一種藏麻黃抗a型流感病毒活性部位的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物提取物技術領域，具體涉及一種藏麻黃抗A型流感病毒活性部位 及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 目前，現(xiàn)代醫(yī)學針對病毒性傳染病的防治，主要以抗病毒藥物及特異性疫苗的研 制與應用為主，已取得較好成績。然而多數(shù)病毒性疾病至今尚無特效藥物，而能夠應用疫苗 進行防治的病毒性疾病也很少。同時由于病毒的變異也使有些疫苗的臨床效果受到一定影 響。抗病毒藥在某種意義上說只是病毒抑制劑，不能直接殺滅病毒和破壞病毒體，否則也會 損傷宿主細胞。抗病毒藥的作用在于抑制病毒的繁殖，使宿主免疫系統(tǒng)抵御病毒侵襲，修復 被破壞的組織，或者緩和病情使之不出現(xiàn)臨床癥狀。至今，某些病毒性疾病如脊髓灰質炎和 狂犬病還沒有抗病毒治療藥，只能靠疫苗預防，一旦錯過防疫期，后果十分嚴重。因此，迄今 為止，這類疾病仍然是醫(yī)學界感到棘手的一類疾病。盡管中醫(yī)藥、藏醫(yī)藥還未發(fā)現(xiàn)有特效殺 滅病毒的單味藥或復方，但是通過辨證治療，已在某些病毒性疾病的治療(如艾滋病、病毒 性感冒與麻瘆、乙型病毒性肝炎）方面顯示出一定的優(yōu)勢。在2003年的SARS治療過程中， 包括中醫(yī)藥、藏醫(yī)藥在內(nèi)的民族傳統(tǒng)醫(yī)藥以其獨特的療效引起世界的關注，并得到世界衛(wèi) 生組織（WHO)專家的肯定。因此，中醫(yī)藥、藏醫(yī)藥治療病毒性疾病值得深入研宄與探討。截 至目前，我國在研的抗病毒新藥包括已獲臨床試驗批準文號的新藥和正在開展臨床研宄的 新藥，其品種有：抗流感病毒新藥阿比朵爾及片劑和膠囊，鹽酸金剛乙胺糖漿劑，抗乳頭瘤 狀病毒藥咪喹莫特及其乳膏，更昔洛韋眼凝膠，鹽酸伐昔洛韋滴眼液和顆粒劑等。
[0003] 流感病毒為正黏病毒科RNA病毒，根據(jù)其核蛋白（NP)和膜基質蛋白M抗原性不同 可分為甲（A)、乙（B)、丙（C) 3型。A型流感病毒亦稱甲型流感病毒，病毒極小，直徑約100 納米，主要在冬季流行。A型流感病毒攻擊力很強，原因是其表面密布兩種武器，病毒感染生 物后能夠迅速增殖，這就是血細胞凝集素（H)和神經(jīng)氨酸苷酶（N)兩種蛋白質。種類多樣的 A型流感病毒可以從野生動物傳給家畜家禽等，在雞、鴨、豬等身上廣泛傳播。這些家畜家 禽攜帶的病毒如果發(fā)生基因變異，獲得在人群中傳染的能力，會對人類造成巨大危害。
[0004] 現(xiàn)有治療A型流感病毒的藥物中雖然涉及了采用麻黃科植物的提取物治療流感 的設計，但存在以下問題：首先現(xiàn)有的麻黃科植物的提取物對于A型流感病毒的治療效果 不理想，不具有較強的針對性，其原因是麻黃科植物提取物中成分復雜，其真正起到治療A 型流感病毒的活性部位含量極低，制成藥物后對A型流感病毒的治療不具備針對性。其次， 現(xiàn)有技術中藏麻黃中治療A型流感病毒的活性部位活性不明，提取方法不明，導致現(xiàn)有的 提取純化手段獲得產(chǎn)物抗A型流感病毒的活性較低，或者在多次提取時活性數(shù)據(jù)不穩(wěn)定， 無法推廣生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術問題是：針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供一種藏麻黃抗A型 流感病毒活性部位的制備方法及其應用，該方法可提取獲得具有高抗A型流感病毒活性的 活性部位，并且方法簡便，提取量較大，并且可應用于制備片劑、微丸劑或粉針劑，使對A型 流感病毒的治療更具有針對性，提高對A型流感病毒的治療效果。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：該藏麻黃抗A型流感病毒活性部位的制備方 法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 采集藏麻黃全株，陰干，粉碎，過60~80目篩，得藏麻黃藥材粗粉； 2) 加入體積百分數(shù)90 ~95%的乙醇水溶液至浸沒藏麻黃藥材粗粉，在55~60°C水浴 條件下回流提取l~2h，抽濾得濾液及濾渣；取濾渣并重復以上操作兩次；合并濾液、減壓濃 縮，得浸膏粗品； 3) 浸膏粗品加水溶解，超聲30~40min，制成乳懸液；乳懸液置于分液漏斗中，按乳懸液 和乙酸乙酯體積比1 :1~2的比例加入乙酸乙酯進行萃取，分液得乙酸乙酯萃取液；將乙酸 乙酯萃取液置于旋轉蒸發(fā)儀中，蒸餾、濃縮，得乙酸乙酯部位濃縮浸膏； 4) 取乙酸乙酯部位浸膏，以體積百分數(shù)90~95%的乙醇水溶液溶解，添加硅膠拌樣， 攪拌、減壓揮去溶劑；利用Flash快速色譜分離，流動相為甲醇一水，按照甲醇體積百分數(shù) 5~100%進行線性梯度洗脫，收集甲醇體積百分數(shù)65~70%的甲醇流份； 5) 將步驟4)所收集的甲醇流份減壓濃縮、干燥，即得。
[0007] 優(yōu)選的，步驟4)所述的洗脫中流動相流速為0. 5~ 2. 5mL/min。
[0008] 步驟3)所述的乙醇水溶液與乙酸乙酯部位浸膏的體積比為20~22 :1，所述的硅膠 與乙酸乙酯部位浸膏的質量比為4~5 :1。
[0009] 優(yōu)選的，步驟4)所述的Flash快速色譜分離中所用的色譜填料為粒徑lOMffl的C18 反向柱。
[0010] 優(yōu)選的，步驟5)所述的減壓濃縮、干燥的具體操作為：在壓力-5 MPa，溫度-60 °C 條件下減壓冷凍干燥。
[0011] 優(yōu)選的，步驟2)所述的抽濾具體操作為：加入體積百分數(shù)為95%的乙醇水溶液至 浸沒藏麻黃藥材粗粉，在60°C水浴條件下回流提取lh，抽濾得濾液及濾渣。
[0012] 優(yōu)選的，步驟4)具體操作為：取乙酸乙酯部位浸膏，以體積百分數(shù)95%的乙醇水 溶液溶解，添加硅膠拌樣，攪拌、減壓揮去溶劑；利用Flash快速色譜分離，流動相為甲醇一 水，按照甲醇體積百分數(shù)5~100%進行線性梯度洗脫，收集甲醇體積百分數(shù)65~68%的甲醇流 份。
[0013] 利用以上所述的制備方法制得的藏麻黃抗A型流感病毒活性部位的應用，其特征 在于：藏麻黃抗A型流感病毒活性部位用于制備抗A型流感病毒的片劑、微丸劑或粉針劑。
[0014] 對于本發(fā)明，申請人說明如下： 青藏高原具有光照時間長、晝夜溫差大、光合作用強等自然條件，使生長在青藏高原的 藥用植物不僅種類繁多，而且非常有利于有效成分的積累。植根于青藏高原的藏藥，其應用 歷史悠久，價格低廉，效果明顯，易于普及，已受到越來越多的人的歡迎。藏民族在長期與疾 病作斗爭的過程中發(fā)現(xiàn)，多種產(chǎn)自青藏高原的藥材對病毒性疾病具有很好的療效。但是，藏 藥基礎研宄薄弱，藥效不明，活性成分不清，是制約藏藥現(xiàn)代化的關鍵。申請人對記載中具 有抗病毒功效的傳統(tǒng)藏藥材進行了較全面的篩選，并通過平行序列分離技術與活性追蹤技 術相結合的研宄方法，發(fā)現(xiàn)抗病毒有效部位或有效成分，以明確其抗病毒作用，為有目的的 開發(fā)抗病毒創(chuàng)新藏藥奠定基礎。通過研宄發(fā)現(xiàn)：相比其他藏藥和麻黃科其他植物，藏麻黃中 抗A型流感病毒的活性部位，其抗病毒活性強，而細胞毒性極小，具有較大的研宄價值。
[0015] 申請人在步驟3)中曾選用各種不同極性的溶劑進行萃取，通過研宄發(fā)現(xiàn)乙酸乙 酯為抗A型流感病毒活性部位的最佳萃取劑。申請人將步驟3)中的乳懸液按極性大小依 次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，得乙酸乙酯部分，正丁醇部分，水部分。申請人通過 A型流感病毒活性篩選發(fā)現(xiàn)：相比其他不同極性的萃取劑，乙酸乙酯部分具有較高的抗A型 流感病毒活性，因此申請人在步驟3)中設計采用乙酸乙酯萃取乳懸液，以便最大限度的保 留抗A型流感病毒的活性部位。步驟2)浸膏粗品和步驟3)乙酸乙酯部位浸膏中液體所占 的質量百分比均小于1%，可以忽略不計。
[0016] 申請人在步驟4)中以甲醇一水作為流動相進行線性梯度洗脫，以便在步驟3)的 基礎上進一步分離乙酸乙酯部位浸膏中的成分，收集包含抗A型流感病毒的活性部位的甲 醇流份。申請人經(jīng)研宄發(fā)現(xiàn)：甲醇體積百分數(shù)