專利名稱：：一種簡易的雞胚接種封口方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：..本發(fā)明涉及病毒的雞胚接種培養(yǎng)方法，特別提供了用于雞胚接種封口的組合物。
背景技術(shù)：
：雞胚接種培養(yǎng)是病毒學(xué)的重要方法之一，來自禽類的病毒，均可在雞胚中繁殖，哺乳動(dòng)物的病毒如藍(lán)舌病病毒、流感病毒等也可在雞胚中增殖，雞胚接種技術(shù)是被認(rèn)為在流感尤其是禽流感病毒分離培養(yǎng)方法中最為經(jīng)典適用的方法。針對(duì)目前禽流感病毒肆虐的嚴(yán)峻局勢(shì)，有效快速的分離到病原，并降低實(shí)驗(yàn)過程中可能的風(fēng)險(xiǎn)，無疑會(huì)為禽流感病毒的防治、研究工作提供便利。常規(guī)的雞胚接種技術(shù)操作是將9-10日齡雞胚先用檢卵燈檢査雞胚活力，并用鉛筆畫出氣室和胚胎的位置及進(jìn)針部位，在無菌條件下，先用打孔器打孔，然后采用尿囊腔接種、卵黃囊接種等方法將病料或病毒株接種于雞胚，用液體石蠟封口后，置37X:培養(yǎng)箱繼續(xù)孵化，棄24小時(shí)后死亡雞胚，繼續(xù)置37"C培養(yǎng)箱繼續(xù)孵化至96小時(shí)，放置4"C冰箱過夜，最后無菌操作吸取尿囊、液，檢測(cè)HA效價(jià)，即為增殖i歸的病毒樣品。對(duì)于"封口"這一步操作，傳統(tǒng)雞胚接種方法是用石蠟封口，操作過程是必須事先將固體石蠟用酒精燈加熱融化至液態(tài)，然后吸取一滴，滴在進(jìn)針的孔上，待其凝固成固態(tài)后封住小孔，再如此進(jìn)行下一個(gè)雞胚的封口。此操作過程中需要一直用酒精燈對(duì)石蠟加熱保溫，耗時(shí)較長，而融化較劣質(zhì)的石蠟時(shí)，容易產(chǎn)生刺鼻難聞的煙霧，造成實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的污染；同時(shí)明火的存在，更是給實(shí)驗(yàn)室?guī)砘馂?zāi)的安全造成隱患。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于,一種雞胚^種封口方法，通過一種新型的封口用材料替代石蠟封口，使得雞胚接種的操作更為簡單。本發(fā)明具體提供了一種簡易的雞胚接種封口方法，其特征在于采用如下重量百分比成分的組合物作為封口劑乙酸乙酯10~30乙酸丁酯2040硝基纖維素10~20氨基樹脂1535樟腦15本發(fā)明簡易的雞胚接種封口方法中，封口劑中的組分為硝基纖維素1216氨基樹脂25~32樟腦24本發(fā)明中的乙酸乙酯和乙酸丁酯作為一種混合的活性激fi」，用來溶解硝基纖維素等物質(zhì)，這種按一定比例配制的組合液，具有合適的揮發(fā)性，一方面改善了組合物的干燥速度，另一方面使得成膜均勻。組分中的硝基纖維素作為一種成膜劑，可形成一層初級(jí)膜，它的粘度保證了組合物具有適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。本發(fā)明中還含有氨基樹脂和樟腦，氨基樹脂和樟腦的加入可降低纖維素膜的硬度，增強(qiáng)附著力和柔韌性。在雞胚接種封口操作時(shí)，采用本發(fā)明封口劑直接涂抹進(jìn)針孔，涂抹后迅速薄膜封閉接種的部位。此方法簡單易行，大大節(jié)省了操作時(shí)間和實(shí)驗(yàn)原料；同時(shí)也較好的避免了由酒精燈融化石蠟封口所帶來的實(shí)驗(yàn)室空氣污染和火災(zāi)安全隱患問題。用石蠟和本發(fā)明封口劑的利弊具體可見下表:表l:石蠟和普ffi^寸口劑封口的利弊比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>很多實(shí)驗(yàn)室為方ffife見，，點(diǎn)^l普ii!^燭(iS成分為石蠟)滴蠟封口，操作過程中很容易出現(xiàn)操作人員的^M^燙的液^^蠟滴燙到，雖然一船青況下不易于鮮燙傷，但仍會(huì)產(chǎn)生不必要的痛楚，且增加了操作人員在猛繊受外棘ij激時(shí)，可旨薩生的其它實(shí),失(如可能隨^5至iJi1^^^火災(zāi)隱患、可能將己il種好的雞胚打翻等)，這樣&m增加了雞K^種后病^r散甚至感自作人員的危險(xiǎn)c封口效果--般艦石蠟滴孔后，很多蠟滴容易聚集成團(tuán)突出在雞胚表面，再后面的檢卵過程中，極易,卵孔,滴免腐，從而形自胚,后期的污染L，也會(huì)認(rèn)為改變生長期間雞胚內(nèi)環(huán)境，從而給雞胚內(nèi)病毒增l^不利的影響，而封口布餘抹后，因其只會(huì)^l胚表面^一層薄膜，不會(huì)^胚表面形成大的突起，且T"燥時(shí)間短，,容易與雞胚顏色區(qū)分，所以容易防止脫落。原料駄--般低封口劑10ml/瓶，2-3W瓶，可用于600^700^KM口；而石微口時(shí)，除去購買石蠟所用費(fèi)用，還需考慮加熱時(shí)所耗酒精費(fèi)用。環(huán)餘污染鄉(xiāng)嚴(yán)重?zé)o石蠟力爐敝時(shí)，尤其是劣質(zhì)石imft;時(shí)，極易產(chǎn)^a擤難聞的煙霧，M實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的污染具體實(shí)施方式:實(shí)施例卜IO稱取乙酸乙酯和乙酸丁酯混合攪拌，均勻后攪拌下加入硝基纖維素，5分鐘后攪拌加入氨SM脂和樟腦，IO辦中后過濾得成品封口劑。成分及性能見表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例11:采用于37°0孵化的9-11日齡的雞胚260枚，在暗室內(nèi)畫出氣室邊緣和胚頭位置，氣室朝上立于卵架上，消毒旨?xì)馐也课?，在胚頭一側(cè)氣室邊緣上方0.5cm處用打孔器打一進(jìn)針孔；種樣品0.21111/枚，(接種完后開始用秒表計(jì)時(shí))，直接用實(shí)施例1封口劑瓶內(nèi)的小刷ffiit針L上涂刷1-2次，然后進(jìn)行下一枚雞胚的封孔(封孔完畢即停止計(jì)時(shí))。氣室朝上立于卵架上繼續(xù)孵化，棄去24h內(nèi)死亡雞胚，繼續(xù)置37"C培養(yǎng)箱繼續(xù)孵化至96小時(shí)，放置4"冰箱過夜，最后無菌操作吸取尿囊液，檢測(cè)HA效價(jià)，即為增殖培養(yǎng)的病毒樣品。結(jié)果見表3比較例l:采用于37'C孵化的9-11日齡的雞胚260枚，在暗室內(nèi)畫出氣室邊緣和胚頭位置，氣室朝上立于卵架上，消毒整個(gè)氣室部位，在胚頭一側(cè)氣室邊緣上方0.5cm處用打孔器打一進(jìn)針孔；種樣品0.21!11/枚，(接種完后開始用秒表i十時(shí))，然后取足夠量固體石蠟置于器皿中，放于酒精燈火焰上加熱至石蠟全部呈液態(tài)，用小滴管小心吸取l-2滴液態(tài)石蠟滴于進(jìn)針孔上封孔，然后進(jìn)行下一枚雞胚的封口(封孔完畢即停止計(jì)時(shí))。氣室朝上立于卵架上繼續(xù)孵化，棄去24h內(nèi)死亡雞胚，繼續(xù)置37t:培養(yǎng)箱繼續(xù)孵化至％小時(shí)，放置4。C冰箱過夜，最后無菌操作吸取尿囊液，檢測(cè)HA效價(jià)，即為增殖培養(yǎng)的病毒樣品。結(jié)果見表表3:2004年湖北某縣禽流感病毒株雞胚接種增殖方法實(shí)驗(yàn)耗時(shí)比較結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例12:采用于37。C孵化的9-11日齡的雞胚300枚，在暗室內(nèi)畫出氣室,和胚頭位置，氣室朝上立于卵架上，消毒齡氣室部位，在胚頭一側(cè)氣室邊緣上方0.5cm處用打孔器打一進(jìn)針孔；絲種樣品0.21111/枚，直接用實(shí)施例5封口劑瓶內(nèi)的小刷在進(jìn)針孔上涂刷1-2次，然后進(jìn)行下一枚雞胚的封L。氣室朝上立于卵架上繼續(xù)醉化，每12小時(shí)檢卵一次，觀察并計(jì)算封口情況(封口材料是否脫落，封口處是否又重新漏空)。棄去24h內(nèi)死亡雞胚，繼續(xù)置37'C培養(yǎng)箱繼續(xù)孵化至96小時(shí)，體化冰箱過夜，最后無菌操作吸取尿囊液，檢測(cè)HA效價(jià)，即為增殖培養(yǎng)的病毒樣品。結(jié)果見表4。比較例2:采用于37'C孵化的9-11日齡的雞胚300枚，在暗室內(nèi)畫出氣室邊緣和胚頭位置，氣室朝上立于卵架上，消毒整個(gè)氣室部位，在胚頭一側(cè)氣室邊緣上方0.5cm處用打L器打一進(jìn)針孔；錢種樣品0.2ml/枚，然后取足夠量固體石蠟置于器皿中，放于酒精燈火焰上加熱至石蠟全部呈液態(tài)，用小滴管小心吸取1-2滴液態(tài)石蠟滴于進(jìn)針孔上封孔，然后進(jìn)行下一枚雞胚的封口。氣室朝上立于卵架上繼續(xù)孵化，每12小時(shí)檢卵一次，觀察并計(jì)算封口情況(封口材料是否脫落，封口處是否又重新漏空)。棄去24h內(nèi)死亡雞胚，繼續(xù)置37"C培養(yǎng)箱繼續(xù)孵化至96小時(shí)，放置4X:冰箱過夜，最后無菌操作吸取尿囊液，檢測(cè)HA效價(jià)，即為增殖培養(yǎng)的病毒樣品。結(jié)果見表4。表4:2005年湖北某縣禽流感病毒株雞胚接種兩種封口材料封口效果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1、一種簡易的雞胚接種封口方法，其特征在于采用如下重量百分比成分的組合物作為封口劑乙酸乙酯10～30乙酸丁酯20～40硝基纖維素10～20氨基樹脂15～35樟腦1～5。2、按照權(quán)利要求1所述簡易的雞胚接種封口方法，其特征在于封口劑組分中硝基纖維素1216氨謝脂25~32樟腦24。全文摘要一種簡易的雞胚接種封口方法，其特征在于采用如下重量百分比成分的組合物作為封口劑乙酸乙酯10～30、乙酸丁酯20～40、硝基纖維素10～20、氨基樹脂15～35、樟腦1～5。本發(fā)明通過一種新型的封口用材料替代石蠟封口，使得雞胚接種的操作更為簡單。文檔編號(hào)C09K3/00GK101191046SQ20061013441公開日2008年6月4日申請(qǐng)日期2006年11月29日優(yōu)先權(quán)日2006年11月29日發(fā)明者霜唐,錚寇,忠張,李天憲,李永東,范兆軍,陳繩亮申請(qǐng)人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所