檢測雞三種免疫抑制病病毒的基因芯片及試劑盒與方法
【專利摘要】本發(fā)明“檢測雞三種免疫抑制病病毒的基因芯片及試劑盒與方法”，涉及動物醫(yī)學診斷領域。所述基因芯片的特征在于：在芯片基質上設置有雞淋巴白血病病毒ALV的四個亞群A、C、D和J亞群、雞傳染性貧血病毒CAV、禽網狀內皮增生癥病毒REV的特異性探針序列；本發(fā)明還提供了檢測雞淋巴白血病病毒ALV的四個亞群A、C、D和J亞群、雞傳染性貧血病毒CAV、禽網狀內皮增生癥病毒REV的試劑盒；本發(fā)明的芯片和試劑盒及提供的檢測方法能針對多種病原進行高通量、快速、準確的檢測，能在較短的時間內對感染性疾病做出正確診斷，防止傳染性疾病傳播。
【專利說明】檢測雞三種免疫抑制病病毒的基因芯片及試劑盒與方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及動物醫(yī)學診斷，特別是涉及一種檢測雞三種免疫抑制病病毒的基因芯片、試劑盒及方法
【背景技術】
[0002]近年來，我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展非常迅速，已成為我國畜牧業(yè)的支柱產業(yè)之一?？墒请S著養(yǎng)禽業(yè)的快速發(fā)展，各種內在及外在因素也正嚴重地威脅著養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展，其中疫病已成為威脅養(yǎng)禽業(yè)的頭號大敵。雖然通過使用疫苗接種及藥物控制等手段，使禽類主要傳染病的防制取得了一定的成效，但在各地雞場的生產實踐中免疫接種過的雞群仍會不斷發(fā)生各種疾病，其中不容忽視的原因之一就是禽類免疫抑制病。禽免疫抑制病是由單一或多種致病因素共同作用，導致雞只免疫系統(tǒng)受損、免疫功能降低的疾病的總稱。引起家禽免疫抑制的病毒有雞傳染性貧血病病毒(CAV)、禽白血病病毒(ALV)、網狀內皮增生癥病毒(REV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、馬立克氏病病毒(MDV)等。其中禽淋巴白血病(AL)、雞傳染性貧血病(CIA)以及網狀內皮增生癥(RE)是目前對我國養(yǎng)雞業(yè)危害最為嚴重的免疫抑制病，與其他雞病相比，它們具備垂直傳播、亞臨床感染的特性，傳統(tǒng)方法診斷困難。在2007年由農業(yè)部科技司和獸醫(yī)局立項的農業(yè)公益性科技研究?？铐椖俊半u白血病學的流行病學調查和防控示范性研究”實施過程中，崔治中老師進行的血清學調查結果顯示JiAB亞群和J亞群ALV感染呈陽性的雞群分別占47.9%和52.8%，個體感染率分別為3.4%和
5.7%。而據他2008年統(tǒng)計數據顯示:我國白羽肉種雞CIAV抗體陽性率達90%，REV抗體陽性率12.3%，黃羽肉種雞抗體陽性率90%，REV抗體陽性率36.8%。并且在200份病料樣品中，ALV、CAV、REV單獨或協(xié)同感染的檢出率達10%_6.5%。這一結果表明，上述三種免疫抑制病在我國雞群中相當普遍。由于ALV、CIAV、REV及其制備物在滅活的同時其免疫原性會遭到不同程度的破壞，培育無致病性的弱毒株亦未取得重要進展，因此至今針對上述三種免疫抑制病仍未研制出臨床上 有實用價值的疫苗，尤其對于ALV和REV來說，由于先天性感染的雛雞具有的免疫耐受性以及這種感染的普遍性，也使的疫苗的應用前景十分暗淡，一旦種雞感染整個雞群便會同時感染，使養(yǎng)禽業(yè)損失慘重。但就目前來看更好的防控手段是及時對雞群中ALV、CIAV、REV檢測并凈化，切斷其垂直傳播的途徑，以避免該病的擴散。因此，加強便捷、快速、敏感的檢測手段的研究迫在眉睫。
[0003]現有ALV、CIAV以及REV的檢測手段也存在著各種缺陷，不能滿足高特異性、大批量的樣品檢測，而基因芯片技術在高通量和準確性等方面具有得天獨厚的優(yōu)勢。與傳統(tǒng)檢測方法相比，它可以在I張芯片同時對多個樣品進行多種疾病的檢測；無需機體免疫應答反應，能及早診斷，待測樣品用量?。荒軝z測病原微生物的耐藥性和亞型；極高的靈敏度和可靠性；自動化程度高，利于大規(guī)模推廣應用。這些特點可使獸醫(yī)工作者在短時間內掌握大量的疾病診斷信息。應用基因芯片不僅可以提高疾病診斷的效率，而且可以診斷出疾病的具體類型、發(fā)病階段、嚴重程度和愈后指示。
[0004]因此本課題擬研究開發(fā)檢測ALV、CAV、REV的基因芯片，能達到同步檢測上述三種雞免疫抑制病、并可同步區(qū)分ALV E亞群和J亞群的檢測方法，為我國雞免疫抑制病的凈化與控制提供技術支撐；為大批量樣品的檢測和大面積的流行病學調查提供快速、平行、靈敏的檢測手段。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明針對上述領域的空白和需要，提供一種檢測雞三種免疫抑制病病毒的基因芯片、試劑盒及方法，能夠同時檢測ALV、CAV、REV這三種病毒并可以同時區(qū)分ALV的A、C、D和J亞群，為正確防治疫病提高效率、節(jié)約時間。
[0006]一種檢測雞三種免疫抑制病病毒的基因芯片，其特征在于:在芯片基質上設置有雞淋巴白血病病毒ALV的四個亞群A亞群、C亞群、D亞群和J亞群、雞傳染性貧血病毒CAV、禽網狀內皮增生癥病毒REV的特異性探針序列，所述特異性探針序列如下: [0007]雞淋巴白血病病毒A 亞群(Al )，TTTTTTTGTCTCAGGGGGAGGCCACACGGTTTCTC ；
[0008]雞淋巴白血病病毒A 亞群(A2)，TTTTGGTTGGTCTAGACAGGAGGCCACGCGGTTTC ；
[0009]雞淋巴白血病病毒A 亞群(A3)，TTTTGGATGGACTAGACAGGAAGCCACACGGTTCC ；
[0010]雞淋巴白血病病毒A 亞群(A4)，TTTTTGCTTTCAGATTGGTCCAGGCCGCAACTCAC ；
[0011]雞淋巴白血病病毒C 亞群(Cl)，TTTTGGATGTGTATATTTCGCCCCAAGGGCCACTG ；
[0012]雞淋巴白血病病毒D 亞群(Dl)，TTTTTTTTGGCCGGGAAGAGGTGACACACATCCTC ；
[0013]雞淋巴白血病病毒C 亞群(J3 )，TTCTTAGTCTACAGTCAGCGACCTCGCCATTCCGC ；
[0014]雞淋巴白血病病毒C 亞群(J4 )，CTTAGTCTACAGTCAGCTACCTCTCCCTTCCGCAC ；
[0015]雞傳染性貧血病病毒(CAV)，TTTTTTTTTGGGCAGTGAATCGGCGCTTAGCCG；
[0016]網狀內皮增生癥病毒(REV), TTTTTTTTTCTTGCTCGGGGTCGCCGTCCTACA。
[0017]一種檢測雞三種免疫抑制病病毒的基因芯片試劑盒，其特征在于包括如下組件:
[0018](I)上述基因芯片；
[0019](2)七條引物:
[0020]雞淋巴白血病病毒ALV的A、C、D、J四個亞群通用上游引物J-U:
[0021]5， -GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3，；
[0022]J 亞群下游引物 J-L: 5 ’ -CGAACCAAAGGTAACACACG-3 ；
[0023]A、C 和 D 亞群通用下游引物 Tong: 5’ -CTGTAGCCATATGCACC-3’ ；
[0024]CAV 上游引物 C-U: 5 ’ -ACATACCGGTCGGCAGTAGG-3，；
[0025]CAV 下游引物 C-L: 5 ’ -AGCTCGCTTACCCTGTACTC-3，；
[0026]REV 上游引物 R-U: 5 ’ -CTACGGATTCAGTCCGGATC-3，；
[0027]REV 下游引物 R-L: 5 ’ -CATACTGAGCCAATGGTTGTA-3 ’ ；
[0028]且J-L、Tong、C-L與R-L的5，端有Cy3熒光標記。
[0029]所述的基因芯片試劑盒，還包括除通用引物和DNA探針之外的PCR擴增所需試劑、雜交液、芯片洗液。
[0030]所述雜交液的成分為:3XSSC溶液，25%甲酰胺，0.2%SDS，5 XDenhardt溶液。
[0031]所述芯片洗液包括洗液A和洗液B ;洗液A的配方為2XSSC，0.2%SDS ;洗液B為0.2XSSC0
[0032]所述基因芯片試劑盒，還包括PCR陰性對照模板和陽性對照模板，所述陰性對照模板為雙蒸水，所述陽性對照模板為CAV參考毒株CUX的質粒DNA。
[0033]上述任一所述的基因芯片試劑盒，所述七條引物混合存放在兩個引物管中，；兩個引物管中的引物及其混合濃度比例為:J-U: J-L: Tong=5:2:3 ； (C-U+C-L): (R-U+R-L) =1:3
[0034]一種檢測雞三種免疫抑制病病毒的基因芯片檢測方法，包括如下步驟:
[0035](I)提取待測毒株的基因組DNA，
[0036](2)用如下引物對待測毒株的基因組DNA進行PCR擴增，
[0037]J-U:5，-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3，；
[0038]J-L: 5，-CGAACCAAAGGTAACACACG-3 ；
[0039]Tong:5’-CTGTAGCCATATGCACC-3’ ；
[0040]C-U:5，-ACATACCGGTCGGCAGTAGG-3，；
[0041 ] C-L: 5，-AGCTCGCTTACCCTGTACTC-3，；
[0042]R-U:5’-CTACGGATTCAGTCCGGATC-3’ ；
[0043]R-L:5’-CATACTGAGCCAATGGTTGTA-3’ ；
[0044]所述J-L、Tong、C-L與R-L的5’端有Cy3熒光標記；
[0045]所述PCR擴增分為兩組分別進行，
[0046]其中一組PCR擴增采用以下混合引物:其中引物濃度比J-U:J-L:Tong=5:2:3 ；
[0047]另一組PCR擴增采用以下混合引物:其引物濃度比為:C-U+C-L:R-U+R-L=1:3。
[0048](3)擴增產物與上述基因芯片雜交，
[0049](4)雜交后處理及掃描結果。
[0050]所述PCR擴增的體系為2 XPCR mix25 μ 1，模板DNA3 μ I，10 μ mol/L混合引物7~8 μ I,加無菌雙蒸水至50 μ I ；
[0051]PCR 反應條件 95°C，5min ；95°C 50S，56°C 50S，72°C lmin，30 個循環(huán)；72°C IOmin0
[0052]在步驟(2)前，先對所述基因芯片進行如下預處理:置于37°C濕盒內固定12h，用雙蒸水清洗3次，在封閉液中封閉5分鐘后離心甩干，4°C保存?zhèn)溆?，所封閉液的配方為:0.75%PBS 溶液，25% 乙醇，0.2%NaBH4 ；
[0053]步驟(2)中以人工合成的ALV的A C D J亞群、REV的質粒DNA、CAV參考毒株CUX的質粒DNA做為陽性對照模板，以雙蒸水做為陰性對照模板；
[0054]所述雜交指:向雜交盒內加入300 μ L雙蒸水，將所述基因芯片放入雜交盒內；將PCR擴增產物與雜交液以體積比7:8混勻，95°C變性5min后馬上冰浴5min，取15 μ I變性后的混合液轉移至所述基因芯片反應區(qū)，基因芯片連同雜交盒置于42°C濕潤條件下雜交過夜；
[0055]所述雜交后處理指:雜交后的基因芯片依次在洗液A:2XSSC、0.2%SDS中于42°C洗滌2min，重復洗片2次；洗液B:0.2 X SSC中于42 V洗潘2min，重復洗片3次。
[0056]本發(fā)明提供一種能夠同時檢測雞三種免疫抑制病病毒的基因芯片，包括該基因芯片的試劑盒，以及利用該試劑盒或者基因芯片檢測雞三種免疫抑制病的方法。
[0057](一)本發(fā)明的基因芯片制作過程及優(yōu)點如下:從Genbank收集CAVREV ALV的A、C、D和J四個亞群各參考毒株的cDNA全基因或包含env高變異區(qū)域的基因序列共459條，分別對459條序列按CAV REV ALV三種病毒建庫，選出每種病毒的代表序列各10條，用DNAStar軟件的Clustal W程序對所選的序列進行比對，找出它們的保守區(qū)和變異區(qū)。截取所需的目的序列，送上海生工生物公司合成目的序列，經測序結果無誤。利用Oiigoe軟件，在變異區(qū)對每種病毒的序列數據庫設計各自的種特異性探針，共設計了針對上述三種病毒的10條特異性探針；借助Primer Premier5.0軟件在設計出上述10條候選探針序列的高變異區(qū)域外側的保守區(qū)設計了 7條引物，即擴增ALV A、C、D、J的一條通用上游引物，一條J亞群下游引物，一條A、C、D和J亞群通用下游引物；擴增CAV的上下游引物；擴增REV的上下游引物，上述引物均能夠對所擴增病毒進行特異性地擴增。引物序列見表3。
[0058]利用上述引物對三種病毒的參考毒株的目的DNA序列的合成質粒進行PCR擴增，然后將PCR產物分別與雜交液混勻后與點有10條特異性探針的基因芯片雜交、掃描及結果分析。探針序列見表2。對掃描結果進行取值，對含有非特異性熒光信號的探針進行閾值設定，結合閾值來判定熒光信號是否為特異性雜交信號。
[0059]本發(fā)明選取的特異性探針能特異地檢測出屬于同一亞群的菌株，如表1中沒有帶星號的菌株也能被這些特異性探針捕獲出來，本發(fā)明的基因芯片可檢測的范圍包括CAV、REV以及ALVA、C、D、J四個亞群下的任一菌株，集實用性與高效性于一身，可用于高通量地檢測ALV、CAV、REV感染情況，為高效率檢測或鑒別疫情提供了最關鍵的方法。
[0060](二)本發(fā)明還提供一種檢測雞三種免疫抑制病病毒的試劑盒，該試劑盒的特征在于包含有本發(fā)明提供的上述基因芯片和引物。該試劑盒在具備芯片掃描儀的分子生物學實驗室條件下，可方便快捷地檢測待測雞群的CAV、REV以及ALV A、C、D、J亞群的感染狀況，作為優(yōu)選，在試劑盒中還可以包括除芯片和引物之外的PCR試劑和雜交液，使得該試劑盒更便于使用。試劑盒中還包括三種病中的任意一種病毒的含有目的基因的載體質粒DNA作為PCR陽性對照模板，用于排除假陰性；雙蒸水為陰性模板，用于排除污染造成的假陽性。[0061](三)本發(fā)明還提供了檢測雞三種免疫抑制病病毒的檢測方法，該方法主要特征在于采用本發(fā)明提供的基因芯片及引物。7條引物將待測毒株模板進行擴大若干倍，從而提高了毒株的檢出靈敏度，同時本研究中還采取了多重PCR體系對上述三種病毒進行同時擴增，檢測過程既簡便又靈敏。
[0062]本發(fā)明提供的優(yōu)化方案是:分別對所有引物對中的下游引物的5’端進行熒光標記，引物濃度比為J-U:J-L:Tong=5:2:3 ；C-U+C-L:R-U+R-L=l: 3 ;上述引物以多重PCR體系對待測模板進行擴增，多重PCR的目的是通過在一個體系中加入多條引物，從而能同時擴增出不同病毒的目的序列，為在臨床檢測中對ALV、CEV、REV的檢測以及對ALV的分型提高效率。
[0063]為了提高芯片雜交的準確性，排除假陽性或假陰性，芯片上點有陽性對照探針、陰性對照探針。
[0064]綜上所述本發(fā)明提供了一種檢測雞三種免疫抑制病病毒的基因芯片，同時提供了試劑盒與優(yōu)化的檢測方法，能針對多種病原進行高通量、快速、準確的檢測，適合于突發(fā)傳染病病原檢驗，提供的試劑盒使檢測方法簡便高效，使獸醫(yī)實驗室工作人員能在較短的時間內對感染性疾病做出正確診斷，防止傳染性疾病傳播，提高我國對動物感染性疾病的控制能力，降低養(yǎng)殖風險。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0065]圖1:基因芯片對三種病毒檢測的有效性評價結果。[0066]I:CAV毒株；2:REV毒株；3:ALV A亞群毒株；4:ALV C亞群毒株；5:ALV D亞群毒株；6:ALV J亞群毒株。
[0067]圖2:基因芯片對多重PCR產物的檢測評價結果。
[0068]I:ALV C+J毒株DNA模板等體積混合；2:ALV A+D毒株DNA模板等體積混合；3:REV PCR產物與ALV A+DPCR產物等體積混合；4:REV+CAV質粒DNA模板等體積混合。圖3:基因芯片敏感性檢測評價結果。
[0069]4-1:M:Marker, 1-5:ALV A亞群毒株DNA模板起始濃度的10-2~10-6倍稀釋；4_2:M:Marker, 1-6:ALV C亞群毒株DNA模板起始濃度的ICT2~ICT7倍稀釋;4_3:M:Marker,1-3:ALV D亞群毒株DNA模板起始濃度的10-2~10-4倍稀釋；4_4:M:Marker, 1-6:ALV J亞群毒株DNA模板起始濃度的Kr2~1(Τ倍稀釋。4-5:M:Marker, 1-7:REV毒株DNA模板起始濃度的10_2~10_8倍稀釋；4-6:M:Marker, 1-4:CAV毒株模板起始濃度的10_2~10_5倍稀釋。
[0070]圖4:瓊脂糖凝膠電泳敏感性檢測評價結果。
[0071]A1-A5:ALV A亞群毒株DNA模板起始濃度的10-2~10-6倍稀釋；C1_C6:ALV C亞群毒株DNA模板起始濃度的10_2~10_7倍稀釋；D1-D3:ALV D亞群毒株DNA模板起始濃度的10_2~10_4倍稀釋；J1-J6:ALV J亞群毒株DNA模板起始濃度的10_2~10_7倍稀釋；R1_R7:REV毒株DNA模板起始濃度的10_2~10_8倍稀釋；CA1_CA4:CAV毒株模板起始濃度的10_2~10_5倍稀釋。 [0072]圖5:基因芯片特異性檢測評價結果。
[0073]I:REV PCR產物與ALV A+DPCR產物等體積混合；2:傳染性法氏囊病病毒(IBDV)；3:雞馬立克氏病病毒(MDV) ；4:雞胚成纖維細胞；5 =DF-1細胞。
【具體實施方式】
[0074]主要試劑
[0075]DNA及RNA提取試劑盒均購自QIAGEN公司。
[0076]質粒小提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司產品。
[0077]PCR Mix 購自 GenStar 公司。
[0078]瓊脂糖凝膠染料Goldview購自北京賽百盛基因技術有限公司。
[0079]醛基片購自博奧生物科技有限公司。
[0080]甲酰胺、SDS、硼氫化鈉、50XDenhardt均購自北京希爾誠興業(yè)科技有限公司。
[0081]主要儀器設備
[0082]PCR儀、Power-PAC200電泳儀和Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)均為BioRad公司產
品O
[0083]制冰機為Grant公司產品。
[0084]5415D臺式離心機和5804R臺式冷凍離心機均為Eppendorf公司產品。
[0085]芯片點樣儀Personal Arrayerl6為博奧生物有限公司產品。
[0086]芯片雜交儀Bio Mixer II為博奧生物有限公司產品。
[0087]芯片洗干儀Slide Washer8為博奧生物有限公司產品。
[0088]微陣列芯片掃描儀Lux ScanlOK-A為博奧生物有限公司產品。[0089]生物材料的來源或記載出處:
[0090]NX0101毒株的來源:為已知毒株，記載在申請日之前的文獻中。本發(fā)明所用的由山東農大崔治中老師惠贈。
[0091]RAV-1毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所:
[0092]雞傳染性貧血病毒(CIAV)、網狀內皮增生病病毒(REV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、雞馬立克氏病病毒(MDV)均為已知毒株，記載在申請日之前的文獻中，本實驗室有保存。
[0093]引物設計所依據的序列的選取
[0094]REV以及ALV的A、C、D、J四個亞群共11個參考毒株的cDNA全序列均由美國國家生物技術信息中心(NCBI)基因庫下載(見表1)，截取目的序列，由上海生工生物公司合成。
[0095]J亞群NX0101毒株接種于DF-1細胞上，用QIAGEN公司的DNA提取試劑盒提取cDNA。
[0096]CAV組織毒由本試驗保存，用QIAGEN公司的DNA提取試劑盒提取DNA。
[0097](表1)。
[0098]表1.本試驗使用的參考毒株
[0099]
【權利要求】
1.一種檢測雞三種免疫抑制病病毒的基因芯片，其特征在于:在芯片基質上設置有雞淋巴白血病病毒ALV的四個亞群A亞群、C亞群、D亞群和J亞群、雞傳染性貧血病毒CAV、禽網狀內皮增生癥病毒REV的特異性探針序列，所述特異性探針序列如下: 雞淋巴白血病病毒 A 亞群(Al)，TTTTTTTGTCTCAGGGGGAGGCCACACGGTTTCTC ； 雞淋巴白血病病毒 A 亞群(A2)，TTTTGGTTGGTCTAGACAGGAGGCCACGCGGTTTC ； 雞淋巴白血病病毒 A 亞群(A3)，TTTTGGATGGACTAGACAGGAAGCCACACGGTTCC ； 雞淋巴白血病病毒 A 亞群(A4)，TTTTTGCTTTCAGATTGGTCCAGGCCGCAACTCAC ； 雞淋巴白血病病毒 C 亞群(Cl)，TTTTGGATGTGTATATTTCGCCCCAAGGGCCACTG ； 雞淋巴白血病病毒 D 亞群(Dl)，TTTTTTTTGGCCGGGAAGAGGTGACACACATCCTC ； 雞淋巴白血病病毒 C 亞群(J3)，TTCTTAGTCTACAGTCAGCGACCTCGCCATTCCGC ； 雞淋巴白血病病毒 C 亞群(J4)，CTTAGTCTACAGTCAGCTACCTCTCCCTTCCGCAC ； 雞傳染性貧血病病毒(CAV)，TTTTTTTTTGGGCAGTGAATCGGCGCTTAGCCG ； 網狀內皮增生癥病毒(REV), TTTTTTTTTCTTGCTCGGGGTCGCCGTCCTACA。
2.一種檢測雞三種免疫抑制病病毒的基因芯片試劑盒，其特征在于包括如下組件: (1)權利要求1所述的基因芯片； (2)七條引物: 雞淋巴白血病病毒ALV的A、C、D、J四個亞群通用上游引物J-U:
5， -GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3，； J 亞群下游引物 J-L:5’ -CGAACCAAAGGTAACACACG-3 ； A、C 和 D 亞群通用下游引物 Tong: 5’ -CTGTAGCCATATGCACC-3’ ；
CAV 上游引物 C-U: 5 ’ -ACATACCGGTCGGCAGTAGG-3，； CAV 下游引物 C-L:5’ -AGCTCGCTTACCCTGTACTC-3，；
REV 上游引物 R-U: 5 ’ -CTACGGATTCAGTCCGGATC-3，；
REV 下游引物 R-L:5’ -CATACTGAGCCAATGGTTGTA-3’ ； 且J-L、Tong、C-L與R-L的5，端有Cy3熒光標記。
3.根據權利要求2所述的基因芯片試劑盒，還包括除通用引物和DNA探針之外的PCR擴增所需試劑、雜交液、芯片洗液。
4.根據權利要求3所述的基因芯片試劑盒，所述雜交液的成分為:3XSSC溶液，25%甲酰胺，0.2%SDS，5 X Denhardt 溶液。
5.根據權利要求3所述的基因芯片試劑盒，所述芯片洗液包括洗液A和洗液B;洗液A的配方為 2 X SSC, 0.2%SDS ;洗液 B 為 0.2 X SSC0
6.根據權利要求2所述的基因芯片試劑盒，還包括PCR陰性對照模板和陽性對照模板，所述陰性對照模板為雙蒸水，所述陽性對照模板為CAV參考毒株CUX的質粒DNA。
7.根據權利要求2~6任一所述的基因芯片試劑盒，所述七條引物混合存放在兩個引物管中，；兩個引物管中的引物及其混合濃度比例為J-U:J-L:Tong=5:2:3 ;(C-U+C-L):(R-U+R-L) =1:3。
8.一種檢測雞三種免疫抑制病病毒的基因芯片檢測方法，包括如下步驟: (1)提取待測毒株的基因組DNA， (2)用如下引物對待測毒株的基因組DNA進行PCR擴增，J-U:5’ -GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3’ ；
J-L:5， -CGAACCAAAGGTAACACACG-3 ；
Tong:5’-CTGTAGCCATATGCACC-3’ ；
C-U:5’ -ACATACCGGTCGGCAGTAGG-3’ ；
C-L:5’ -AGCTCGCTTACCCTGTACTC-3’ ；
R-U:5’ -CTACGGATTCAGTCCGGATC-3’ ；
R-L:5’ -CATACTGAGCCAATGGTTGTA-3’ ； 所述J-L、Tong、C-L與R-L的5’端有Cy3熒光標記； 所述PCR擴增分為兩組分別進行， 其中一組PCR擴增采用以下混合引物:其中引物濃度比J-U:J-L:Tong=5:2:3 ； 另一組PCR擴增采用以下混合引物:其引物濃度比為:C-U+C-L:R-U+R-L=1:3。 (3)擴增產物與權利要求1所述的基因芯片雜交， (4)雜交后處理及掃描結果。
9.根據權利要求8所述的方法，所述PCR擴增的體系為2XPCRπ?Χ25μ1，模板DNA3 μ 1,10 μ mol/L混 合引物7~8 μ I,加無菌雙蒸水至50 μ I ; PCR 反應條件 95°C，5min ;95°C 50S，56°C 50S，72°C lmin，30 個循環(huán)；72°C IOmin0
10.根據權利要求8或9所述的方法，在步驟(2)前，先對所述基因芯片進行如下預處理:置于37°C濕盒內固定12h，用雙蒸水清洗3次，在封閉液中封閉5分鐘后離心甩干，4°C保存?zhèn)溆?，所封閉液的配方為:0.75%PBS溶液，25%乙醇，0.2%NaBH4 ； 步驟(2)中以人工合成的ALV的A C D J亞群、REV的質粒DNA、CAV參考毒株CUX的質粒DNA做為陽性對照模板，以雙蒸水做為陰性對照模板；所述雜交指:向雜交盒內加入300 μ L雙蒸水，將所述基因芯片放入雜交盒內；將PCR擴增產物與雜交液以體積比7:8混勻，95°C變性5min后馬上冰浴5min，取15 μ I變性后的混合液轉移至所述基因芯片反應區(qū)，基因芯片連同雜交盒置于42°C濕潤條件下雜交過夜；所述雜交后處理指:雜交后的基因芯片依次在洗液A:2XSSC、0.2%SDS中于42°C洗滌2min，重復洗片2次；洗液B:0.2 X SSC中于42V洗潘2min，重復洗片3次。
【文檔編號】C12R1/93GK103667538SQ201310728530
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月25日 優(yōu)先權日:2013年12月25日
【發(fā)明者】楊兵, 蘇霞, 陳小玲, 徐福州, 周宏專, 王金洛, 朱瑞豪, 楊麗聰 申請人:北京市農林科學院