專(zhuān)利名稱(chēng)：一種能抑制乙型腦炎病毒復(fù)制與感染的shRNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種能抑制乙型腦炎病毒復(fù)制與感染的 shRNA及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙型腦炎(Japanese encephalitis, JE)是由乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的一種嚴(yán)重的人畜共患蟲(chóng)媒病毒性疾病。該病對(duì)人類(lèi)危害 巨大，是人類(lèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的蟲(chóng)媒病之一，廣泛分布于亞洲，特別是遠(yuǎn)東一些國(guó)家和 地區(qū)。近年來(lái)其流行分布范圍不斷擴(kuò)大，流行頻率也不斷增強(qiáng)。乙腦病毒屬于黃病毒科黃病毒屬。病毒粒子呈20面體對(duì)稱(chēng)，在核酸外面包有致密 的脂蛋白囊膜。JEV基因組為單股正鏈RNA分子，本身具有傳染性。其基因組編碼產(chǎn)物為3 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM、E)和 7 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。乙腦屬于自然疫源性疾病，蚊蟲(chóng)是該病的主要傳播媒介。本病的發(fā)生與氣候環(huán)境 有著密切的關(guān)系，呈明顯的季節(jié)性。我國(guó)一般流行高峰在7、8、9三個(gè)月。多種動(dòng)物均可 感染本病，感染后成為傳染源。經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)，在流行病區(qū)，畜禽的隱性感染率均很高，特別是 豬，其次是馬和牛。病毒在感染動(dòng)物血液內(nèi)存留時(shí)間很短，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及腫脹 的睪丸內(nèi)，但豬感染后病毒血癥期維持時(shí)間長(zhǎng)，血液中病毒滴度高，對(duì)乙腦的傳播起重要作 用。同時(shí)，豬是乙腦傳播給人類(lèi)最重要的宿主，一般情況下JEV的感染呈豬-蚊-人鏈狀。 豬感染乙腦時(shí)間的早晚和感染率的高低與人乙腦的流行密切相關(guān)。感染后，人、猴、馬和驢 出現(xiàn)明顯的腦炎臨診癥狀，病死率較高。豬群不發(fā)生腦炎癥狀，懷孕母豬可表現(xiàn)高熱、流產(chǎn)、 死胎和木乃伊胎，死產(chǎn)胎兒出現(xiàn)腦缺損癥狀，公豬則出現(xiàn)睪丸炎，給養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展帶來(lái)巨大的 損失。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異的基因沉默現(xiàn) 象。RNA干擾現(xiàn)象最初在植物和低等生物中被發(fā)現(xiàn)，隨著研究的深入，近來(lái)在高等的真核生 物中也被發(fā)現(xiàn)，并且證明是一種重要的進(jìn)化保守現(xiàn)象。已證明短的雙股干擾RNA(SiRNA)是 由dsRNA特異的核酸內(nèi)切酶，Dicer酶，剪切而來(lái)。RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)是由siRNA 和一種多酶復(fù)合物結(jié)合構(gòu)成，它位于mRNA特定的部位，并且發(fā)揮核酸內(nèi)切酶和外切酶的活 性來(lái)作用mRNA。除了在轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(降解mRNA)，siRNA也被證明通過(guò)DNA甲基化 沉默啟動(dòng)子而降低蛋白表達(dá)。短發(fā)卡RNA(shRNA)通常利用載體導(dǎo)入細(xì)胞，并且可被傳遞到 子代細(xì)胞中去，從而使基因沉默可被遺傳。shRNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)可被細(xì)胞機(jī)制切割成siRNA， 然后按上述機(jī)制達(dá)到降解mRNA的目的。它最大的優(yōu)點(diǎn)在于具有高度的有效性和特異性并 且具有快速的防御與治療效果。它的作用在基因功能研究領(lǐng)域和各種疾病的治療領(lǐng)域尤 其是病毒性疾病的治療領(lǐng)域已顯示出不可估量的價(jià)值，例如在抗艾滋病毒(HIV)，丙型肝炎 病毒(HCV)，乙型肝炎病毒(HBV)和脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus)等病毒的研究中都發(fā)現(xiàn) RNAi對(duì)于抑制這類(lèi)病毒的復(fù)制效果極好，可能為這類(lèi)病毒病的治療創(chuàng)立新的，更有效的途 徑。毫無(wú)疑問(wèn)，隨著對(duì)RNAi機(jī)制的深入了解以及技術(shù)的進(jìn)一步完善，RNAi技術(shù)必將為生命科學(xué)研究和臨床疾病的防治帶來(lái)新的革命。乙型腦炎的流行是世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。目前對(duì)于乙腦尚無(wú)特效治療手 段，因此預(yù)防乙腦的發(fā)生尤為重要。而傳統(tǒng)的疫苗生產(chǎn)不能滿(mǎn)足人類(lèi)日益發(fā)展的需要，因 而，科研人員不斷地尋求新的治療方式。RNAi這項(xiàng)新興技術(shù)即是其中頗有潛力的新途徑。 目前，國(guó)內(nèi)外運(yùn)用RNAi治療乙腦還處在科研院所的理論研究中，并未大規(guī)模地投入到臨床 治療中，但其研究結(jié)果顯示出卓越的抑制病毒復(fù)制與感染的能力，在臨床治療中有著極大 的潛力與良好的前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能快速、特異和顯著抑制JEV在動(dòng)物細(xì)胞與個(gè)體中復(fù)制 和感染的shRNA及其應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供含有該shRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
一種能抑制乙型腦炎病毒復(fù)制與感染的shRNA，以JEV基因組中高度保守的E、NS3和 NS4b基因序列作為其靶序列，所述的靶序列為=SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. 11、 SEQ ID NO. 12。本發(fā)明所述shRNA的模板序列如下
shRNA-El 正義鏈模板序列SEQ ID NO. 1，反義鏈模板序列SEQ ID N0. 2 ； shRNA-E2 正義鏈模板序列SEQ ID N0. 3，反義鏈模板序列SEQ ID N0. 4 ； shRNA-NS3 正義鏈模板序列SEQ ID N0. 5，反義鏈模板序列SEQ ID N0. 6 ； shRNA-NS4b 正義鏈模板序列SEQ ID N0. 7，反義鏈模板序列SEQ ID N0. 8。其中ShRNA-El針對(duì)的靶基因序列為SEQ ID N0. 9，shRNA_E2針對(duì)的靶基因序列為 SEQ ID N0. 10，shRNA-NS3針對(duì)的靶基因序列為SEQ ID N0. 11，shRNA_NS4b針對(duì)的靶基因 序列為 SEQ ID N0. 12。一種靶向乙型腦炎病毒基因組不同區(qū)域的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒即是將本發(fā)明所 述的shRNA的模板與線(xiàn)性化的載體pGPTO/GFP/Neo連接得到分別針對(duì)乙型腦炎病毒E、NS3 或NS4b基因mRNA序列的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒，分別簡(jiǎn)寫(xiě)為pGP_El、pGP_E2、pGP_NS3及 pGP-NS4b。本發(fā)明所述的抑制乙型腦炎病毒復(fù)制與感染的shRNA在制備抑制乙型腦炎病毒 復(fù)制和/或感染的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的靶向乙型腦炎病毒基因組不同區(qū)域的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒在制備 抑制乙型腦炎病毒復(fù)制和/或感染的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果
先向動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)染本發(fā)明的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒，再用病毒攻擊細(xì)胞進(jìn)行一系列試 驗(yàn)(圖Γ圖8)，結(jié)果表明本發(fā)明的shRNA可有效地抑制JEV在細(xì)胞上的復(fù)制，對(duì)細(xì)胞有良好 的保護(hù)作用。先將本發(fā)明的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒注入動(dòng)物體內(nèi)，再用不同劑量的病毒攻擊動(dòng)物 機(jī)體(圖10 A、B);或者將本發(fā)明的ShRNA真核表達(dá)質(zhì)粒與不同劑量的病毒同時(shí)注入動(dòng)物體 內(nèi)(圖10 C、D)，結(jié)果表明本發(fā)明的shRNA均能有效地降低動(dòng)物的發(fā)病率和死亡率，動(dòng)物存活率達(dá)50%以上，顯著高于無(wú)干擾作用組?？梢?jiàn)，本發(fā)明的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒在動(dòng)物個(gè)體 水平上既有良好的預(yù)防JEV感染的作用也有治療JEV感染的功效。綜上所述，本發(fā)明所提供的shRNA以及shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒能夠在制備治療和/ 或預(yù)防JEV感染的藥物中應(yīng)用，為治療和預(yù)防JEV感染提供一種新的可選藥物。


圖1 JEV基因組結(jié)構(gòu)及本發(fā)明中所選取的保守區(qū)段示意圖。箭頭處為shRNA所 選的靶基因位點(diǎn)。圖 2 pGPU6/GFP/Neo 載體結(jié)構(gòu)圖。圖3 shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定。M: lamda/^bo730I; A1-5和B1-5分別為 pGP-El 與 pGP-E2 Bbsl 酶切結(jié)果；A，1-5 和 B，1-5 分別為 pGP-El 與 pGP_E2 BairMl 酶切 結(jié)果；C1-5和D1-5分別為pGP-NS3與pGP_NS4b Bbsl酶切結(jié)果；C，1-5和D，1-5分別為 PGP-NS3 與 pGP-NS4b BairMl 酶切結(jié)果。圖4 間接免疫熒光結(jié)果。A、B、C、D、E、F 分別是 pGP-El、pGP-E2、pGP-NS3、 pGP-NS4b、pGP-NC 和 Mock 組結(jié)果。圖5經(jīng)shRNA作用后的細(xì)胞培養(yǎng)液的TCID5tl的測(cè)定結(jié)果。圖6 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果。A、B、C、D、E、F 分別是pGP_E 1、pGP_E2、pGP_NS3、pGP_NS4b、 pGP-NC和Mock組結(jié)果。圖7 Real time RT-PCR結(jié)果。mRNA的相對(duì)表達(dá)量是指經(jīng)過(guò)shRNA干擾作用后 JEV的目的基因3’段非編碼區(qū)的表達(dá)量與陰性對(duì)照組目的基因表達(dá)量的比值。圖 8 Western blotting 結(jié)果。泳道 1 6 分別為 pGP-El、pGP_E2、pGP_NS3、 pGP-NS4b、pGP-NC 和 Mock 組結(jié)果。圖9 免疫組化結(jié)果。六、8、(、0』、？分別是？6 41、？6 42、？6 -賂3、？6 -賂413、 Virus control 和 Mock 組結(jié)果。圖10 動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。A、B分別為先注射shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒后攻毒 20LD5(1和IOOLD5tl JEV (NJ2008)組；C、D分別為同時(shí)注射shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒和20LD5(1 JEV (NJ2008)組，同時(shí)注射shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒和IOOLD5tl JEV (NJ2008)組。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 shRNA的制備 (1)寡核苷酸的設(shè)計(jì)與合成
以JEV的E、NS3、NS4b基因mRNA序列為靶序列(圖1)，利用Ambion公司的siRNA 設(shè)計(jì)軟件，通過(guò)同源分析，分別針對(duì)JEV基因的1553 1571bp (El)、1679 1697bp (E2)、 6083 6101bp (NS3)和7350 7368bp (NS4b)設(shè)計(jì)合成4對(duì)shRNA寡核苷酸鏈。其loop結(jié) 構(gòu)選用了 TTCAAGAGA以避免形成終止信號(hào)，shRNA的轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)。正義鏈模 板的5’端添加了 CACC，與BbsI酶切后形成的粘端互補(bǔ)；反義鏈模板的5’端添加了 GATC， 與BamHI酶切后形成的粘端互補(bǔ)；如果shRNA的靶序列第一個(gè)堿基不是G，則在其模板鏈的 CACC后補(bǔ)加一個(gè)G。所設(shè)計(jì)的四個(gè)shRNA的模板鏈序列如下shRNA_El 正義鏈模板SEQ ID N0. 1，反義鏈模板SEQ ID N0. 2 ;shRNA_E2 正義鏈模板SEQ ID N0. 3，反義鏈模板SEQ IDNO. 4 ； shRNA-NS3 正義鏈模板 SEQ ID NO. 5，反義鏈模板 SEQ ID NO. 6 ； shRNA_NS4b 正義鏈模板SEQ ID NO. 7，反義鏈模板SEQ ID NO. 8。上述序列合成委托上海吉瑪制藥技 術(shù)有限公司進(jìn)行。(2) shRNA模板的退火
將shRNA模板單鏈分別用TE (pH8. 0)溶解，濃度為100 μ Μ。取相應(yīng)的正義鏈模板和反 義鏈模板溶液，按照表1配比配置退火反應(yīng)體系。表 權(quán)利要求
1.一種能抑制乙型腦炎病毒復(fù)制與感染的shRNA，其特征在于以乙型腦炎病毒基因組 中高度保守的序列作為其靶序列，所述的靶序列為SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11 或 SEQ ID NO. 12。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制乙型腦炎病毒復(fù)制與感染的shRNA，其特征在于其該 shRNA的模板序列如下shRNA-El 正義鏈模板序列SEQ ID NO. 1，反義鏈模板序列SEQ ID NO. 2 ； shRNA-E2 正義鏈模板序列SEQ ID NO. 3，反義鏈模板序列SEQ ID NO. 4 ； shRNA-NS3 正義鏈模板序列SEQ ID NO. 5，反義鏈模板序列SEQ ID NO. 6 ； shRNA-NS4b 正義鏈模板序列SEQ ID NO. 7，反義鏈模板序列SEQ ID NO. 8。
3.—種權(quán)利要求2所述的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于該shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒是 將所述的shRNA的模板與線(xiàn)性化的載體pGPTO/GFP/Neo連接得到分別針對(duì)乙型腦炎病毒E、 NS3或NS4b基因mRNA序列的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒。
4.權(quán)利要求1所述的shRNA在制備抑制乙型腦炎病毒復(fù)制和/或感染的藥物中的應(yīng)用。
5.一種權(quán)力要求3所述的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒在制備抑制乙型腦炎病毒復(fù)制和/或感 染的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種能抑制乙型腦炎病毒復(fù)制與感染的shRNA及其應(yīng)用。該shRNA以乙型腦炎病毒基因組中高度保守的序列作為其靶序列，所述的靶序列為SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11或SEQIDNO.12。該shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒是將所述的shRNA的模板與線(xiàn)性化的載體pGPU6/GFP/Neo連接得到分別針對(duì)乙型腦炎病毒E、NS3或NS4b基因mRNA序列的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明所提供的shRNA以及shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒能夠在制備治療和/或預(yù)防JEV感染的藥物中應(yīng)用，為治療和預(yù)防JEV感染提供一種新的可選藥物。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102002499SQ201010507298
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月14日
發(fā)明者劉珂, 周斌, 曹瑞兵, 沈婷, 陳溥言 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)