專利名稱：：檢測磺脲類受體1基因多態(tài)性位點的引物、用途及試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種用PCR方法檢測磺脲類受體基因多態(tài)性位點基因型的特異性引物，尤其是磺脲類受體l基因T1369G(rs757110)多態(tài)性位點的特異性引物，以及該特異性引物在制備通過PCR擴增生物樣品檢測磺脲類受體1基因T1369G多態(tài)性位點的試劑中的用途、包含特異性引物的磺脲類受體1基因T1369G多態(tài)性位點檢測試劑盒、試劑盒預測磺脲類藥物作用效果的用途，屬于醫(yī)藥生物
技術領域：
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背景技術：
：磺脲類抗糖尿病藥物是一種促胰島素分泌劑，可以降低空腹和餐后血糖。對于大多數(shù)新診斷的2型糖尿病患者，磺脲類抗糖尿病藥物可以使空腹血糖下降5080mg/dl，使糖化血紅蛋白(HbAlc)下降1.0%2.5%。因為2型糖尿病患者的卩細胞功能隨時間而衰減，磺脲類抗糖尿病藥物降低臨床新診斷的糖尿病患者的血糖水平十分有效?；请孱惪固悄虿∷幬锱cKATP通道的亞單位——高親和性磺脲類藥物受體(sulfonylureareceptor1，SUR1)結合后關閉K+通道，使細胞膜上的部分區(qū)域去極化引起電壓依賴性L一型Ca"通道開放，Ca"進入細胞內(nèi)，胞漿中Ca^濃度升高，從而刺激胰島素分泌。磺脲類抗糖尿病藥物還可以通過胰島外的作用，增強胰島素作用于靶器官(肝、肌肉、脂肪細胞)。臨床上廣泛應用的磺脲類抗糖尿病藥物包括甲苯磺丁脲(Tolbutamide)、氯磺丙脲(Chlorpropamide)、格列本脲(GUbenclamide)、格列波脲(Glibornuride)、格列環(huán)脲(Glycyclamide)、格列己脲(Glyhexamide)、格列沙脲(Glisamuride)、格列生脲(Glisentide)、格列索脲(Glisolamide)、格列辛脲(Glyoctamide)、格列齊特(Gliclazide)、格列吡嗪(Glipizide)、格列吡嗪緩釋片(GlucotrolXL)、格列喹酮(Gliquidone)和格列美脲(Glimepiride)?；请孱愃幬飳τ谶m用人群(非超重或非肥胖2型糖尿病患者)的總有效率為5080%，有部分適用人群存在磺脲類藥物原發(fā)性失效和繼發(fā)性失效。常見的副作用為低血糖、抽搐，偶見胃腸道反應、皮疹、頭痛。遺傳背景不僅可能影響疾病的發(fā)生，而且影響藥物療效的個體差異。隨著藥物遺傳學研究的不斷深入和發(fā)展，在未來糖尿病的藥物治療中，將可能利用遺傳學篩查方法，實現(xiàn)因人而異的個體化臨床用藥目標，有效避免不合理用藥、錯誤用藥乃至濫用藥物傾向，減少用于治療藥物不良反應的費用，避免無效用藥造成的浪費。3申請?zhí)柎a為200610002633.1的發(fā)明專利申請公開了SUR1基因的多態(tài)性位點基因型和磺脲類藥物降低血糖、改善和恢復胰島(3細胞功能和/或增強胰島素敏感性作用效果的關系(1)當所述的SUR1基因的多態(tài)性位點基因型為Alal369Ala(rs757110)純合突變型時，預測磺脲類藥物降低血糖、改善和恢復胰島P細胞功能和/或增強胰島素敏感性的作用效果強；所述的SUR1基因的多態(tài)性位點基因型為Serl369Ser(rs757110)純合野生型吋，預測磺脲類藥物降低血糖、改善和恢復胰島p細胞功能和/或增強胰島素敏感性的作用效果弱；(2)所述的SUR1基因的多態(tài)性位點基因型為Serl369Ser(rs757110)純合野生型時，預測達到理想的降糖效果需要磺脲類藥物的首次劑量較大，多次調(diào)整劑量后磺脲類藥物的降糖效果較差；所述的SUR1基因的多態(tài)性位點基因型為Alal369Ala(rs757110)純合突變型時，預測達到理想的降糖效果需要磺脲類藥物的首次劑量較小，多次調(diào)整劑量后磺脲類藥物的降糖效果較好。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術問題是在現(xiàn)有SUR1基因T1369G多態(tài)性位點(rs757110)基因型和磺脲類藥物降低血糖、改善和恢復胰島P細胞功能和/或增強胰島素敏感性作用效果的關系的基礎上，提供一種用PCR方法檢測SUR1基因T1369G多態(tài)性位點(rs757110)的特異性引物、該特異性引物在制備通過PCR擴増生物樣品檢測SUR1基因T1369G多態(tài)性位點的試劑中的用途、包含特異性引物的SUR1基因T1369G多態(tài)性位點檢測試劑盒以及該檢測試劑盒預測磺脲類藥物作用效果的用途。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案一種用PCR方法檢測SUR1基因T1369G多態(tài)性位點(Serl369Ala，rs757110)的特異性引物GCACGTCAATGCCCTCAACT，GGGGAAGGCAATAGAAGGAG，CTGAAAACCGAGGCAGAGAG，CTGACCTTCTGTCCAGGTGC。本發(fā)明還提供了上述特異性引物在制備通過PCR擴增生物核酸樣品檢測SUR1基因T1369G多態(tài)性位點的試劑中的用途。在本發(fā)明提供的用途中，所述的試劑中含有檢測SUR1基因T1369G多態(tài)性位點的特異性引物GCACGTCAATGCCCTCAACT，GGGGAAGGCAATAGAAGGAG，CTGAAAACCGAGGCAGAGAG,CTGACCTTCTGTCCAGGTGC。在本發(fā)明提供的用途中，所述的試劑中還含有20-30mM的Mg2+、2-10U/ulTaq聚合酶和1-2.5mMdNTP。在本發(fā)明提供的用途中，PCR循環(huán)條件為94°C3分鐘1個循環(huán)，94°C45分鐘35個循環(huán)，57°C1分鐘35個循環(huán)，72°C1分鐘35個循環(huán)，72°C7分鐘1個循環(huán)在本發(fā)明提供的用途中，生物核酸樣品選自血液樣品、體液樣品、組織樣品和培養(yǎng)細胞，優(yōu)選的，所述樣品為血液樣品。其中血液樣品包括外周血細胞、白細胞、血清等，體液祥品包括尿液、唾液、組織液、腦脊液、體腔滲出液等，組織樣品包括口腔粘膜試子、毛發(fā)、皮膚、活檢組織、組織樣分泌物、排泄物樣本等。生物核酸樣品適用于來自正常人群、空腹血糖受損人群、糖耐量受損人群和糖尿病人群，也適用于存在患糖尿病高風險因素人群，特別適用于體重指數(shù)較高、超重、胰島功能較差、胰島素敏感性較差、病程長、合并高血壓、或者合并高血脂的糖尿病人群。一種檢測SUR1基因T1369G多態(tài)性位點的試劑盒，試劑盒包含特異性引物GCACGTCAATGCCCTCAACT、特異性引物GGGGAAGGCAATAGAAGGAG、特異性引物CTGAAAACCGAGGCAGAGAG、特異性引物CTGACCTTCTGTCCAGGTGC、1-2.5mMdNTP、2-10U/(ilTaq聚合酶和20-30mM的Mg2+。作為一種優(yōu)選，本發(fā)明實施例提供的試劑盒中含有特異性引物GCACGTCAATGCCCTCAACT，特異性弓l物GGGGAAGGCAATAGAAGGAG，特異性弓l物CTGAAAACCGAGGCAGAGAG,特異性弓I物CTGACCTTCTGTCCAGGTGC,25mMMg2+、5U/ulTaq聚合酶和1.25mMdNTP。本發(fā)明提供的試劑盒除了包含測定SUR1基因T1369G多態(tài)性位點所需要的特定引物之外，還包含運用PCR擴增而進行檢測的試劑盒的常規(guī)組件、試劑、緩沖液等，本領域技術人員熟悉這些常規(guī)組件和檢測方法。本發(fā)明提供的檢測試劑盒具有預測磺脲類藥物作用效果的用途。本發(fā)明提供的檢測試劑盒預測磺脲類藥物作用效果的用途中，磺脲類藥物選自格列本脲、格列波脲、格列環(huán)脲、格列己脲、格列美脲、格列平脲、格列沙脲、格列生脲、格列索脲、格列辛脲、格列齊特、格列吡嗪、和格列喹酮，優(yōu)選為格列齊特或格列美脲。本發(fā)明提供的檢測試劑盒預測磺脲類藥物作用效果的用途中，(l)糖尿病患者SURl基因的多態(tài)性位點基因型為Alal369Ala(rs757U0)純合突變型時，其服用磺脲類藥物后，預測磺脲類藥物降低血糖、改善和恢復胰島[3細胞功能和/或增強胰島素敏感性的作用效果強；當糖尿病患者SUR1基因的多態(tài)性位點基因型為Serl369Ser(rs757110)純合野生型吋，其服用磺脲類藥物后，預測磺脲類藥物降低血糖、改善和恢復胰島(3細胞功能和/或增強胰島素敏感性的作用效果弱；(2)當糖尿病患者SUR1基因的多態(tài)性位點基因型為Serl369Ser(rs757110)純合野生型時，其服用磺脲類藥物后，預測達到理想的降糖效果需要磺脲類藥物的首次劑量較大，多次調(diào)整劑量后磺脲類藥物的降糖效果較差；當糖尿病患者SUR1基因的多態(tài)性位點基因型為Alal369Ala(rs757110)純合突變型時，其服用磺脲類藥物后，預測達到理想的降糖效果需要磺脲類藥物的首次劑量較小，多次調(diào)整劑量后磺脲類藥物的降糖效果較好。本發(fā)明中的理想降糖效果指治療后空腹血漿血糖值(FPG)《7.0mmol/L或者治療后空腹血槳血糖值(FPG)與治療前相比下降220%。本發(fā)明的優(yōu)點是以特異性引物GCACGTCAATGCCCTCAACT、特異性引物GGGGAAGGCAATAGAAGGAG、特異'性弓l物CTGAAAACCGAGGCAGAGAG禾口特異性引物CTGACCTTCTGTCCAGGTGC為核心，制備通過PCR擴增生物核酸樣品檢測SUR1基因T1369G多態(tài)性位點的試劑，并提供一種檢測SUR1基因T1369G多態(tài)性位點的試劑盒以及試劑盒預測磺脲類藥物作用效果的用途。本發(fā)明PCR模板制備方法操作簡單，無需特殊設備，PCR擴增后直接采用電泳方法檢測PCR產(chǎn)物，無需其他特殊檢測方法和檢測儀器設備，即可以根據(jù)電泳結果確定磺脲類受體的多態(tài)性位點基因型。根據(jù)磺脲類受體的基因多態(tài)性結果，結合個體的其他生物學指標對于磺脲類藥物的療效和副作用進行預測。本發(fā)明克服了臨床選擇磺脲類藥物的盲目性，在基因型分析的基礎上可以預測患者使用磺脲類藥物的有效性和安全性，指導臨床用藥，使患者能夠進行個體化醫(yī)療，盡早有效地控制血糖，減少毒副作用，減少醫(yī)療成本。本發(fā)明特別針對SUR1T1369G(Serl369Ala，rs757110)多態(tài)性位點基因型設計了PCR擴增引物，與常規(guī)的擴增引物相比較，擴增效率高、特異性好、省時，能夠直接根據(jù)PCR產(chǎn)物的片段大小鑒定該位點的基因型，無需后續(xù)的檢測步驟和相應的試劑、設備，有更好的使用價值。圖1SUR1Serl369Ala多態(tài)性基因型圖示1為503bp;2為319bp;3為223bp圖216份樣本電泳結果圖具體實施例方式實施例1用PCR方法檢測SUR1基因T1369G多態(tài)性位點基因型一、樣本準備分別取12份EDTA抗凝血做為樣本來源，按照下述步驟制備樣本。1.1.5ml離心管中，加入EDTA抗凝血標本100^12.加入30(^1紅細胞裂解液，37'C孵育20分鐘。3.離心，取沉淀4.加入lOOpl白細胞裂解液，將沉淀重懸，37'C孵育15分鐘5.加入35pl蛋白沉淀液，高速振蕩90秒。6.離心，取上清，將上清液全部移入裝有100^1異丙醇的1.5ml離心管中，來回輕柔的搖勻IO次至有白色絮狀物出現(xiàn)；15000g離心90秒，離心管底部可見白色沉淀。7.棄上清液，注意保留白色沉淀，毎管加入100^175%乙醇，15000g離心90秒，棄上清液，注意保留白色沉淀，輕輕在吸水紙上敲干殘液，于空氣中干燥3分鐘；8.每管加入提前預熱至65°C的TE緩沖液60|il，中速振蕩5秒后低速離心2秒以收集液體于離心管底部。二、基因的PCR擴增檢測用四引物雙向PCR方法檢測SUR1基因T1369G多態(tài)性位點基因型引物信息見表1。表l引物信息<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>相關的試劑和儀器設備情況如下TaqDNA聚合酶，本品購自上海生工公司。儀器設備微量移液器，PCR儀，高速離心機，微波爐，凝膠成像系統(tǒng)，電子天平，電泳槽，電泳儀、純水器，滅菌鍋，電熱(隔水)培養(yǎng)箱。PCR反應體系配置見表2。PCR擴增程序見表3。PCR反應的模版量為2ul，不干燥。終止反應的方法所有循環(huán)結束后，設定的PCR程序會自動終止反應。三、擴增產(chǎn)物的電泳檢測使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR結果1.試劑配制2%瓊脂糖凝膠瓊脂糖(Agarose)2glxTBE電泳緩沖液100ml2.操作步驟向PCR反應產(chǎn)物中加入適量的上樣緩沖液，混勻后加樣在2%瓊脂糖凝膠上，于200V電壓下電泳11.5小時后，在紫外透射監(jiān)測儀上讀取膠圖并進行基因型分析。根據(jù)表4分析基因型。表2PCR反應體系配置<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表3PCR反應條件和循環(huán)數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4多態(tài)性位點基因型的靶序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>電泳結果如圖2。根據(jù)上述的基因分型表可得到如下結果l雜合突變型(TG);2純合野生型(TT);3雜合突變型(TG);4純合野生型(TT);5雜合突變型(TG);6純合野生型(TT);7雜合突變型(TG);8純合野生型(TT);9雜合突變型(TG);IO純合突變型(GG);ll雜合突變型(TG);12純合突變型(GG);13雜合突變型(TG);14純合突變型(GG);15雜合突變型(TG);16純合突變型(GG)<110〉北京華安佛醫(yī)藥研究中心有限公司深圳奧薩醫(yī)藥有限公司〈120〉檢測磺脲類受體l基因多態(tài)性位點的引物、用途及試劑盒<160〉4<170>Patentlnversion3.3<210〉1〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>1gcacgtcaatgccctcaact20<210〉2〈211〉20<212>腿<213>人工序列<400>2ggggaaggcaat卿aggag20〈210〉3〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉3ctgaaaaccgaggcagagag20<210〉4<211〉20〈212〉DNA<213〉人工序列〈400〉4ctgaccttctgtccaggtgc20權利要求1.—種用PCR方法檢測SUR1基因T1369G多態(tài)性位點(rs757110)基因型的特異性引物GCACGTCAATGCCCTCAACT，GGGGAAGGCAATAGAAGGAG，CTGAAAACCGAGGCAGAGAG，CTGACCTTCTGTCCAGGTGC。2.權利要求1所述的特異性引物在制備通過PCR擴增生物核酸樣品檢測SUR1基因T1369G多態(tài)性位點(rs757110)基因型的試劑中的用途。3.如權利要求2所述的用途，其特征在于所述的試劑中含有20-30mM的Mg"，優(yōu)選25mM。4.如權利要求2所述的用途，其特征在于所述的試劑中含有2-10UlTaq聚合酶。5.如權利要求4所述的用途，其特征在于所述的試劑中含有5UlTaq聚合酶。6.如權利要求2所述的用途，其特征在于所述的試劑中含有1-2.5mMdNTP，優(yōu)選1.25mM。7.如權利要求2所述的用途，其特征在于所述的PCR擴增中PCR循環(huán)條件為94°C3分鐘1個循環(huán)，94°C45分鐘35個循環(huán)，57°C1分鐘35個循環(huán)，72°C1分鐘35個循環(huán)，72°C7分鐘1個循環(huán)。8.—種檢測SUR1基因T1369G多態(tài)性位點(rs757110)基因型的試劑盒，包含特異性引物GCACGTCAATGCCCTCAACT，特異性弓l物GGGGAAGGCAATAGAAGGAG，特異性引物CTGAAAACCGAGGCAGAGAG，特異性引物CTGACCTTCTGTCCAGGTGC，l-2.5mMdNTP，2-10U/|ilTaq聚合酶和20-30mM的Mg2+。9.權利要求8所述的檢測試劑盒預測磺脲類藥物作用效果的用途。10.如權利要求9所述的用途，其特征在于所述的磺脲類藥物選自格列本脲、格列波脲、格列環(huán)脲、格列己脲、格列美脲、格列平脲、格列沙脲、格列生脲、格列索脲、格列辛脲、格列齊特、格列吡嗪、和格列喹酮，優(yōu)選為格列齊特或格列美脲。11.如權利要求9所述的用途，其特征在于(1)所述SUR1基因多態(tài)性位點基因型為Alal369Ala(rs757110)純合突變型時，預測磺脲類藥物降低血糖、改善和恢復胰島P細胞功能和/或增強胰島素敏感性的作用效果強；所述SUR1基因多態(tài)性位點基因型為Serl369Ser(rs757110)純合野生型時，預測磺脲類藥物降低血糖、改善和恢復胰島P細胞功能和/或增強胰島素敏感性的作用效果弱；(2)所述SUR1基因多態(tài)性位點基因型為Serl369Ser(rs757110)純合野生型時，預測達到理想降糖效果需要磺脲類藥物的首次劑量較大，多次調(diào)整劑量后磺脲類藥物降糖效果較差；所述SUR1基因多態(tài)性位點基因型為Alal369Ala(rs757110)純合突變型時，預測達到理想降糖效果需要磺脲類藥物的首次劑量較小，多次調(diào)整劑量后磺脲類藥物降糖效果較好。全文摘要本發(fā)明提供一種用PCR方法檢測SUR1基因T1369G多態(tài)性位點(rs757110)基因型的特異性引物、該特異性引物在制備通過PCR擴增生物樣品檢測SUR1基因T1369G多態(tài)性位點的試劑中的用途、包含特異性引物的SUR1基因T1369G多態(tài)性位點檢測試劑盒以及該檢測試劑盒預測磺脲類藥物作用效果的用途。磺脲類藥物選自格列本脲、格列波脲、格列環(huán)脲、格列己脲、格列美脲、格列平脲、格列沙脲、格列生脲、格列索脲、格列辛脲、格列齊特、格列吡嗪和格列喹酮，優(yōu)選為格列齊特或格列美脲。文檔編號C12Q1/68GK101445824SQ20071017822公開日2009年6月3日申請日期2007年11月28日優(yōu)先權日2007年11月28日發(fā)明者多于,張彥明,徐希平,燕王,玉王,謝愛武,邢厚恂申請人:北京華安佛醫(yī)藥研究中心有限公司;深圳奧薩醫(yī)藥有限公司