專利名稱：一種重組豬干擾素γ及其編碼基因和表達(dá)方法
一種重組豬干擾素Y及其編碼基因和表達(dá)方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物工程基因領(lǐng)域，涉及一種重組豬干擾素Y及其編碼基因，以及其表達(dá)、純化和包涵體復(fù)性方法。
背景技術(shù)：
干擾素(Interferon, IFN)是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)(主要是糖蛋白),是一種由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。它們在同種細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、影響細(xì)胞生長，以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。根據(jù)IFN的來源即動物種類、細(xì)胞類型、誘生劑的性質(zhì)和誘生條件不同，可分為α、β、Y三種。其中，Υ干擾素(interfeixm， IFN- y )具有免疫干擾素之稱，由T細(xì)胞及NK細(xì)胞合成，其生物學(xué)效應(yīng)包括抗病毒活性、抗腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)MHCI級抗原表達(dá)、誘導(dǎo)MH II級抗原表達(dá)、激活Μφ使其殺傷腫瘤細(xì)胞以及殺滅胞內(nèi)寄生蟲。由此可見，干擾素Y不僅具有廣譜抗病毒功能，還具有免疫調(diào)節(jié)的作用，對疾病的發(fā)生發(fā)展有著重要的影響。
我國是養(yǎng)豬大國，豬圓環(huán)病毒病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病等多種豬病毒性傳染病給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前我國雖廣泛接種各種豬病疫苗，仍不能有效控制疾病流行?；蚬こ虅游镉盟幐蓴_素-Y可有效增強(qiáng)豬仔的免疫功能，提高機(jī)體對病毒的防御作用，并且具有無藥物殘留、無副作用等特點，深受臨床獸醫(yī)和養(yǎng)殖戶的青睞。 但是干擾素-Y的生物學(xué)效應(yīng)具有高度的種屬特異性，而天然的豬干擾素Y在機(jī)體內(nèi)表達(dá)甚微，很難直接從體內(nèi)大量提取供臨床研究及應(yīng)用。因此本發(fā)明通過基因工程手段提供了一種成本低廉且可以大量表達(dá)重組豬干擾素Y表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)方法。
原核表達(dá)系統(tǒng)是最早被采用進(jìn)行研究的，也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。其優(yōu)點在于能夠在較短時間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，而且所需的成本相對比較低廉。但是，原核表達(dá)系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點例如無法對表達(dá)時間及表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控、外源蛋白的表達(dá)對宿主細(xì)胞毒性作用、產(chǎn)物純化困難等；除此之外，由于原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，產(chǎn)物多以生物活性較低包涵體的形式產(chǎn)生。而包涵體的復(fù)性是一個非常復(fù)雜的過程，不僅與蛋白質(zhì)復(fù)興的過程控制密切相關(guān)，還很大程度上取決于目的蛋白的自身性質(zhì)。如果復(fù)性條件不適宜將會出現(xiàn)分子內(nèi)二硫鍵的錯配，分子間共價結(jié)合或疏水結(jié)合形成聚合體，降低重組蛋白的比活率，造成產(chǎn)品質(zhì)量不合格，同時又易產(chǎn)生沉淀析出，影響得率。因此，本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是使大腸桿菌表達(dá)的豬干擾素Y包涵體復(fù)性為具有生物活性的細(xì)胞因子。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，通過密碼子優(yōu)化的方式，提供一種可在大腸桿菌內(nèi)高效表達(dá)重組豬干擾素Y以及其基因和表達(dá)、純化、復(fù)性方法。
本發(fā)明提供了一種重組豬干擾素Y，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
本發(fā)明提供了編碼上述 所述重組豬干擾素Y的基因，其堿基序列如SEQ ID Ν01所示。該序列是專為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化得到的序列，相比之下能顯著提高異源基因在宿主菌中的表達(dá)效率。
本發(fā)明還提供了包含了上述所述編碼重組豬干擾素Y的基因的載體，所述的載體優(yōu)選為原核表達(dá)質(zhì)粒，最優(yōu)選為pET21b。
本發(fā)明還提供了包含有上述所述載體的大腸桿菌菌株，優(yōu)選地，所述菌株選自大腸桿菌BL21 (DE3)菌株。
本發(fā)明還提供了重組豬干擾素Y在大腸桿菌表達(dá)方法，包括如下步驟
該方法的步驟為
1.挑取一個含有上述所述重組豬干擾素Y的大腸桿菌菌落，接入50mL的LB培養(yǎng)液，在250mL搖瓶中于37 °C培養(yǎng)過夜；
2.取5mL過夜培養(yǎng)物接入于500mL的LB培養(yǎng)液中，在2L搖瓶中于37°C震蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期(A6qq=L O);
3.在培養(yǎng)物中加入IPTG至O. 5-1. 5mmol/L，于37°C，誘導(dǎo)表達(dá)l_4h后，于4°C以 5000rpm/min，離心處理15min收集含有重組豬干擾素Y的大腸桿菌菌體沉淀。
所述LB培養(yǎng)液中均含有氨芐青霉素50-100 μ g/mL。
本發(fā)明還提供了重組豬干擾素Y的包涵體純化方法，包括如下步驟
1.將收集得到的上述含有誘導(dǎo)重組豬干擾素Y大腸桿菌菌體沉淀，用預(yù)冷的PBS 重懸，并于4°C高速離心處理；重復(fù)一次。
2.吸去上清，稱菌體沉淀重量，每克(菌體濕重)加入裂解緩沖液Buffer A3_10ml， 用磨光玻璃棒攪動，使菌體懸起。
3.每克(菌體濕重)菌體加入3-10 μ L濃度為IOOmmoI/L的PMSF，3-100 μ L濃度為lOOmg/mL的溶菌酶，于冰上攪動。
4.破碎菌體，樣品置于冰上，超聲，并于4°C高速離心處理，棄上清。
5.沉淀用洗滌緩沖液Buffer B洗滌，并于4°C高速離心處理，沉淀包涵體，重復(fù)一次。
6.包涵體沉淀用變性緩沖液Buffer C溶解，室溫下攪拌30_60min。
7.充分混勻后室溫高速離心處理，棄沉淀，取上清，即得到重組豬干擾素Y變性溶液。
該純化方法優(yōu)選步驟如下
1.將收集得到的上述含有誘導(dǎo)重組豬干擾素Y大腸桿菌菌體沉淀，用預(yù)冷的PBS 重懸，于4°C,以12000rpm/min的轉(zhuǎn)速離心15min ;重復(fù)一次。
2.吸去上清，稱菌體沉淀重量，每克(菌體濕重)加入裂解緩沖液Buffer A5mL，用磨光玻璃棒攪動，使菌體懸起。
3.每克(菌體濕重) 菌體加入5 μ L濃度為100mmol/L的PMSF，5 μ L濃度為IOOmg/ HiL的溶菌酶，冰上攪動20min。
4.用探針型超聲波儀破碎菌體，樣品置于冰上，超聲120次，每次5s間隔5s，循環(huán)三次，每次循環(huán)至冷卻樣品之間等待2min,等待樣品冷卻。于4°C,以12000rpm/min的轉(zhuǎn)速離心15min,棄上清。
5.沉淀用洗漆緩沖液Buffer B洗漆,于4°C,以12000rpm/min的轉(zhuǎn)速離心15min,沉淀包涵體，重復(fù)一次。
6.包涵體沉淀用變性緩沖液Buffer C溶解，室溫下攪拌30min。
7.充分混勻后室溫下以12000rpm/min的轉(zhuǎn)速離心15min，棄沉淀，取上清，即得到重組豬干擾素Y變性溶液。
本發(fā)明還提供了優(yōu)化后的重組豬干擾素Y的包涵體復(fù)性方法，包括如下步驟
取適量用變性緩沖液Buffer C溶解的上述所述的重組豬干擾素Y變性溶液，測其濃度，然后用變性緩沖液Buffer C將蛋白濃度稀釋到O. 2mg/mL，注入截留分子量IOKDa 的透析卡中，4°C透析復(fù)性，每隔6h換一次復(fù)性緩沖液Buffer D。復(fù)性至24h時，將復(fù)性后重組蛋白溶液用0.45 μ m濾膜過濾，即得到低濃度的重組豬干擾素Y復(fù)性溶液。并可進(jìn)一步用截留分子量IOKDa的超濾管脫鹽、濃縮，于真空冷凍干燥機(jī)低溫真空干燥，即獲得重組豬干擾素Y粉末。
本發(fā)明的上述所述表達(dá)、純化、復(fù)性方法是經(jīng)過發(fā)明人反復(fù)多次實驗摸索和驗證得到的用于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組豬干擾素Y的最為有效的方法，該方法的表達(dá)量高，且表達(dá)得到包涵體復(fù)性后活性更高。尤其是本發(fā)明的經(jīng)優(yōu)化過的重組豬干擾素Y的基因序列，更適于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)，所表達(dá)的重組豬干擾素Y遠(yuǎn)高于豬干擾素Y天然基因序列在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量。
本發(fā)明還提供了重組豬干擾素Y在制備治療和預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征、豬流感以及豬藍(lán)耳病疾病的藥物中的用途。在豬仔疾病治療過程中，干擾素-Y可以非特異性的發(fā)揮廣泛的抗病毒效應(yīng)，提高機(jī)體免疫應(yīng)答和增強(qiáng)對病毒的防御能力。同時，干擾素- Y 也可與其他疫苗聯(lián)合使用，減輕疫苗的不良反應(yīng)，增強(qiáng)整體抗病毒、細(xì)菌、寄生蟲的效力。


圖1表示重組豬干擾素Y密碼子優(yōu)化前后核苷酸序列比較
其中，偶數(shù)行(S卩“原始序列”對應(yīng)的行)為豬干擾素Y天然基因核苷酸序列，即密碼子優(yōu)化前的序列；奇數(shù)行(即“優(yōu)化序列”對應(yīng)的行) 為本發(fā)明的重組豬干擾素Y的基因核苷酸序列，即密碼子優(yōu)化后的序列。
圖2-a、圖2-b為重組豬干擾素Y密碼子優(yōu)化前后在大腸桿菌表達(dá)宿主中CAI指數(shù)。
其中，圖2-a表示豬干擾素Y天然基因核苷酸序列在大腸桿菌表達(dá)宿主中CAI指數(shù)經(jīng)過程序計算為O. 65;圖2-b表示優(yōu)化后的本發(fā)明的重組豬干擾素Y密碼子在大腸桿菌表達(dá)宿主中CAI指數(shù)經(jīng)過程序計算為O. 82。
圖3-a、圖3-b為豬干擾素Y密碼子優(yōu)化前后在大腸桿菌表達(dá)宿主中最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖。
其中，圖3_a表示豬干擾素Y天然基因核苷酸序列在大腸桿菌表達(dá)宿主中最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖，從圖中可以看出豬干擾素Y天然基因核苷酸序列的低利用率密碼子出現(xiàn)百分比為10%;圖3-b表示優(yōu)化后的本發(fā)明的重組豬干擾素Y密碼子在大腸桿菌表達(dá)宿主中最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖，優(yōu)化后的本發(fā)明的重組豬干擾素Y密碼子序列的低利用率密碼子出現(xiàn)百分比為O。
圖4-a、圖4-b為重組豬干擾素Y密碼子優(yōu)化前后在大腸桿菌表達(dá)宿主中平均GC堿基含量分布區(qū)域圖。
其中，圖4-a表示豬干擾素Y天然基因核苷酸序列在大腸桿菌表達(dá)宿主中平均GC 堿基含量為38. 47% ;圖4-b表示優(yōu)化后的本發(fā)明的重組豬干擾素Y密碼子在大腸桿菌表達(dá)宿主中平均GC堿基含量為45. 76%。
圖5-a、圖5-b為重組豬干擾素Y密碼子優(yōu)化前后mRNA的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。
圖5-a豬干擾素Y天然基因mRNA的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖，圖5_b為密碼子優(yōu)化后的本發(fā)明的重組豬干擾素YmRNA的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。
圖6為重組豬干擾素Y表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建過程圖。
圖7為重組豬干擾素Y基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
其中，泳道I為NdeI和XhoI酶切pET21b載體；泳道2為500bp DNA Ladder ;泳道3為兩端含有NdeI和XhoI酶切位點的重組豬干擾素Y基因PCR產(chǎn)物。
圖8-a、圖8-b為重組豬干擾素Y的SDS-PAGE凝膠電泳圖及相應(yīng)的免疫印跡圖。
圖8-a為重組豬干擾素Y SDS-PAGE凝膠電泳圖。
其中，泳道I為(10-230kDa)寬范圍的預(yù)染的蛋白上樣Marker ;泳道2為未加入 IPTG誘導(dǎo)的重組豬干擾素Y大腸桿菌裂解液；泳道3為加入IPTG誘導(dǎo)的重組豬干擾素Y 大腸桿菌裂解液。
圖8_b為重組豬干擾素Y免疫印跡圖。
其中，泳道l(10_230KDa)寬范圍的預(yù)染的蛋白上樣Marker，泳道2為未加入IPTG 誘導(dǎo)的重組豬干擾素Y大腸桿菌裂解液泳道3為加入IPTG誘導(dǎo)的重組豬干擾素Y大腸桿菌裂解液。
圖9重組豬干擾素Y高效表達(dá)誘導(dǎo)條件優(yōu)化的SDS-PAGE凝膠電泳圖。
其中，泳道I為(10_230kDa)寬范圍的預(yù)染的蛋白上樣Marker ;泳道2為O. 5mmol/ L IPTG誘導(dǎo)Ih的含重組豬干擾素Y大腸桿菌裂解液；泳道3為O. 5mmol/L IPTG誘導(dǎo)2h 的含重組豬干擾素Y大腸桿菌裂解液；泳道4為0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)3h的含重組豬干擾素Y大腸桿菌裂解液；泳道5為O. 5mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h的含重組豬干擾素Y大腸桿菌裂解液；泳道6為lmmol/L IPTG誘導(dǎo)Ih 的含重組豬干擾素Y大腸桿菌裂解液；泳道7為 lmmol/L IPTG誘導(dǎo)2h的含重組豬干擾素Y大腸桿菌裂解液；泳道8為lmmol/L IPTG誘導(dǎo) 3h的含重組豬干擾素Y大腸桿菌裂解液；泳道9為lmmol/L IPTG誘導(dǎo)4h的含重組豬干擾素Y大腸桿菌裂解液；泳道10為1. 5mmol/L IPTG誘導(dǎo)Ih的含重組豬干擾素Y大腸桿菌裂解液；泳道11為1. 5mmol/L IPTG誘導(dǎo)2h的含重組豬干擾素Y大腸桿菌裂解液；泳道 12為1. 5mmol/L IPTG誘導(dǎo)3h的含重組豬干擾素Y大腸桿菌裂解液；泳道13為1. 5mmol/ L IPTG誘導(dǎo)4h的含重組豬干擾素Y大腸桿菌裂解液。
圖10為復(fù)性后的重組豬干擾素Y包涵體SDS-PAGE電泳圖
其中，泳道I為(10_230kDa)寬范圍的預(yù)染的蛋白上樣Marker ;泳道2為用Buffer B第一次清洗后重組豬干擾素Y包涵體沉淀；泳道3為Buffer B第二次清洗后重組豬干擾素Y包涵體沉淀；泳道4為稀釋法復(fù)性后的重組豬干擾素Y ;泳道5為透析法復(fù)性后的重組豬干擾素Y具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，引用實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實施例1重組豬干擾素Y基因優(yōu)化設(shè)計
1.密碼子優(yōu)化
遺傳密碼子有64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用這些密碼子中的一部分。那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子(optimal codons)，那些不被經(jīng)常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子(rare or low-usage codons)。實際上,常用做蛋白表達(dá)或生產(chǎn)的每種生物 (包括大腸桿菌，酵母，哺乳動物細(xì)胞，植物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞)都表現(xiàn)出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛。大腸桿菌、酵母和果蠅中對含最佳密碼子的基因的表達(dá)效率明顯高于含低利用率的密碼子的基因的表達(dá)效率。因此，在異源表達(dá)系統(tǒng)中，密碼子的偏愛性很大程度上影響了重組蛋白的表達(dá)。利用偏愛密碼子(preferred codons)并避免利用稀有的密碼子進(jìn)行基因合成，這種基因的重新設(shè)計叫密碼子優(yōu)化。優(yōu)化過程充分考慮到蛋白表達(dá)不同階段可能遇到的多種復(fù)雜因素，如密碼子適應(yīng)性、mRNA結(jié)構(gòu)以及轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中不同的順式元件。因此，本發(fā)明對豬干擾素Y的基因設(shè)計不僅包括密碼子優(yōu)化，還包括mRNA結(jié)構(gòu)修正、翻譯起始位點的優(yōu)化等。
2.密碼子偏愛性優(yōu)化
密碼子偏愛性在原核基因表達(dá)中已經(jīng)被證實是一個很重要的影響因素，它引起了同一密碼子在不同生物體之間，蛋白的表達(dá)水平之間以及同一操縱子的不同部位間利用率的改變。引起這種偏愛性差異的主要原因是不同細(xì)胞內(nèi)可用的tRNAs量的差異。因此優(yōu)化翻譯系統(tǒng)最佳的方法就是保持密碼子的使用頻率與同源tRNA之間的平衡。在大腸桿菌中表達(dá)哺乳動物基因是不可預(yù)測和具有挑戰(zhàn)的，如在大腸桿菌中，AGG和AGA所對應(yīng)的tRNA分子就很少，這種差異很明顯會影響基因的表達(dá)。
3.將低利用率的密碼子替換成宿主常用密碼子
通?；蛑邪拿艽a子在特定宿主中的利用率越低，該種蛋白的表達(dá)量也就越少，甚至當(dāng)這種密碼子存在與蛋白簇間或者N末端的時候表達(dá)量會更少。在不改變氨基酸序列的前提下將低利用率的密碼子替換為宿主常用密碼子能提高功能蛋白的表達(dá)水平。
任何來源的密碼子如果在宿主生物體內(nèi)的利用率低于5%到10%時，就會出現(xiàn)表達(dá)抑制，當(dāng)這些低利用率密碼子臨近或相連時，對蛋白表達(dá)的影響更大。成簇的低利用率的密碼子抑制了核糖體的運(yùn)動，這是基因不能以合適水平表達(dá)的一個明顯機(jī)制。核糖體翻譯由九個密碼子組成的信使(含幾個低利用率密碼子或全部為低利用率密碼子)時的運(yùn)動速度要比翻譯不含低利用率密碼子的同樣長的信使的速度慢。即使低利用率密碼子簇位于3’ 端，信使最后也會被核糖體“擁擠”而損害，核糖體又回到5’端。3’端低利用率密碼子簇的抑制效應(yīng)可以和全部信使都由低利用率密碼子組成的抑制效應(yīng)一樣大。如果低利用率密碼子簇位于5’端，其效應(yīng)是起始核糖體數(shù)目的全面減少，導(dǎo)致蛋白合成中信使的低效率。去除低利用率的密碼子或者容易被誤讀為終止信號的密碼子能夠防止低表達(dá)或者不表達(dá)。
4.表達(dá)載體和轉(zhuǎn)錄啟動子
雖然密碼子偏愛 在基因表達(dá)中起著重要的作用，但表達(dá)載體和轉(zhuǎn)錄啟動子的選擇同樣重要，N端核苷酸序列的蛋白表達(dá)對于低利用率密碼子和接近起始位點的密碼子AUG 非常敏感。翻譯與mRNA的穩(wěn)定性間也存在著相互的影響，雖然降低翻譯效率會使mRNA由于缺少了核糖體的保護(hù)而更容易被endo-RNAses分解，但目前還沒有它們之間影響的完整解釋。
其他因素也可以影響蛋白表達(dá)，包括使mRNA去穩(wěn)定的序列。穩(wěn)定mRNA 二級結(jié)構(gòu)和接近5’端的分子也對基因表達(dá)有重要的影響。利用翻譯時目的基因上游的開放式閱讀框能夠成功提高難度基因的表達(dá)效率。
發(fā)明人根據(jù)GenBank已公開的豬干擾素Y (Sus scrofa interferon, gamma)的 cDNA序列(GenBank登錄號NM_213948.1)，對該基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后得到本發(fā)明的重組豬干擾素Y基因，如SEQ ID No :1所示。
下面是對重組豬干擾素Y進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化前后各參數(shù)對比如下
1.密碼子適應(yīng)指數(shù)(Codon Adaptation Index, CAI)
由圖2-a可知，密碼子沒有優(yōu)化前，豬干擾素Y天然基因在大腸桿菌中密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)為0.65。由圖2-b可知，通過密碼子優(yōu)化后，使得本發(fā)明的重組豬干擾素Y 基因在大腸桿菌中CAI指數(shù)為0. 82。通常CAI=I時被認(rèn)為該基因在該表達(dá)系統(tǒng)中是最理想的高效表達(dá)狀態(tài)，CAI指數(shù)越低表明該基因在該宿主中表達(dá)水平越差，因此可以看出經(jīng)過了密碼子優(yōu)化后得到的基因序列可以提高重組豬干擾素Y基因在大腸桿菌中的表達(dá)水平。
2.最優(yōu)密碼子使用頻率(Frequency of Optimal Codons, FOP)
由圖3_a可知，基于大腸桿菌表達(dá)載體，密碼子沒有優(yōu)化前，豬干擾素Y天然基因序列的低利用率密碼子出現(xiàn)百分比為10%。這條未進(jìn)行優(yōu)化的基因含有串聯(lián)稀有密碼子， 這些密碼子可能降低翻譯效率，甚至能夠解散翻譯裝配物。由圖3-b可知，通過密碼子優(yōu)化后，本發(fā)明的重組豬干擾素Y基因在大腸桿菌系統(tǒng)中出現(xiàn)低利用率密碼子的頻率為O。
3. GC 喊基含量(GC curve)
GC含量理想分布區(qū)域為30%_70%，在這個區(qū)域外的出現(xiàn)任何峰都會不同程度地影響轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。由圖4-a、圖4-b的豬干擾素Y基因的GC堿基平均含量分布區(qū)域圖對比可知，由圖4-a中顯示豬干擾素Y天然基因中在優(yōu)化前GC堿基平均含量為38. 47%，由圖 4-b中顯示出優(yōu)化后的序列消除了 GC含量在30%-70%區(qū)域外所有堿基，最終得到優(yōu)化后重組豬干擾素Y的GC堿基平均含量為45. 76%。
3.優(yōu)化前后順式作用元件情況如下
權(quán)利要求
1.一種重組豬干擾素Y，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.一種編碼權(quán)利要求1中所述的重組豬干擾素Y的基因,其堿基序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一種載體，所述載體具有權(quán)利要求2的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的載體，所述載體為pET21b。
5.一種大腸桿菌，所述大腸桿菌具有權(quán)利要求3的載體。
6.如權(quán)利要求5所述的大腸桿菌，所述大腸桿菌為BL21(DE3)菌株。
7.一種重組豬干擾素Y的表達(dá)方法，包括如下步驟(1)挑取一個含有權(quán)利要求5或6中所述的大腸桿菌菌落，接入含抗生素的LB培養(yǎng)液， 培養(yǎng)過夜；(2)取過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入于含抗生素的新鮮LB培養(yǎng)液中，震蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期八600_1· O ；(3)在培養(yǎng)物中加入濃度為O.5-1. 5mmol/L的IPTG，37°C，誘導(dǎo)表達(dá)1_4小時后，離心處理收集含有重組豬干擾素Y的大腸桿菌菌體沉淀。
8.—種重組豬干擾素Y的純化和復(fù)性方法，其特征在于，包含如下步驟(1)將權(quán)利要求7中所述的含有重組豬干擾素Y的大腸桿菌菌體沉淀，用預(yù)冷的PBS 重懸，于4°C,以12000rpm/min離心15min,重復(fù)一次；(2)吸去上清，按每克(菌體濕重)加入3-10mL裂解緩沖液BufferA，用磨光玻璃棒攪動，使菌體懸起；(3)每克(菌體濕重)菌體加入3-10μ L濃度為100mmol/L的PMSF，3-100 μ L濃度為 100mg/mL的溶菌酶，冰上攪動20min ；(4)破碎菌體細(xì)胞，4°C，12000rpm/min離心，棄上清。(5)包涵體沉淀用洗漆緩沖液BufferB洗滌，4V，12000rpm/min離心15min,棄上清。 包涵體沉淀重復(fù)本步驟一次；(6)包涵體沉淀用變性緩沖液BufferC溶解，室溫攪拌30_60min ；(7)充分混勻后室溫條件下12000rpm/min離心15min,棄沉淀,取上清，即得到重組豬干擾素Y變性溶液；(8)用變性緩沖液BufferC將重組豬干擾素Y變性溶液的濃度稀釋至0. 2mg/mL，4°C 透析復(fù)性24小時，期間每6小時更換一次緩沖液Buffer D，重組豬干擾素Y復(fù)性溶液經(jīng)濾膜過濾后，即得到重組豬干擾素Y復(fù)性溶液。
9.如權(quán)利要求8所述的純化和復(fù)性方法，其特征在于，所述重組豬干擾素Y復(fù)性溶液可進(jìn)一步用截留分子量IOKDa的超濾濃縮、脫鹽至最小體積，低溫真空干燥，即獲得重組豬干擾素Y粉末。
10.一種藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物包含由權(quán)利要求8或9的方法得到的重組豬干擾素Y。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組豬干擾素γ及其編碼基因、表達(dá)、純化和包涵體復(fù)性方法，屬于生物基因工程領(lǐng)域。重組豬干擾素γ作為一種非特異性廣譜抗病毒生物制劑在獸藥領(lǐng)域具有廣闊的藥用前景，但是與大多基因工程獸藥一樣，豬干擾素γ也存在著產(chǎn)量不足、價格昂貴、質(zhì)量參差不齊等問題。本發(fā)明采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對密碼子優(yōu)化后的重組豬干擾素γ基因進(jìn)行異源表達(dá)。此外，針對原核表達(dá)體系中的豬干擾素γ多以包涵體的形式表達(dá)的問題，本發(fā)明還提供了重組干擾素γ包涵體純化和復(fù)性的方法，使得制得的重組干擾素γ具有較高活力，達(dá)到了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)。
文檔編號C07K1/14GK103059124SQ20121059370
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者馬永, 王安良, 章成昌, 徐春林, 陳晨, 王耀方 申請人:江蘇眾紅生物工程創(chuàng)藥研究院有限公司, 常州京森生物醫(yī)藥研究所有限公司