糖、淀粉等)、在不同情況下與香料、色素等一起，制成片劑、丸劑、顆粒、細(xì)粒、粉末、球劑、膠囊、溶液劑、乳液、混懸劑、糖漿劑和糖錠等制劑，作為特定保健用食品、營養(yǎng)機(jī)能食品等保健機(jī)能食品、營養(yǎng)品、藥物制劑(藥物組合物)(主要經(jīng)口服用)使用。
特別是作為藥物組合物使用時，可與醫(yī)藥上可接受的載體(也包括添加劑)一起制成制劑。如本領(lǐng)域人員公知的，醫(yī)藥上可接受的載體例如有賦形劑(例如乳糖、蔗糖、淀粉、D-甘露糖醇等)、粘合劑(例如纖維素、蔗糖、糊精、羥丙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等)、崩解劑(例如淀粉、羧甲基纖維素等)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂等)、表面活性劑(例如月桂基硫酸鈉等)、溶劑(例如水、食鹽水、大豆油等)、防腐劑(例如對羥基苯甲酸酯等)等，但并不限于這些。
本發(fā)明的預(yù)防動脈硬化的組合物的攝取量或給予量根據(jù)組合物的純度、服用對象的年齡、體重、健康狀態(tài)等而不同，作為預(yù)防動脈硬化用，通常為成人每天10mg-10g，優(yōu)選一天一次或分?jǐn)?shù)次攝取或服用100mg-10g。
本發(fā)明的組合物使用傳統(tǒng)的食用等的植物種子，特別是使用食用油原料紅花和油菜，因此毒性極低，幾乎未見副作用。
實施例以下例舉實施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實施例的限定。
實施例1(體外抗氧化性數(shù)據(jù))向100g榨油后的紅花粕中加入500ml 90％容量的乙醇水，在60℃的熱水浴中加熱攪拌3小時，然后過濾。對過濾后的固形部分進(jìn)行1次同樣的操作，合并得到的濾液，減壓濃縮，得到60ml濃縮液。向濃縮液中加入水，定量為200ml，使內(nèi)容物懸浮，然后用120ml的正己烷洗滌2次，用100ml乙酸乙酯萃取洗滌后的水層，共萃取2次。用飽和食鹽水洗滌乙酸乙酯萃取液，然后用無水硫酸鎂對乙酸乙酯層進(jìn)行脫水，過濾后減壓濃縮，得到1.16g固形物。同時對榨油后的油菜粕、大豆粕、大豆胚芽粕、大豆種皮也分別進(jìn)行同樣的處理，向1/10量的萃取物中加入1ml DMSO，溶解，以此作為試樣。
將由人志愿受試者取得的血漿(用KBr調(diào)節(jié)至密度＝1.21(g/ml))進(jìn)行非連續(xù)密度梯度離心(417,000xg，40分鐘，4℃)(OptimaTLX；Beckman Coulter)，用注射器采集LDL的條帶。測定LDL組分的蛋白質(zhì)含量(BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒；Pierce)，用磷酸緩沖液(PBS)稀釋，使終濃度為100μg/ml蛋白質(zhì)，向其中加入1/100量的上述試樣，然后添加自由基引發(fā)劑(V70；2，2’-偶氮二(4-甲氧基-2，4-二甲基戊腈))，使終濃度為1mM，立即對由過氧化脂質(zhì)中的共軛二烯結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的234nm的吸收監(jiān)測5小時(DU640；Beckman Coulter)。按照近藤等人(J.Nutr.Sci.Vitaminol.，43435-44頁，1997)的方法，由所得過氧化脂質(zhì)生成曲線計算滯后時間(log time)，以空白(對照)組(只加入溶劑)的值為100，得出各試樣的相對值，由此評價各試樣對LDL被氧化性的影響(圖1)?？梢娒糠N試樣對LDL被氧化性都有或多或少的抑制(即滯后時間延長)的傾向，其中油菜粕和紅花粕尤其強(qiáng)烈地抑制LDL的氧化。
上述試驗中，在與稀釋的人LDL混合之前的階段，各試樣的稀釋倍率為油菜粕、紅花粕稀釋200倍，其他稀釋50倍。這些粕的萃取物為液體狀態(tài)，因此換算成萃取前的粕，則油菜和紅花粕的萃取物(稀釋200倍)分別換算成油菜粕和紅花粕為0.05g/ml，大豆粕、大豆種皮、大豆胚芽粕(稀釋50倍)分別換算成大豆粕、大豆種皮、大豆胚芽粕換算為0.2g/ml。即，油菜粕和紅花粕的萃取物以更低的濃度顯示強(qiáng)烈的抗氧化活性。
實施例2(體內(nèi)的動脈硬化預(yù)防效果)油菜粕和紅花粕的萃取物的制備如下進(jìn)行。
向600g榨油后的油菜粕中加入3000ml 90％容量的乙醇水，在60℃的熱水浴中加熱攪拌3小時，然后過濾。對過濾后的固形部分進(jìn)行1次同樣的操作，合并得到的濾液，減壓濃縮，得到500ml濃縮液。向濃縮液中加入水，定量為1000ml，使內(nèi)容物懸浮，然后用500ml的正己烷洗滌2次，用500ml乙酸乙酯萃取洗滌后的水層，共萃取2次。用無水硫酸鎂對乙酸乙酯層進(jìn)行脫水，過濾后減壓濃縮，得到12.5g固體物質(zhì)。
對600g榨油后的紅花粕進(jìn)行于上述同樣的操作，得到10.1g萃取物。
將9周齡的雄性apoE基因敲除小鼠(apoE(-/-)；購自JacksonLaboratory)分成對照/油菜(油菜粕萃取物給予組)/紅花(紅花粕萃取物給予組)3組，每組9只，使每組分別自由攝取表l所示組成的餌料5周。第2周(n＝6)和第5周(n＝3)處死小鼠，摘出由主動脈根部至股動脈分支部位的主動脈，將血管內(nèi)壁部分形成的經(jīng)蘇丹IV染色的粥樣斑(動脈粥樣斑)的面積與對照組進(jìn)行比較。與對照相比，給予2周的油菜組、紅花組中，顯示了動脈粥樣斑的形成得到抑制的傾向。之后延長給予3周，在各組之間進(jìn)行比較，上述傾向更加強(qiáng)烈(動脈粥樣斑面積紅花＜油菜＜對照)，顯示這些油料植物粕的萃取物具有抑制動脈硬化早期病變的形成的效果(圖2和圖3)。
上述試驗中，由處死的小鼠的腹腔主靜脈采血。用fractionator(DGF-U；日立)通過非連續(xù)密度梯度離心(417,000xg，1小時，4℃)(OptimaTLX；Beckman Coulter)，由按照常規(guī)方法分離的血漿(用KBr調(diào)節(jié)至密度為1.30(g/ml))中分離出脂蛋白組分。測定通過電泳(Multigel-lipo；第一化學(xué))確認(rèn)的各組的VLDL(超低密度脂蛋白)-LDL(低密度脂蛋白)組分的蛋白質(zhì)含量(BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒；Pierce)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，使終濃度為50μg蛋白質(zhì)/ml，然后添加自由基引發(fā)劑(V70；2，2’-偶氮二(4-甲氧基-2，4-二甲基戊腈))，使終濃度為250μM，立即在37℃對由過氧化脂質(zhì)中的共軛二烯結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的234nm的吸收進(jìn)行測定(DU-640；Beckman Coulter)。分別制出給予組、對照組的過氧化脂質(zhì)生成曲線，對生成速度和生成量進(jìn)行比較(圖4)。結(jié)果表明，油菜和紅花給予組的脂蛋白組分與對照組相比，最終過氧化脂質(zhì)的蓄積減少(即難以氧化)(紅花＜油菜＜對照)。


實施例3將6-7周齡的雄性apoE基因敲除小鼠(購自JacksonLaboratory)分成對照/0.2重量％5-羥色胺衍生物給予組(對香豆酰5-羥色胺(CS)、阿魏酰5-羥色胺(FS)各0.1％)(CS+FS、0.2％)/0.4重量％5-羥色胺衍生物給予組(對香豆酰5-羥色胺(CS)、阿魏酰5-羥色胺(FS)各0.2％)(CS+FS、0.4％)/0.4重量％阿魏酰5-羥色胺(FS、0.4％)/1重量％紅花粕的萃取物(SFM)給予組(SFM、1％)共5組，每組7-10只，使每組分別自由攝取表2所示組成的餌料15周。本實施例中使用的紅花粕的萃取物(SFM)按照實施例2所示的方法制備。給予期結(jié)束后，處死小鼠，制備主動脈根部的切片，用油紅0對脂質(zhì)沉積部位(動脈硬化病變)染色。每個個體制備3枚切片，對其中主動脈瓣最清晰的標(biāo)本進(jìn)行圖像分析(用WinROOF(三谷商事))，根據(jù)Rajendra等人的方法(J.Lipid Res.，362320-2328頁，1995)測定病變面積。對于所得病變面積進(jìn)行各組間的方差分析，判明有顯著差異時，通過Scheffe檢驗對組間的平均值進(jìn)行比較。證實已知具有體外抗氧化活性、抗炎性的紅花粕中主要的酚性物質(zhì)5-羥色胺衍生物(Zhang等人、Chem.Pharm.Bull.，44874-876頁，1996；Kawashima等人、j.Interferon Cytokine Res.，18423-428頁，1998)部分地抑制了apaE基因敲除小鼠的病變形成，但紅花粕的萃取物(SFM、含有10-30重量％5-羥色胺衍生物)卻可比其更強(qiáng)烈地抑制(圖5)。


工業(yè)實用性本發(fā)明的可通過有機(jī)溶劑萃取、從脫脂后的植物種子中得到的組合物可用于預(yù)防動脈硬化，由于是來自天然的材料，因此安全性高，幾乎沒有副作用。含有該組合物的食品和藥物組合物對于預(yù)防動脈硬化有效。
本申請以在日本申請的特愿2002-110932為基礎(chǔ)，其內(nèi)容全部包含在本說明書中。
權(quán)利要求
1.預(yù)防動脈硬化的組合物，該組合物可通過有機(jī)溶劑萃取，由脫脂后的植物種子得到。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，植物種子為紅花或油菜的種子。
3.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中，有機(jī)溶劑萃取包括用低級醇從脫脂后的植物種子中萃取。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中，有機(jī)溶劑萃取包括用低級醇萃取后，用乙酸酯萃取。
5.如權(quán)利要求3或4所述的組合物，其中，有機(jī)溶劑萃取包括用低級醇萃取后，餾去低級醇，加入水，用非極性溶劑洗滌水相。
6.如權(quán)利要求3-5任一項所述的組合物，其中，低級醇為乙醇或甲醇。
7.如權(quán)利要求4-6任一項所述的組合物，其中，乙酸酯為乙酸乙酯、乙酸甲酯或乙酸丙酯。
8.如權(quán)利要求5-7任一項所述的組合物，其中，非極性溶劑為正己烷。
9.食品，該食品含有如權(quán)利要求1-8任一項所述的預(yù)防動脈硬化的組合物。
10.藥物組合物，該組合物含有如權(quán)利要求1-8任一項所述的預(yù)防動脈硬化的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供優(yōu)良的預(yù)防動脈硬化的組合物，以及含有該組合物的食品和藥物組合物。它們是可通過有機(jī)溶劑萃取，由脫脂后的植物種子得到的組合物、以及含有該組合物的食品和藥物組合物。
文檔編號A23L1/30GK1658891SQ03813429
公開日2005年8月24日 申請日期2003年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月12日
發(fā)明者小山直人, K·栗林, 石井康一, 小林克德 申請人:味之素株式會社