專(zhuān)利名稱(chēng)：一種人干擾素-alpha基因修飾的自然殺傷細(xì)胞株及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人干擾素-alpha基因修飾的自然殺傷細(xì)胞株及其構(gòu)建方法，屬 于腫瘤的過(guò)繼免疫治療領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
眾所周知，NK細(xì)胞作為機(jī)體固有免疫的重要組成部分是機(jī)體抗腫瘤、抗感染的第 一道天然防線(xiàn)，故NK細(xì)胞在腫瘤過(guò)繼免疫治療方面的作用倍受關(guān)注，輸注供者異源反應(yīng)性 NK細(xì)胞已經(jīng)成為臨床移植輔助治療及抗腫瘤生物治療的新策略。但NK細(xì)胞體外擴(kuò)增效率 低，因此建立NK細(xì)胞株成為腫瘤生物治療的重要手段。NKL細(xì)胞株來(lái)源于⑶3-⑶16+⑶56+的大顆粒淋巴細(xì)胞白血病患者的外周血，具有 廣譜的細(xì)胞毒活性，具有良好的臨床應(yīng)用前景。干擾素是具有抗病毒、抗增殖和調(diào)節(jié)免疫活性的一種糖蛋白，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明干擾 素-alpha具有抗腫瘤作用。基于上述現(xiàn)有技術(shù)，如果能夠建立人干擾素-alpha基因修飾的NKL細(xì)胞株，則有 望能夠進(jìn)一步增強(qiáng)NKL細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，提高其對(duì)刺激的敏感性和活化程度， 能夠更加符合過(guò)繼免疫治療的要求，更適合應(yīng)用于腫瘤的生物治療。迄今為止，未見(jiàn)有關(guān)建 立人干擾素-alpha基因修飾的NKL細(xì)胞株的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述腫瘤過(guò)繼免疫治療的現(xiàn)狀，針對(duì)干擾素-alpha的作用特點(diǎn)，本發(fā)明的目 的是建立一種人干擾素-alpha基因修飾的NKL細(xì)胞株，使其更加符合腫瘤生物治療的要 求。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種人干擾素-alpha基因修飾的自然殺傷細(xì)胞株，是將人干擾素-alpha基因轉(zhuǎn) 染入自然殺傷細(xì)胞株NKL細(xì)胞，構(gòu)建成的穩(wěn)定分泌、表達(dá)人干擾素-alpha的細(xì)胞株。一種人干擾素-alpha基因修飾的自然殺傷細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)分離人外周血淋巴細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，擴(kuò)增人IFN-α的cDNA片段，長(zhǎng)度為 569bp ；(2)將上述RT-PCR產(chǎn)物與T-載體連接，構(gòu)建T-IFNα，然后轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌 DH5 α，過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒測(cè)序鑒定，篩選陽(yáng)性克隆，對(duì)于測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆，提取純化 T-IFNa ；(3)對(duì)T-IFN α和表達(dá)載體psectag-B分別進(jìn)行BamH I和EcoR I的雙酶切，并回 收目的條帶；(4)將步驟(3)制得的酶切后的載體片段與IFN-α條帶進(jìn)行連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受 態(tài)大腸桿菌DH5 α，篩選陽(yáng)性重組子，提取純化psectagB-IFN α載體(人干擾素-alpha的
3分泌型重組真核表達(dá)載體)；(5)將psectagB-IFNa載體通過(guò)電轉(zhuǎn)入自然殺傷細(xì)胞株NKL細(xì)胞，將電轉(zhuǎn)后的細(xì) 胞轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基，篩選培養(yǎng)基為含終濃度為50mg/L Zeocin的1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng) 3 4天，從中挑選出陽(yáng)性細(xì)胞克??；(6)將上述陽(yáng)性細(xì)胞克隆在含10%胎牛血清、100活性單位的IL-2的1640培養(yǎng)基 中進(jìn)行擴(kuò)增，即得到人干擾素-alpha基因修飾的自然殺傷細(xì)胞株。所述步驟(1)中，擴(kuò)增所用引物序列為IFN-α -F 5' -TTAGGATCCATGGCCTCGCCCTTT-3‘；IFN-α -R 5' -CGCGAATTCGTTATTCCTTCCTCC-3 ‘；PCR 反應(yīng)條件為95°C變性 5min，94°C lmin，58°C lmin，72°C lmin，共 30 個(gè)循環(huán)， 72°C延伸 IOmin0本發(fā)明所構(gòu)建的人干擾素-alpha基因修飾的自然殺傷細(xì)胞NKL細(xì)胞株，經(jīng)RT-PCR 及ELISA檢測(cè)鑒定能夠在胞內(nèi)表達(dá)，并將合成的IFN-α分泌到胞外培養(yǎng)上清中。進(jìn)一步研 究表明，人IFN- α基因修飾的NKL細(xì)胞株能夠有效殺傷肝癌細(xì)胞H印G2、H7402、PLC/PRF_5 和 H印G2. 2. 15，這種抗腫瘤效應(yīng)與 NKL-IFN α 細(xì)胞 IFN- y、Granzyme, TNF- α 和 Perforin 基因和蛋白的表達(dá)水平提高相關(guān)。并且修飾后的NKL細(xì)胞株對(duì)外界刺激更加敏感，在肝癌 細(xì)胞H印G2，H印G2. 2. 15，或者刺激劑PMA刺激下，能夠分泌更多IFN-γ。因此，本發(fā)明的人 IFN-α基因修飾的NKL細(xì)胞的生物學(xué)特征更有利于臨床過(guò)繼免疫治療的應(yīng)用。本發(fā)明的IFN-α基因修飾的NK細(xì)胞株(NKL-IFNα )，通過(guò)電轉(zhuǎn)的方法將目的基因 IFN-α轉(zhuǎn)入NKL細(xì)胞株，此轉(zhuǎn)染方法解決了 NK細(xì)胞難以轉(zhuǎn)染的問(wèn)題，轉(zhuǎn)染效率高且成本低， 利于篩選和推廣。修飾后的細(xì)胞與未修飾NKL細(xì)胞相比，該細(xì)胞株可以穩(wěn)定表達(dá)IFNa，可 以對(duì)多種來(lái)源的肝癌腫瘤細(xì)胞的殺傷能力顯著提高，提高使用效率，在達(dá)到同等抗腫瘤效 果的前提下，減少NK細(xì)胞的劑量，從而降低成本，更適于臨床用于過(guò)繼免疫治療腫瘤。


圖1為psectagB-IFNa載體構(gòu)建的示意圖。圖2為PT-PCR檢測(cè)基因修飾后NKL細(xì)胞表達(dá)IFN- α的mRNA水平。圖3為ELISA檢測(cè)IFN- α基因修飾后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN- α的分泌水平；圖示 分別為細(xì)胞培養(yǎng)24h，48h時(shí)，基因修飾后組細(xì)胞上清中IFN-a的分泌水平明顯升高。圖4為IFN-α基因修飾后的NKL細(xì)胞對(duì)四種肝癌細(xì)胞H印G2，H7402，PLC/PRF-5， H印G2. 2. 15殺傷能力的增強(qiáng)，其中，左上為H印G2，右上為H7402，左下為PLC/PRF-5，右下為 H印G2. 2. 15。圖5為Real-time PCR檢測(cè)IFN- α基因修飾后，NKL細(xì)胞殺傷相關(guān)分子NKG2D， NKG2A, IFN- γ，Perforin, FasL 的表達(dá)情況。圖6為ELISA檢測(cè)IFN-α基因修飾前后的NKL細(xì)胞，在H印G2，H印G2. 2. 15細(xì)胞 刺激下IFN-Y分泌水平。圖7為IFN- α基因修飾的NKL細(xì)胞在刺激劑PMA和Ionomycin作用24h和48h 后，IFN-Y分泌水平明顯升高，其中，上圖為未刺激時(shí)修飾前后的NKL細(xì)胞分泌IFN-Y的 水平，下圖為PMA和Ionomycin刺激24h和48h后，修飾前后的NKL細(xì)胞分泌IFN- γ的水平。圖8為IFN- α基因修飾NKL細(xì)胞前后，胞內(nèi)Granzyme B分子的表達(dá)情況。從左 到右分別為同型對(duì)照，NKL-psec，NKL-IFNa和前兩圖的疊加。從圖中可以看出，IFN-α基 因修飾NKL細(xì)胞前表達(dá)量為31. 2%, IFN-α基因修飾NKL細(xì)胞后表達(dá)量為86. 53%，說(shuō)明， IFN-α基因修飾能夠增強(qiáng)Granzyme B的表達(dá)水平。圖9為IFN- α基因修飾NKL細(xì)胞前后，胞內(nèi)TNF- α分子的表達(dá)情況。從左到右 分別為同型對(duì)照，NKL-psec，NKL-IFNa和前兩圖的疊加。從圖中可以看出，IFN-α基因修 飾NKL細(xì)胞前后表達(dá)量分別為21. 16%和50.86%，說(shuō)明，正^(1基因修飾能夠增強(qiáng)TNF-a 的表達(dá)水平。圖10為IFN-α基因修飾NKL細(xì)胞前后，胞內(nèi)Perforin分子的表達(dá)情況。從左 到右分別為同型對(duì)照，NKL-psec，NKL-IFNa和前兩圖的疊加。從圖中可以看出，IFN-α基 因修飾NKL細(xì)胞前后表達(dá)量分別為40. 35%和78. 44%，說(shuō)明，IFN-α基因修飾能夠增強(qiáng) Perforin的表達(dá)水平。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式 限制本發(fā)明。實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，實(shí)驗(yàn)試劑均為市售
女口
廣 PFt ο實(shí)施例 構(gòu)建人干擾素-alpha基因修飾的自然殺傷細(xì)胞株(一 )人干擾素-alpha分泌型真核表達(dá)載體的構(gòu)建，根據(jù)構(gòu)建流程(圖1)進(jìn)行， 具體步驟如下(1)分離人外周血淋巴細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，擴(kuò)增人IFN-α的cDNA片段，長(zhǎng)度為 569bp，擴(kuò)增所用引物序列為IFN-α -F 5' -TTAGGATCCATGGCCTCGCCCTTT-3‘；IFN-α -R 5' -CGCGAATTCGTTATTCCTTCCTCC-3‘；PCR 反應(yīng)條件為95°C變性 5min，94°C lmin，58°C lmin，72°C lmin，共 30 個(gè)循環(huán)， 72°C延伸 IOmin ；(2) RT-PCR產(chǎn)物與T-載體連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5 α，篩選陽(yáng)性克隆， 委托上海博亞生物工程公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，結(jié)果表明序列與報(bào)道完全一致；(3) T-IFN α和表達(dá)載體psectag-B分別進(jìn)行BamH I和EcoR I的雙酶切，并回收 目的條帶；(4)將步驟(3)制得的酶切后的載體片段與IFN-α條帶進(jìn)行連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受 態(tài)大腸桿菌DH5 α，篩選陽(yáng)性重組子。(二)psectagB-IFNa 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 NKL 細(xì)胞株(l)psectagB-IFNa載體通過(guò)電轉(zhuǎn)入NKL細(xì)胞株取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，電轉(zhuǎn)前24小時(shí)換液，使細(xì)胞處于良好的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)；收集細(xì) 胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為107管；用600 μ 1預(yù)冷的!fepes液懸起細(xì)胞，加入IOOug質(zhì)粒，充分混勻； 將細(xì)胞與質(zhì)粒的混合物轉(zhuǎn)入直徑4cm的電轉(zhuǎn)杯，電壓200V，電容975 μ F條件下電擊；冰浴15分鐘后，將電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入IOOmL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37°C繼續(xù)培養(yǎng)；(2)轉(zhuǎn)染后陽(yáng)性細(xì)胞的篩選將電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入傳入篩選培養(yǎng)基(含終濃度為50mg/L Zeocin的1640完全 培養(yǎng)基)，培養(yǎng)3 4天，從中挑選出陽(yáng)性細(xì)胞克??；(3)將上述陽(yáng)性細(xì)胞克隆在含10%胎牛血清、100活性單位的IL-2的1640培養(yǎng)基 中進(jìn)行擴(kuò)增，即得到具有臨床應(yīng)用價(jià)值的人干擾素-alpha基因修飾的自然殺傷細(xì)胞株。(S)IFN-Ci基因修飾的陽(yáng)性細(xì)胞克 隆的鑒定過(guò)程psectagB-IFNa載體轉(zhuǎn)染NKL細(xì)胞株后，取篩選完成的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測(cè) IFN-α的轉(zhuǎn)錄水平，并用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IFN-α的分泌水平。(I)RT-PCR 分析經(jīng)Zeocin篩選后的NK細(xì)胞，Trizol方法提取RNA進(jìn)行RT-PCR分析，有IFN- α的 mRNA轉(zhuǎn)錄(圖2)。(2) ELISA 檢測(cè)收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NKL-psec，NKL-IFN α細(xì)胞，接入96孔板中，分別檢測(cè)24h， 48h細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFNa的分泌水平，如圖3所示，NKL-IFN α細(xì)胞在24h時(shí)IFN-α的分 泌能夠達(dá)到200pg/ml，48h能夠達(dá)到350200pg/ml左右。(四)IFN-α基因修飾NK細(xì)胞的生物學(xué)特性(1) IFN- α基因修飾對(duì)NKL細(xì)胞系殺傷活性的影響應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)IFN- α基因修飾的NKL細(xì)胞(NKL-IFN- a )和NKL-psec對(duì)人 肝癌細(xì)胞系H印G2，H7402, PLC/PRF-5，H印G2. 2. 15細(xì)胞的殺傷能力。結(jié)果顯示，NKL-IL15 細(xì)胞在效靶比為10 1,5 1,2.5 1時(shí)對(duì)IfepG2細(xì)胞的殺傷活性顯著增強(qiáng)(圖4)，對(duì) H7402, H印G2. 2. 15，PLC/PRF-5細(xì)胞的殺傷效應(yīng)也比對(duì)照NKL-psec細(xì)胞增強(qiáng)，提示內(nèi)源性 IFN- α能夠提升NK細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。(2) IFN- α基因修飾對(duì)NKL細(xì)胞系殺傷相關(guān)分子mRNA和蛋白表達(dá)的影響為了闡明IFN-α對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的增強(qiáng)是否與殺傷相關(guān)分子的表達(dá)量有關(guān)， 我們用RT-PCR檢測(cè)了 NKG2D，NKG2A, IFN- γ，F(xiàn)asL和Perforin基因的mRNA水平。結(jié)果顯 示，NKL-IFN- α細(xì)胞組的IFN- γ，Perforin基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照NKL-psec 細(xì)胞組，NKG2A基因的mRNA表達(dá)低于對(duì)照細(xì)胞，NKG2D、FasL基因的mRNA表達(dá)沒(méi)有明顯變 化(圖5)。后續(xù)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NKL細(xì)胞胞內(nèi)Granzyme、TNF-α和Perforin蛋白表達(dá) 水平，NKL-IFNa細(xì)胞組均比對(duì)照細(xì)胞組有顯著提高(圖8，9，10)。(3) ELISA檢測(cè)NKL-IFN α細(xì)胞在刺激下，IFN- γ的分泌水平NKL-IFN α細(xì)胞在肝癌細(xì)胞H印G2，H印G2. 2. 15刺激下，上清中IFN- γ的分泌水 平高于對(duì)照細(xì)胞組(圖6)。在刺激劑PMA和Ionomycin作用后，IFN- γ的分泌水平大幅提 高，尤其在作用48h后，IFN- γ的分泌量能夠達(dá)到7000pg/ml以上(圖7)。
權(quán)利要求
一種人干擾素 alpha基因修飾的自然殺傷細(xì)胞株，其特征在于是將人干擾素 alpha基因轉(zhuǎn)染入自然殺傷細(xì)胞株NKL細(xì)胞，構(gòu)建成的穩(wěn)定分泌、表達(dá)人干擾素 alpha的細(xì)胞株。
2.權(quán)利要求1所述的一種人干擾素-alpha基因修飾的自然殺傷細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其 特征在于，包括以下步驟(1)分離人外周血淋巴細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，擴(kuò)增人IFN-α的cDNA片段，長(zhǎng)度為 569bp ；(2)將上述RT-PCR產(chǎn)物與T-載體連接，構(gòu)建T-IFNa，然后轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌 DH5 α，過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒測(cè)序鑒定，篩選陽(yáng)性克隆，對(duì)于測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆，提取純化 T-IFNa ；(3)對(duì)T-IFNa和表達(dá)載體psectag-B分別進(jìn)行BamHI和EcoR I的雙酶切，并回收目 的條帶；(4)將步驟(3)制得的酶切后的載體片段與IFN-α條帶進(jìn)行連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大 腸桿菌DH5 α，篩選陽(yáng)性重組子，提取純化psectagB-IFN α載體；(5)將psectagB-IFNa載體通過(guò)電轉(zhuǎn)入自然殺傷細(xì)胞株NKL細(xì)胞，將電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞轉(zhuǎn) 入篩選培養(yǎng)基，篩選培養(yǎng)基為含終濃度為50mg/L Zeocin的1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 4 天，從中挑選出陽(yáng)性細(xì)胞克?。?6)將上述陽(yáng)性細(xì)胞克隆在含10%胎牛血清、100活性單位的IL-2的1640培養(yǎng)基中進(jìn) 行擴(kuò)增，即得到人干擾素-alpha基因修飾的自然殺傷細(xì)胞株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟(1)中，擴(kuò)增所用引物序列為IFN- α -F 5' -TTAGGATCCATGGCCTCGCCCTTT-3‘；IFN- α -R 5' -CGCGAATTCGTTATTCCTTCCTCC-3‘；PCR 反應(yīng)條件為95°C變性 5min，94°C lmin，58°C lmin，72°C lmin，共 30 個(gè)循環(huán)，72°C 延伸lOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人干擾素-alpha基因修飾的自然殺傷細(xì)胞株，是將人干擾素-alpha基因轉(zhuǎn)染入自然殺傷細(xì)胞株NKL細(xì)胞，構(gòu)建成的穩(wěn)定分泌、表達(dá)人干擾素-alpha的細(xì)胞株。本發(fā)明所構(gòu)建的細(xì)胞株，經(jīng)RT-PCR及ELISA檢測(cè)鑒定能夠在胞內(nèi)表達(dá)，并將合成的IFN-α分泌到胞外培養(yǎng)上清中。進(jìn)一步研究表明，人IFN-α基因修飾的NKL細(xì)胞株能夠有效殺傷肝癌細(xì)胞，這種抗腫瘤效應(yīng)與NKL-IFNα細(xì)胞IFN-γ、Granzyme、TNF-α和Perforin基因和蛋白的表達(dá)水平提高相關(guān)。并且修飾后的NKL細(xì)胞株對(duì)外界刺激更加敏感。因此，本發(fā)明的細(xì)胞株的生物學(xué)特征更有利于臨床過(guò)繼免疫治療的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12R1/91GK101948806SQ201010507100
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月14日
發(fā)明者張建, 田志剛, 蔣雯 申請(qǐng)人:山東大學(xué)