專利名稱：：快速脫除百合三種病毒的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物
技術領域：
，特別是涉及快速脫除百合三種病毒的方法。
背景技術：
：百合三種病毒LSV、CMV、LMoV是造成百合經濟作物減產的主要原因?，F有的脫去上述三種病毒的主要方法有如下幾種l)莖尖分生法莖尖分生區(qū)是病毒含量最少的區(qū)域。莖尖分生組織僅限于頂端圓錐區(qū)，其長度不超過0.1mm進行的無菌培養(yǎng)。但，這么小的莖尖實際上很難取得，成活率很低，且培養(yǎng)成苗的時間也很長。因此，在實際培養(yǎng)中，多采用帶有葉原基的生長錐來培養(yǎng)，通常0.20.4mm(毫米)的莖尖分生組織，但，帶毒的幾率增大。Kim對帶LSV、CMV、LMoV的鐵炮百合'Georgia'進行莖尖脫毒；席夢利也采用莖尖脫毒對宜興百合進行脫毒，獲得了組培苗，但未進行病毒檢測。2)熱處理是利用病毒和寄主植物對高溫的忍耐性的差異,選擇一定的溫度和適當的處理時間，使寄主體內的病毒鈍化失活，從而達到減輕病毒危害的目的。應用熱處理與莖尖培養(yǎng)相結合方法能夠更加有效脫除病毒。38±1°C，6h或25°C8h熱空氣和50±1°C，40min恒溫水浴結合莖尖培養(yǎng)脫除了宜興百合的CMV病毒。3)抗病毒藥劑法其作用原理是抗病毒藥劑在三磷酸狀態(tài)下會阻止病毒RNA帽子結構形成,抑制病毒增殖或移動。Blom-Barnhoorn采用不同的病毒唑濃度(20和100mg/L)，分別獲得了兩個百合品種'Georgia'和'ConnecticutKing，的無毒苗；Xu-PinSan在鱗片誘導培養(yǎng)基中加5mg/L(毫克/升)的病毒唑和硫尿嘧啶，獲得80%無毒百合植株。Dapkuniene將組培小籽球在加有5mg/L(毫克升)芐基腺嘌呤和0.1mg/LNAA的MS培養(yǎng)基中獲得了4個品種的無毒百合籽球。但現有的檢測方法中還存在如下問題莖(根)尖培養(yǎng)(stemorshoottipculture)是切取莖(根)的先端部分或莖(根)尖分生組織部分進行的無菌培養(yǎng)。嚴格地講，莖尖分生組織僅限于頂端圓錐區(qū)，其長度不超過0.1mm。但這么小的莖尖實際上很難取得，且培養(yǎng)成苗的時間也很長。因此，在實際培養(yǎng)中，常采用帶有葉原基的生長錐來培養(yǎng)。實際操作不可能得到不超過0.1mm的莖尖。較大莖尖脫毒率大為降低，甚至不能脫毒。應用熱處理與莖尖培養(yǎng)相結合方法能夠更加有效脫除病毒。但實際上38士rC，6h和50士rC40min恒溫水浴下，莖尖培養(yǎng)不能成活，25。C8h熱空氣不能脫除LSV、LMoV?？共《舅巹┓ㄖ锌共《緞┑氖褂脻舛仍礁?處理時間越長脫毒效果越加明顯，但同時，高濃度抗病毒劑對植株的生長有明顯傷害。獲得無病毒植株的難易程度與品種和感染病毒的種類有直接關系。同時，與病毒檢測技術方法相關，早期均采用指示植物和ELISA法檢測，靈敏度較低，很多情況下并沒有真正完全脫除病毒。
發(fā)明內容本發(fā)明針對上述三種方法的缺陷，提供一種快速脫除百合三種病毒的方法，并結合靈敏的病毒檢測方法，解決成活率低，脫毒率低，再生速率低等技術問題，從而達到高效快速脫毒的目的?？焖倜摮俸先N病毒的方法，其特征在于將莖尖分生組織接種于含有病毒唑的培養(yǎng)基上，所述莖尖大小為0.5mm0.8mm，病毒唑濃度為4mg/L6mg/L。培養(yǎng)基成分為MS+IBA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，蔗糖3%，瓊脂6g/L。培養(yǎng)條件200030001x，光照時間14h/d，培養(yǎng)溫度2025'C。本申請組合莖尖脫病法及抗病毒藥劑法，將切取的莖尖分生組織增大，這樣可以縮短了其培養(yǎng)的時間，但其所含病毒量增加了，采用一定濃度的病毒唑對其進行脫毒，由于病毒含量提高，其病毒唑的濃度應控制在一定的范圍內，濃度太高，易造成死亡，濃度太低起不到脫毒的效果，本發(fā)明經過反復實驗得出，莖尖大小為0.5mm0.8mm，病毒唑濃度為4mg/L6mg/L，脫毒效果最好，且脫毒組織經過3個月，18個月和栽培成花全過程檢測，證明本發(fā)明方法脫毒率達92%。本發(fā)明方法采用莖尖大小為0.5mm0.8mm作為脫毒培養(yǎng)組織，容易切取，而且成活率和再生速率都大大提高了，由于莖尖增大了，其耐病毒唑濃度也提高了，所以可以在較高病毒唑濃度(4mg/L6mg/L)下脫除病毒，脫毒率大大提高。圖l:部分處理組合生長4周狀況其中A:0.50.7莖尖和2mg/L病毒唑形成愈傷組織，B:0.50.7莖尖和8mg/L病毒唑愈傷組織死亡，C:0.20.4莖尖和2mg/L病毒唑形成愈傷組織，D:1.01.2莖尖和4mg/L病毒唑形成的植株圖2:東方百合<元帥'LSV跟蹤檢測電泳圖第1泳道接種3周的莖尖和愈傷組織；第2泳道生長9周的脫毒苗；第3泳道生長12周形成的脫毒苗；第4泳道莖尖直接形成的脫毒子球；第5泳道脫毒子球形成的開花植株；第6泳道陽性對照(脫毒前的病毒條帶)；第7泳道陰性對照。圖3:原始材料、脫毒組織在培養(yǎng)階段、瓶中成球和成花栽培后的狀態(tài)其中l(wèi):東方百合'元帥'3種病毒復合侵染表現出花瓣斑駁，花柱發(fā)育不良，2:OT雜交系'動人'3種病毒復合侵染表現出葉巻曲，3:百合種球的莖尖，4:接種2周的莖尖，5:生長7周的莖尖，6:生長9周形成的脫毒苗，7:莖尖直接形成的脫毒子球，8:脫毒開花植株。具體實施方式1)脫毒方法取經低溫處理已抽芽36cm的鱗莖，從莖節(jié)處切下，去掉外部鱗片。用自來水沖洗lh，蒸餾水浸泡10min，再用0.1%氯化汞消毒10min(加幾滴吐溫80)，最后無菌水沖洗35次。在帶有測微尺的體視顯微鏡(Olympus,SZX10)無菌條件下切取帶有1一2個葉原基的，不同大小的莖尖分生組織，迅速接種于添加不同濃度病毒唑的培養(yǎng)基上，進行莖尖培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分為MS+IBA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，蔗糖3%，瓊脂6g/L。培養(yǎng)條件20003000k，光照時間14h/d，培養(yǎng)溫度2025°C。根據均勻試驗設計，莖尖大小設為4個水平0.2-0.4mm、0.5-0.7mm、0.8-1.0mm、1.0-1.2mm;病毒唑濃度設為5個水平，Omg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L、10mg/L，共20個處理，每個處理30個莖尖。注意觀察莖尖的生長情況，統(tǒng)計莖尖成活率。(見表l、表2)接種莖尖到添加不同病毒唑濃度的分化培養(yǎng)基上，7d左右，觀察到有的莖尖開始膨大變綠，有的因為失水而變褐，死亡。20d左右，存活的莖尖有的分化成芽，有的膨大形成愈傷組織。每隔25d更換一次培養(yǎng)基，保證莖尖生長所需營養(yǎng)。隨著莖尖不斷的吸收作用，當病毒唑濃度大于6mg/L，部分莖尖慢慢失綠，變褐或成為白化苗死亡。當病毒唑濃度達到10mg/L時，莖尖的成活率只有30%。(見圖l)表l因素水平表Table1Thecombinationoftheexperiment_水平因素A病毒唑濃度ConcentrationofVirazole(mg/L)10B莖尖大小Sizeoftipmeristem(mm)0.20.40.50.70.81.01.01.2表2正交試驗結果分析表Table2Analyzeoftheexperiment<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>從成活的組培苗中，每個處理隨機選取3個進行多重RT-PCR檢測。試驗結果表明感病百合中CMV和LMoV被全部脫除，而LSV在部分組培苗中還存在。在沒有添加病毒唑的處理中，莖尖大小在0.2-0.4mm范圍時，可以脫除全部病毒。但從上表結果顯示，此范圍內莖尖的成活率只有40%，而且由于操作困難，莖尖太小極易失水而失活，莖尖生長也很緩慢。當莖尖大于1.0mm時，病毒唑濃度即使達到10mg/L也不能完全脫除病毒。病毒唑濃度小于4mg/L時，檢測到CMV+LSV兩種病毒同時存在的現象。當病毒唑濃度大于4mg/L時，未脫除的只有LSV,而CMV和LMoV均無。病毒唑濃度大于6mg/L，莖尖大小小于1.0mm時，LSV也被脫除。當病毒唑濃度達到4mg/L時，莖尖大小在0.8mm以上，有部分病毒不能脫除；病毒唑濃度在6mg/L以上時，大部分病毒均可被脫除。在10mg/L，莖尖大小小于1.0mm時，病毒脫除率可達98%，但是該濃度時莖尖的成活率卻只有30%。綜合莖尖成活率和脫毒率兩因素，當病毒唑濃度在4mg/L6mg/L之間，莖尖大小在0.5mm0.8mm，效果最好，病毒脫除率可達92%。2)檢測本發(fā)明方法的效果應用本實驗室建立的RT-PCR方法進行病毒檢測，并分別在脫毒原始材料、脫毒組織培養(yǎng)3個月、18個月和栽培成花全過程(見圖3)檢測病毒。針對CMV、LMoV和LSV三種病毒外殼蛋白CP基因保守序列設計了三對引物，利用該方法擴增不同的目的片段。引物序列分別是CMV:上游引物5，-ATGGACAAATCTGAATCAACCAG及下游引物5'-TCAGACTGGGAGCACTCCG..。LMoV:上游引物5'隱GCAAATGAGACACTTAACGCT及下游引物5'-CATAGAAATTCCAAGTAAGGGG。LSV:上游引物5'-ATGCAATCAAGACCAGCACAAG及下游引物5'-TTTGTGTATCGATGATTTCGG。1.植物總RNA提取與cDNA第一鏈的合成稱取新鮮病葉50mg,在1.5mL的eppendorf管中，加入少量液氮，用干凈滅菌的玻璃棒迅速磨碎，力Q500nL病毒抽提液0.5MpH8.0的Tris-HCl，2%PVP-40,1%PEG6000,0.8%NaCI和0.05%Tween20。繼續(xù)研磨混勻，從中取10yL用抽提液再稀釋50~100倍后即為工作液(RT-PCR的模板)。2多重RT-PCR擴增PCR程序PCR程序42°C反轉錄30min，95。C4min，94。C20s,52°C30s，72°C40s,72。C5min，30個循環(huán)。反應在PCR擴增儀(PTC-100programmablethermalcontroller,MJ.reseachInc)上進行，30個循環(huán)，72'C延伸5min，最后于4'C結束。2)反應產物的電泳檢測擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為0.5XTBE，電壓100V，PCR產物上樣量為6pL，用凝膠成像儀GdDoc1000凝膠分析儀(Bio-Rad)掃描并產生TIFF圖象，經圖象分析軟件(QUANTYONE)進行分析。(見圖2)結論經本發(fā)明方法處理過的脫毒級組織經再培養(yǎng)后沒有發(fā)現有病毒，說明本發(fā)明方法脫毒反應體系:總RNA提取物5攀0.5nL0.2nL0.5nL2.5|xL1.6nL0阜0.5nL0.5mL0.5nL13|oL25pLOligodTPrimer(0.5ng/|iL)SSII反轉錄酶(20U/pL)Rnaseinhibitor(40U/nL)TaqPCRbuffer(內含1.5mmol/LMgCl2)dNTP(200,l/L)Taq酶(5U/jiL)引物CMV,/CMV2(5pmol)引物LSV,/LSV2(5pmol)引物LMoVi/LMoV2(5ptno1)ddH20Total效果非常好權利要求1、快速脫除百合三種病毒的方法，其特征在于將莖尖分生組織接種于含有病毒唑的培養(yǎng)基上，所述莖尖大小為0.5mm～0.8mm，病毒唑濃度為4mg/L～6mg/L。2、根據權利要求1所述的方法，所述培養(yǎng)基成分為MS+IBA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，蔗糖3%，瓊脂6g/L。3、根據權利要求1或2所述的方法，所述培養(yǎng)條件為200030001x，光照時間14h/d，培養(yǎng)溫度2025X:。全文摘要本發(fā)明涉及“快速脫除百合三種病毒的方法”，屬于生物
技術領域：
。快速脫除百合三種病毒的方法，其特征在于將莖尖分生組織接種于含有病毒唑的培養(yǎng)基上，所述莖尖大小為0.5mm～0.8mm，病毒唑濃度為4mg/L～6mg/L。本發(fā)明脫除百合病毒的方法，脫毒組織具有脫毒率高，成活率高，再生速率快的優(yōu)點。文檔編號C12N7/00GK101173251SQ20071017869公開日2008年5月7日申請日期2007年12月4日優(yōu)先權日2007年12月4日發(fā)明者博劉,春劉,徐榕雪,軍明,湯庚國,王曉武,鼎穆申請人:中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所