專利名稱：：用于抑制ⅰ型登革病毒復制的靶向小干擾rna序列的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術領域：
，尤其是涉及對于重大傳染病具有預防、治療作用的小分子藥物。
背景技術：
：登革病毒屬于黃病毒科，分為四個血清型，主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播，登革熱(denguefever，DF)禾口登革出血熱(denguehemorrhagicfever，DHF)兩禾中不同類型的急性傳染病。據(jù)WHO估計，全世界每年約發(fā)生1億例DF，50萬例DHF，導致25000人死亡，而且在亞、非、南美的熱帶地區(qū)發(fā)病率呈上升趨勢，近年在我國周邊的印度、越南、印尼及柬埔寨等地屢屢發(fā)生登革熱的大流行。廣東省自佛山市在1978年首次發(fā)生IV型DEN流行后，至2001年已發(fā)生13次登革熱暴發(fā)流行或局部流行。廣州市在90年代初發(fā)生過兩次登革熱局部流行，1995年發(fā)生I型登革熱暴發(fā)流行，疫情波及7區(qū)1縣級市，病例數(shù)達5505例。2002、2006年廣州市再度爆發(fā)登革熱，超過1000人感染。2006年全國有多個省市報告登革熱感染，可見登革熱已成為中國的一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。登革熱至今仍沒有有效的疫苗或治療藥物。新近的研究表明，RNA干擾可能是一個新的突破口。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是一種由雙鏈RNA(dsRNA)介導的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制，從線蟲到人類細胞中都廣泛存在。外源導入的dsRNA被Dicer酶切割成2125nt的小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，siRNA與體內(nèi)其他成分聚合形成RNA誘導的基因沉默復合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，通過堿基配對原理來切割與siRNA具有同源序列的轉(zhuǎn)錄體，最終導致特異的基因沉默效應。目前RNAi技術發(fā)展十分迅速，不僅已成為研究基因功能、開發(fā)基因治療藥物的有力工具，還作為宿主細胞抑制病毒復制、清除病毒的一種胞內(nèi)機制，被廣泛用于抗病毒感染的研究領域。利用RNAi技術特異性地抑制HIV、HCV、HBV、脊髓灰質(zhì)炎病毒和流感病毒的復制及蛋白表達都取得了初步成功，甚至也能有效地抑制SARS冠狀病毒在VeroE6細胞中的復制。由于RNAi具有高效性、高特異性、低細胞毒性的優(yōu)點，被認為是抗病毒治療的新希望。利用RNAi抑制登革病毒復制的研究在國外尚處于起步階段，在國內(nèi)則未見文獻報道。國外Adelman等(JVirol.2002;76:12925)利用與II型登革病毒PrM基因同源的290bp的dsRNA轉(zhuǎn)入C6/36蛟細胞，發(fā)現(xiàn)可以抑制登革病毒的復制；而將與登革病毒C、PrM及NS5基因同源的240290bp長度的dsRNA注入成蛟，可以保護成蛟免受登革病毒感染。但是該技術存在以下缺陷(1)真正發(fā)揮RNAi作用的不是dsRNA，而是dsRNA的裂解產(chǎn)物，2125nt長度的siRNA混合物，該技術利用290bp長度的dsRNA作為藥物，但真正發(fā)揮作用的siRNA序列未知；(2)長度超過30個堿基對的雙鏈RNA導入哺乳動物細胞會誘導干擾素的合成，表現(xiàn)出廣泛的非特異性阻抑效應，導致細胞凋亡，該技術利用290bp長度的dsRNA作為藥物，無法在實驗研究和臨床中應用于哺乳動物；3(3)290bp長度的dsRNA體外合成難度大，成本高，難以進一步推廣；(4)該技術針對的是II型登革病毒，對I型登革病毒的作用未知，但國內(nèi)自1995年以來造成流行的為I型登革病毒，因此該技術對國內(nèi)的登革熱防治工作影響有限。因此，本發(fā)明以達到在C6/36細胞中高效抑制登革病毒復制的目的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是直接從I型登革病毒基因中設計合成并篩選得到一段小干擾RNA序列即siRNA序列，達到抑制登革病毒復制、保護細胞不被登革病毒破壞的功能。本發(fā)明所述的用于抑制I型登革病毒復制的靶向小干擾RNA序列，即siRNA序列，為雙鏈分子，有21個堿基配對，正義鏈的序列為SEQIDNO.l，反義鏈的序列為SEQIDNO.1。正義鏈5'-AACGGAACCAGAUGACGUUGA-3'SEQIDNO.1負義鏈5'-UCAACGUCAUCUGGUUCCGUU-3'SEQIDNO.2發(fā)明人根據(jù)2002年廣州市I型登革病毒流行株GZ02-218(GenBank登錄號EF079826)、GenBank中I型登革病毒參考株(GenBank登錄號NC001477)及其它I型登革病毒基因序列，按以下原則在病毒基因組不同位置設計IO段siRNA序列，每段均為21對核苷酸A.緊接連續(xù)的2個A堿基；B.G、C堿基含量在30X50%;C.不多于連續(xù)4個T堿基；D.與宿主細胞無同源性；E.盡量選擇在I型登革病毒中保守的序列。經(jīng)篩選，獲得上述的一段21對核苷酸的siRNA序列(代號DenSi-1)。根據(jù)所設計的序列，由美國Ambion公司用化學方法合成相應的siRNA片段，并用PAGE電泳純化；然后通過實驗評價siRNA對登革病毒在蚊細胞C6/36細胞中復制的抑制作用，以及對C6/36細胞的保護作用。(3)效果評價培養(yǎng)C6/36細胞，分為以下三組正常組不添加任何試劑，也不用登革病毒攻擊；對照組不添加任何試劑，僅用登革病毒攻擊；siRNA組用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染合成的siRNA，以登革病毒攻擊。觀察各組以下指標，包括A.細胞學檢測細胞形態(tài)病變和MTT實驗；B.抗原檢測間接免疫熒光實驗C.核酸檢測熒光定量PCR本發(fā)明所述的用于抑制I型登革病毒復制的靶向小干擾RNA序列，具有以下特點和優(yōu)點(1)本發(fā)明成功設計并驗證了一段針對I型登革病毒的靶向性siRNA序列，根據(jù)該序列合成的siRNA具有抑制登革病毒復制、保護細胞不被登革病毒破壞的功能。目前國內(nèi)外尚無類似報道。(2)本發(fā)明首次采用長度僅21nt的siRNA來作為針對I型登革病毒的靶向性序列，并通過實驗獲得了一段效果較好的靶向性siRNA序列。該21nt雙鏈RNA導入哺乳動物細胞不會誘導干擾素的合成，因此可在實驗研究和臨床中應用于哺乳動物；(3)本發(fā)明所述的靶向性siRNA序列合成方便，成本低，便于推廣。(4)本發(fā)明所述的靶向性siRNA序列是針對國內(nèi)流行的I型登革病毒，對國內(nèi)的登革熱防治具有重要意義。圖1顯示了正常組、對照組、siRNA組這三組細胞形態(tài)病變情況。圖2顯示了MTT法檢測正常組、對照組、siRNA組這三組活細胞數(shù)的情況。圖3顯示了免疫熒光法檢測正常組、對照組、siRNA組這三組細胞內(nèi)登革病毒抗原的情況。圖4顯示了熒光定量PCR法檢測正常組、對照組、siRNA組這三組各組細胞內(nèi)登革病毒核酸量的情況。具體實施例方式1、試劑與儀器I型登革病毒流行株GZ02-218，來源于2002年登革熱疫情中分離所得，由廣州市疾病預防控制中心病毒免疫科保存(GenBank登錄號EF079826)。白蛟伊蛟C6/36細胞株，購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)(貨號CRL-1660)，由廣州市疾病預防控制中心病毒免疫科傳代并保存。QIAGEN公司HiPerFectTransfectionReagent轉(zhuǎn)染試劑盒、QIAampViralRNA提取試劑盒；深圳太太基因有限公司登革1型病毒實時熒光RT-PCR試劑盒；SIGMA公司登革I型病毒鼠抗人單克隆抗體及熒光標記兔抗鼠IgG抗體，GIBCO公司MEM細胞培養(yǎng)基、雙抗，廣州蕊特生物科技有限公司新生牛血清。其它試劑均為分析純。C印heid公司smartcyclerII多程序?qū)崟r熒光定量PCR儀，ZEISS公司AxiocamHRC熒光顯微鏡，E卯endorf公司Centrifuge5417R高速冷凍離心機。2、siRNA設計與合成根據(jù)2002年廣州市I型登革病毒流行株GZ02-218(GenBank登錄號EF079826)、GenBank中I型登革病毒參考株(GenBank登錄號NC001477)及其它I型登革病毒基因序列，設計以下一段21對核苷酸的siRNA序列(代號DenSi-l):正義鏈5'-AACGGAACCAGAUGACGUUGA-3'負義鏈5'-UCAACGUCAUCUGGUUCCGUU-3'根據(jù)設計的序列，交由美國Ambion公司用化學方法合成相應的siRNA片段，并用PAGE電泳純化。3、siRNA轉(zhuǎn)染白蛟伊蛟C6/36細胞轉(zhuǎn)染前一天接種C6/36細胞至24孔板，細胞計數(shù)1X106個/孔，每孔0.5ml含10%新生牛血清MEM培養(yǎng)液。將其平均分為三組正常組、siRNA組和對照組。待細胞長成單層，5融合度達到80%90%時，對siRNA組細胞進行轉(zhuǎn)染。具體操作步驟如下(1)取無菌且去RNA酶的潔凈EP管，做好標記，每管加入200ul無血清MEM培養(yǎng)液；(2)將1.0ug的siRNA溶解在各管培養(yǎng)液中，再分別加入3ul轉(zhuǎn)染試劑HiPerFectTransfectionReagent,振蕩混勻，室溫靜置10分鐘；(3)siRNA組C6/36細胞吸去培養(yǎng)液后，用PBS洗2次，然后加入轉(zhuǎn)染液200ul/孑L。正常組及對照組細胞則加入無血清MEM培養(yǎng)液200ul/孔。輕輕晃勻使液體均勻覆蓋各孔。置于28°C、2.5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)46小時。4、登革病毒攻擊白蛟伊蛟C6/36細胞(1)在P2實驗室中進行操作；(2)將GZ02-218病毒原液稀釋10倍；(3)轉(zhuǎn)染46小時后的C6/36細胞吸去轉(zhuǎn)染液，加入稀釋后的病毒液200ul/孔，33°C、3%C02吸附1小時；(4)吸去病毒液，加入含2X血清的MEM維持液1ml/孔，置于33°C、3%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。5、細胞形態(tài)變化觀察每日觀察細胞病變情況，當細胞出現(xiàn)以下表現(xiàn)時為細胞病變細胞融合腫脹，細胞數(shù)目減少，并逐日加劇。如果siRNA發(fā)揮了干擾作用，則對C6/36細胞具有保護作用，實驗組將不出現(xiàn)病變。比較siRNA組與正常組、對照組細胞病變差異，并拍照記錄。6、MTT法檢測siRNA對白蚊伊蚊C6/36細胞的保護作用每日觀察細胞病變情況，待對照組細胞病變達到++++時，按以下步驟進行MTT法，檢測活細胞數(shù)(1)細胞吸去培養(yǎng)液，用PBS洗2次，加入無血清MEM培養(yǎng)液500ul/孔；(2)加入MTTlOOul/孔，輕輕晃勻使其均勻分布，置37°C、3%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時；(3)吸去培養(yǎng)上清液，加入匿SO1ml/孔溶解，振蕩10分鐘，酶標儀上測定0D49。的讀數(shù)；(4)計算細胞存活率，存活率=(siRNA組或?qū)φ战MOD值/正常組OD值)X100%，根據(jù)存活率繪制細胞生存曲線，以細胞存活率作為評價siRNA對C6/36細胞保護作用的指標。7、實時熒光定量RT-PCR檢測登革病毒RNA含量(1)樣本收集待對照組細胞病變達到++++時，收集C6/36細胞，將細胞吹打下來，于-S(TC及37t:反復凍融裂解3次。(2)RNA提取采用QIAGEN公司QIAampViralRNA提取試劑盒提取登革病毒RNA:①在潔凈的EP管中加入560ulAVL及140ul樣本，振蕩混勻15s，室溫靜置10分鐘；②加入500ul于4t:預冷的無水乙醇，振蕩混勻15s，輕微離心；③轉(zhuǎn)移液體至吸附柱中，8000rpm離心lmin，棄掉離心管，將柱子安裝于新管中；④重復步驟③；6⑤加入500ulAW1于吸附柱中，8000rpm離心lmin，棄掉離心管，將柱子安裝于新管中；加入500ulAW2于吸附柱中，14000rpm離心3min，棄掉離心管；⑦將柱子安裝于潔凈的1.5mlEP管中，加入50ul去RNA酶滅菌水，室溫靜置lmin溶解RNA，8000rpm離心lmin，所得RNA于-8(TC保存。(3)RT-PCR檢測采用深圳太太基因有限公司登革I型病毒實時熒光RT-PCR試劑盒，檢測病毒RNA含量。①擴增試劑準備從冰箱中取出PCR反應液，室溫融化并顛倒混勻，2000rpm離心10s，取出Taq酶和反轉(zhuǎn)錄酶，反應體系配制如下按每個樣本加入PCR反應液15ul+Taq酶0.5ul+反轉(zhuǎn)錄酶0.5ul計算各試劑用量，加入一適當體積的潔凈離心管中，振蕩混勻15s，輕微離心，以15u1/管分裝至各PCR反應管中；②取上述各組RNA樣本10ul加入反應管中，并按試劑盒說明分別準備陽性及陰性對照管，反應體系為25ul。各管做好標記，蓋緊管蓋，2000rpm離心10s，置于smartcyclerII多程序?qū)崟r熒光定量PCR儀中；③熒光PCR擴增及信號收集PCR反應條件如下第一步50。C30min，95。C3min，1個循環(huán)；第二步95。C5sec，60。C40sec(收集FAM熒光值)，40個循環(huán)。(4)病毒RNA含量分析PCR儀根據(jù)熒光值和循環(huán)數(shù)自動計算得出各組的Ct值，Ct值越小，表明所含登革病毒RNA量越多，Ct值減少n，則代表登革病毒RNA量增加2n倍。8、免疫熒光檢測病毒顆粒含量待對照組細胞病變達到++++時，收集各組C6/36細胞，按以下步驟用間接免疫熒光法檢測病毒顆粒含量。實驗前準備(1)免疫熒光專用玻片，95%酒精浸泡，去離子水沖洗，烘干備用；(2)0.01mol/L濃度PBS，pH7.4，含0.5%吐溫40;(3)抗體溶液:以0.01mol/L，pH7.4的PBS進行稀釋;(4)緩沖甘油分析純無熒光的甘油9份+pH9.2，0.2M碳酸鹽緩沖液l份配制；(5)可插玻片的玻璃槽一只，固定細胞用；(6)有蓋搪瓷盒一只(內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊)；(7)ZEISS公司AxiocamHRC熒光顯微鏡；(8)玻片架；(9)濾紙；(10)37。C溫箱。實驗步驟如下(1)細胞去培養(yǎng)液后用PBS洗2次，收集細胞2000rpm/min離心5分鐘，棄去PBS，用lml的PBS重懸沉渣，吹散制成細胞懸液；(2)制作抗原片取出潔凈的玻片，將細胞懸液滴加在小孔內(nèi)，每孔20ul，2孔/組，每次設空白對照2孔，滴加PBS，吹干；(3)固定用冰預冷的丙酮溶液固定10分鐘，PBS沖洗5次，吹干；(4)—抗孵育滴加單克隆一抗，每孔15ul，置于濕盒內(nèi)，37t:孵育30分鐘。取出用PBS洗5次，吹干；(5)二抗孵育滴加熒光標記二抗，每孔15ul，置于濕盒內(nèi)，37t:孵育30分鐘。取出用PBS洗5次，吹干；(6)甘油封閉，鏡下觀察熒光，拍照。9.結(jié)果分析(1)siRNA對C6/36細胞的保護作用如圖l所示，登革病毒攻擊C6/36細胞7天后，觀察各組細胞形態(tài)，可見正常組無細胞病變；對照組出現(xiàn)大量細胞病變，其病變程度達到++++，細胞數(shù)明顯減少；siRNA組僅出現(xiàn)極少量細胞病變，病變程度為+，細胞數(shù)減少不明顯。如圖2所示，登革病毒攻擊C6/36細胞7天后，以MTT法檢測各組活細胞數(shù)，以正常組活細胞數(shù)為基準計算細胞存活率，對照組為26.4%，siRNA組為57%，相比對照組活細胞增加2.16倍，表明轉(zhuǎn)染的siRNA具有保護C6/36細胞的作用。用免疫熒光法檢測細胞內(nèi)登革病毒抗原，可見正常組無病毒抗原，對照組出現(xiàn)大量病毒抗原，siRNA組僅出現(xiàn)少量病毒抗原。(2)siRNA對登革病毒復制的抑制作用如圖3所示，登革病毒攻擊C6/36細胞7天后，用免疫熒光法檢測細胞內(nèi)登革病毒顆粒，結(jié)果正常組無病毒顆粒，對照組出現(xiàn)大量病毒顆粒，siRNA組僅出現(xiàn)少量病毒顆粒。同時用熒光定量RT-PCR法檢測各組細胞內(nèi)登革病毒核酸量，結(jié)果正常組無病毒核酸，siRNA組病毒核酸量比對照組減少約30倍(圖4，表1)，表現(xiàn)出明顯的抑制登革病毒復制增殖的作用。表1熒光定量PCR法檢測各組細胞內(nèi)登革病毒核酸量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結(jié)果表明登革病毒攻擊C6/36細胞7天后，用熒光定量PCR法檢測細胞內(nèi)登革病毒核酸量，可見正常組無病毒核酸，對照組病毒核酸的Ct值為13.89，siRNA組病毒核酸的Ct值為18.71，比對照組高4.82，即病毒核酸量減少24.82倍，約30倍。SEQUENCELISTING(序列表)〈110〉廣州市疾病預防控制中心〈120〉用于抑制I型登革病毒復制的耙向小干擾RNA序列〈130〉〈160>2〈170>PatentInversion3.4〈210>1〈211>21〈212>RNA〈213>人工合成〈211>21<212〉RNA〈213>人工合成〈400>2ucaacgucaucugguuccguu219權利要求用于抑制I型登革病毒復制的靶向小干擾RNA序列，其特征在于所述小干擾RNA序列即siRNA序列為雙鏈分子，有21個堿基配對，正義鏈的序列為SEQIDNO.1，反義鏈的序列為SEQIDNO.1。全文摘要本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術領域：
，尤其是涉及對于重大傳染病具有預防、治療作用的小分子藥物。本發(fā)明所述的用于抑制I型登革病毒復制的靶向小干擾RNA序列，即siRNA序列，為雙鏈分子，有21個堿基配對，正義鏈的序列為SEQIDNO.1，反義鏈的序列為SEQIDNO.1。本發(fā)明從I型登革病毒基因中設計合成并篩選得到一段小干擾RNA序列即siRNA序列，達到抑制登革病毒復制、保護細胞不被登革病毒破壞的功能。文檔編號A61P31/14GK101781651SQ20091003670公開日2010年7月21日申請日期2009年1月16日優(yōu)先權日2009年1月16日發(fā)明者吳新偉,岳錦亞,杜琳,王鳴,蔣力云申請人:廣州市疾病預防控制中心