專利名稱：高效表達(dá)的串聯(lián)豬α、γ干擾素基因及其表達(dá)蛋白的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的基因表達(dá)，特別涉及一種串聯(lián)高效表達(dá)的豬α、Υ干擾素，還涉及所述干擾素的編碼基因及其表達(dá)蛋白的用途。
背景技術(shù)：
干擾素(IFN)是一類具有廣譜抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子。IFN可分為兩個(gè)型(I型和II型)，IFN-α屬于I型干擾素，是機(jī)體細(xì)胞抵抗病毒感染的第一道防線， 具有三大功能抗病毒作用、抗腫瘤作用和免疫調(diào)節(jié)作用。Lefevre等1990年首先克隆了豬 IFN-α (pIFN-α )基因并將其成熟蛋白基因在大腸桿菌中表達(dá)，具有較強(qiáng)的抗病毒活性。 隨后國內(nèi)外學(xué)者用大腸桿菌、腺病毒、酵母等表達(dá)了 pIFN-α，對其生物學(xué)活性進(jìn)行了大量研究。本課題組也曾將PlFN-α克隆入真核表達(dá)載體pVAXl°，轉(zhuǎn)染ΗΕΚ493Α細(xì)胞后表達(dá)的 PIFN-α 活性較低，僅為 lX106_°U/0. ImL0IFN-Y屬于II型干擾素，具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用。1973年樸叫吐和 Slavin發(fā)現(xiàn)來自淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中存在一種與以往發(fā)現(xiàn)的IFN抗原性不同的IFN，命名為II型干擾素。國外研究表明，豬IFN-γ (pIFN-γ )能明顯抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的增殖，在抗豬瘟病毒的細(xì)胞免疫中也具有重要作用。國內(nèi)許多學(xué)者用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)、真核質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)、腺病毒系統(tǒng)、畢赤酵母等表達(dá)了 PlFN-γ，對其生物學(xué)活性進(jìn)行了大量研究。本課題組也曾將pIFN-γ克隆入真核表達(dá)載體pVAXl°，轉(zhuǎn)染ΗΕΚ493Α 細(xì)胞后表達(dá)的pIFN-γ活性較低，僅為lX105_°U/0. lmL。豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，俗稱〃豬藍(lán)耳病"，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起，病毒感染后可以導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、返情、產(chǎn)死胎或弱仔、仔豬死亡及各種年齡的豬不同程度的呼吸道癥狀，并且能破壞豬的免疫系統(tǒng)，引起混合感染或繼發(fā)感染。我國于1995年底爆發(fā)此病，并迅速蔓延到全國多個(gè)省份。在許多規(guī)?；i場，PRRS陽性率很高，有的可達(dá)80%以上。自2006年以來，我國部分地區(qū)豬場發(fā)生了由PRRSV變異株導(dǎo)致的高致病性藍(lán)耳病。該病在臨床上以發(fā)病豬高熱、呼吸困難、皮膚發(fā)紅為主要特征，具有更高的發(fā)病率和死亡率，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了極為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決以上問題，本發(fā)明提供了一種能夠高效表達(dá)的、對高致病性藍(lán)耳病等病毒性疾病有很好防治效果的串聯(lián)豬α、Y干擾素基因。本發(fā)明還提供了所述串聯(lián)豬α、Y干擾素基因通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆至真核表達(dá)載體獲得的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了所述串聯(lián)豬α、Y干擾素基因的制備方法。本發(fā)明還提供了所述串聯(lián)豬α、Y干擾素基因的表達(dá)蛋白的用途。本發(fā)明是通過以下措施實(shí)現(xiàn)的
一種高效表達(dá)的串聯(lián)豬α、y干擾素基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。一種所述序列2的基因通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆至真核表達(dá)載體獲得的重組質(zhì)粒。一種所述的串聯(lián)豬α、Y干擾素基因的合成方法，包括以下步驟
1、將真核質(zhì)粒PVAX1°改造為pMVAXl°
由 GenBank 公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列 GenBank No: V00882，在上游引入AiI酶切位點(diǎn)和pCMV即刻早期啟動(dòng)子的一段序列，在下游引入T7啟動(dòng)子序列和feoRI酶切位點(diǎn)，人工合成后的核苷酸序列如序列表中序列1所示，將此段基因序列通過Ai酶切位點(diǎn)插入pVAXl°載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，提取質(zhì)粒經(jīng)篩選得到SstV ^oRI雙酶切陽性克隆，命名為pMVAXl° ；
所述 pCMV 即刻早期啟動(dòng)子的一段序列為5，-GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCA TCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3’， 所述 T7 啟動(dòng)子序列為5，-AATACGACTCACTATAGGG-3，；
2、構(gòu)建表達(dá)pIFN-α/γ的重組真核質(zhì)粒pMVAXl°-pIFN- α/γ 2.1引物的設(shè)計(jì)及合成
分別設(shè)計(jì)一對擴(kuò)增PlFN-α成熟蛋白和一對擴(kuò)增pIFN-γ成熟蛋白的基因序列的特異性引物，引物序列如下
pIFN-α -Fwd :5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGGCTGCGACCTGCCTCAGA-3’ pIFN-a -Rev :5’ -CTGGCAGTAAGAGCCACCGCCACCGCCACCCTCCTTCTTCCTGAGT-3’ ρIFN-y-Fwd
5 ’ -ACTCAGGAAGAAGGAGGGTGGCGGTGGCGGTGGCTCTTACTGCCAG-3’ pIFN-y-Rev :5’ -GAGCTCGAGAAGCTTATTATTTTGATGCTCTCTG-3’ ； 2. 2從豬的脾或外周血淋巴細(xì)胞中提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到pIFN- α和pIFN- γ的成熟蛋白基因，分別以所述pIFN-a和pIFN-γ的成熟蛋白基因?yàn)槟０?，以相對?yīng)的引物在兩管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出pIFN-a和pIFN-γ的成熟蛋白基因的PCR產(chǎn)物； 2.3 pIFN-a/y融合蛋白基因的擴(kuò)增
將pIFN-α和pIFN-γ的成熟蛋白基因的PCR產(chǎn)物分別膠回收作為下一步PCR反應(yīng)的模板，PCR過程中生成pIFN-a/γ融合蛋白基因，用引物pIFN-a-Fwd和pIFN-γ-Rev擴(kuò)增pIFN-α/γ融合蛋白基因，產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，得pIFN-α/γ融合蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物；
2. 4重組真核表達(dá)質(zhì)粒pMVAXl°-pIFN- a/y的構(gòu)建
用和損ol限制性內(nèi)切酶雙酶切pIFN-a/Y融合蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收得到編碼pIFN-α/γ成熟蛋白的融合蛋白基因片段1，用和損ol限制性內(nèi)切酶雙酶切質(zhì)粒pMVAXl°，膠回收得到包含序列1的載體基因片段2，將融合蛋白基因片段1和載體基因片段2連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)，挑取菌落于卡那霉素抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行feoRI/ZAoI雙酶切鑒定，篩選出陽性克隆，得重組真核表達(dá)質(zhì)粒pMVAXl°-pIFN- a / Y，真核質(zhì)粒PVAX1°中插入的基因核苷酸序列如序列表中序列2所示。步驟2.2 中 PCR反應(yīng)體系為 25μ 中，含 cDNA lPL，Mg2+ 1. 5mmol/L,dNTP 200Mmol/ L，IOXLA PCR Buffer 2. 5PL，pIFN_ a-Fwd和pIFN-a-Rev各400nmol/L或者pIFN-γ-Fwd 和 pIFN-￥-1^￥各4001111101/1，131^1^ LA Taq 2U ；反應(yīng)條件為預(yù)變性 95°C 5min ；然后進(jìn)行；35個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件為95°C 45s, 62°C 45s, 72°C Imin ；然后72°C延伸lOmin，取出產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。步驟2. 3中PCR反應(yīng)體系為25μ 中，含pIFN-α和pIFN-γ的成熟蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物各 1ML，Mg2+ 1. 5mmol/L, dNTP 200Mmol/L, 10XLA PCR Buffer 2. 5μ , pIFN-α -Fwd 和 ρIFN- γ -Rev 濃度均為 400nmol/L, TaKaRa LA Taq 2U ；反應(yīng)條件為預(yù)變性 95°C 5min ； 然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件為95°C 45s, 62°C 45s, 72°C lmin ；然后72°C延伸lOmin，取出產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。

步驟2. 2中豬RNA的提取步驟為無菌采集豬的脾臟或者外周血，用淋巴細(xì)胞分離液分離脾或者血液淋巴細(xì)胞，用10%胎牛血清的1640液在37°C含CO2 5v%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) lh，然后加入50(^g/mL的植物血凝素PHA刺激12h后，用TRIzol試劑提取總RNA。所述的高效表達(dá)的串聯(lián)豬α、Y干擾素基因的表達(dá)蛋白在制備治療豬繁殖與呼吸綜合征的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是
(1)用改造過的真核質(zhì)粒pVAXl°即pMVAXl°表達(dá)pIFN-α/γ串聯(lián)融合蛋白，突破了通過pVAXl°載體表達(dá)pIFN-α、pIFN-γ過程中遇到的表達(dá)量較低和活性較差的局限性；
(2)體外抗病毒試驗(yàn)證明，本發(fā)明構(gòu)建的pIFN-α/γ表達(dá)活性很高，轉(zhuǎn)染W(wǎng)g pMVAXl°-pIFN- α / γ至ΗΕΚ-293Α細(xì)胞的裂解物，用VSV檢測IFN的活性單位高達(dá) lX108 °U/0. ImL,當(dāng)活性在100U以上時(shí)能夠明顯抑制高致病性PRRSV在Marc_145細(xì)胞上的增殖，專用于對高致病性PRRSV等病毒性疾病的預(yù)防治療及減少豬場的經(jīng)濟(jì)損失。


圖1為本發(fā)明改造真核質(zhì)粒pVAXl°為pMVAXl°及克隆pIFN-a/Y融合蛋白基因入 PMVAXl0的示意圖，
圖2為本發(fā)明重組質(zhì)粒pMVAXl°5^I/^boRI雙酶切鑒定圖譜，其中 M 為 DL2，000 DNA Marker,
1為重組陽性質(zhì)粒pMVAXl°的5^1/^boRI雙酶切結(jié)果，
圖3為本發(fā)明重組質(zhì)粒pMVAXl°-pIFN-a/Y的feoRI/損ol雙酶切鑒定圖譜，其中 M 為 DL2，000 DNA Marker,
1和2為兩個(gè)不同重組陽性質(zhì)粒pMVAXl°-pIFN- α/γ的feoRI/損ol雙酶切結(jié)果。
具體實(shí)施例方式.將真核質(zhì)粒pVAXl°改造為pMVAXl° 1.1插入基因的人工合成
由 GenBank公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列(GenBank No: V00882)，在上游引入AiI酶切位點(diǎn)和pCMV即刻早期啟動(dòng)子的一段序列，在下游引入Τ7啟動(dòng)子序列和 ^coRI酶切位點(diǎn)，所述pCMV即刻早期啟動(dòng)子的一段序列為5’-GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTG GAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3’， 所述 T7 啟動(dòng)子序列為 5，-AATACGACTCACTATAGGG-3，；
將這段基因序列拼接在一起交由TaKaRa公司人工合成，人工合成后的核苷酸序列如序列表中序列1所示，并將此段基因序列克隆入T載體。1. 2 pMVAXl°的構(gòu)建及鑒定從T載體上5^1/^boRI雙酶切目的基因并膠回收，與同樣經(jīng)過5^1/^boRI雙酶切的真核質(zhì)粒pVAXl°并膠回收的載體片段在16°C過夜連接，轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)菌，37°C過夜培養(yǎng)16h。挑取菌落于卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中37°C過夜振蕩培養(yǎng)，第二天提取質(zhì)粒， 進(jìn)行雙酶切鑒定。鑒定為陽性的質(zhì)粒命名為pMVAXl°，交由TaKaRa公司測序， PVAXl0中插入的基因序列與序列表中的序列1相吻合。. pIFN-α/γ融合蛋白的基因克隆入pMVAXl° 2.1引物的設(shè)計(jì)及合成
根據(jù) GenBank 公布的 pIFN-α 的基因序列(GenBank no. X57191)和 pIFN-γ 的基因序列(GenBank no. DQ839398 )，分別設(shè)計(jì)一對擴(kuò)增ρIFN- α成熟蛋白和一對擴(kuò)增 PIFN- γ成熟蛋白的基因序列的特異性引物pIFN- α -Fwd, ρIFN- α -Rev和pIFN- y -Fwd, PlFN-Y-Rev0在引物pIFN-α-Fwd的5，端引入feoRI酶切位點(diǎn)和Kozak序列；引物 ρIFN- α -Rev和pIFN- y -Fwd的設(shè)計(jì)按照S0E-PCR的設(shè)計(jì)原則并在pIFN- α禾口 pIFN- γ的基因序列之間引入5個(gè)甘氨酸(Gly)序列作為linker ；在引物pIFN-γ-Rev的5’端引入 Xhol酶切位點(diǎn)，引物序列如下
ρIFN-α -Fwd 5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGGCTGCGACCTGCCTCAGA-3 ’ pIFN-α -Rev: 5' -CTGGCAGTAAGAGCCACCGCCACCGCCACCCTCCTTCTTCCTGAGT-3' ρIFN-y-Fwd:5’ -ACTCAGGAAGAAGGAGGGTGGCGGTGGCGGTGGCTCTTACTGCCAG-3， ρIFN-y-Rev: 5’ -GAGCTCGAGAAGCTTATTATTTTGATGCTCTCTG-3’ 兩對引物分別橫跨pIFN-a和pIFN-γ成熟蛋白編碼區(qū)，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度分別為 550bp和490bp左右，引物由TaKaRa公司合成。2. 2豬脾淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)及總RNA的提取
無菌采集約克豬的脾臟或者外周血，用淋巴細(xì)胞分離液分離脾淋巴細(xì)胞或外周血淋巴細(xì)胞，用10%胎牛血清的1640液在37°C 5v%的CO2培養(yǎng)lh。然后加入50(^g/mL的植物血凝素PHA刺激12h后，用TRIzoI試劑提取總RNA，作為RT-PCR的模板。2. 3 RT-PCR 擴(kuò)增
RNA經(jīng)Oligo d(T)反轉(zhuǎn)錄后得到pIFN-α和pIFN-γ的成熟蛋白基因，以pIFN-a 禾口 pIFN- γ的成熟蛋白基因?yàn)槟０?，分別以pIFN- a -Fwd/pIFN- a -Rev禾口 pIFN- y -Fwd/ pIFN-γ-Rev兩對引物在兩管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25μ 中，含cDNA Ιμ , Mg2+ 1. 5mmol/L, dNTP 200Mmol/L, IOXLA PCR Buffer 2. 5μ , ρIFN-a-Fwd 禾口 ρIFN-a-Rev 各 400nmol/L 或者 pIFN-丫-卩胃(1和？正^^-1^￥各400歷01/1，131^1^ LA Taq 2U。反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C 5min;然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件為95°C 45s, 62°C 45s, 72°C Imin ； 然后72°C延伸lOmin，取出產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。這樣采用RT-PCR技術(shù)分別擴(kuò)增出了 PlFN-α ^PpIFN-Y的成熟蛋白基因的PCR產(chǎn)物。2. 4 pIFN-α / y融合蛋白基因的擴(kuò)增
將pIFN-α和pIFN-γ的成熟蛋白基因的PCR產(chǎn)物分別膠回收作為下一步PCR反應(yīng)的模板，PCR過程中生成ρIFN- α / γ融合蛋白基因，用引物ρIFN- α -Fwd和ρIFN- γ -Rev擴(kuò)增 pIFN-α/γ融合蛋白的基因。PCR反應(yīng)體系為25PL，含pIFN-α和pIFN-γ的成熟蛋白cDNA 模板各 lML，Mg2+ 1. 5mmol/L, dNTP 200Mmol/L, IOXLA PCR Buffer 2· 5μ ，pIFN-α-Fwd 禾口 pIFN-γ-Rev 的濃度均為 400nmol/L，TaKaRa LA Taq 2U。反應(yīng)條件為預(yù)變性 95°C 5min ；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件為95°C 45s, 62°C 45s，72°C lmin ；然后72°C延伸lOmin，取出產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收獲得PlFN-α / γ融合蛋白基因的PCR產(chǎn)物。 2. 5重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
用和損ο 限制性內(nèi)切酶雙酶切pIFN-α/γ融合蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收得到編碼pIFN-α/γ成熟蛋白的融合蛋白基因片段1，用和損ol限制性內(nèi)切酶雙酶切質(zhì)粒pMVAXl°，膠回收得到包含序列1的載體基因片段2，融合蛋白基因片段1和載體基因片段2在16°C過夜連接，轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)菌，37°C過夜培養(yǎng)16h。挑取菌落于卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中37°C過夜振蕩培養(yǎng)，第二天提取質(zhì)粒，進(jìn)行feoRI/ZAoI雙酶切鑒定。 鑒定為陽性的質(zhì)粒pMVAXl°-pIFN- α / γ交由TaKaRa公司測序。用Vector NTI和DNAStar 軟件分析所插入的基因序列和推導(dǎo)氨基酸序列。真核質(zhì)粒PVAX1°中插入的核苷酸序列如序列表中序列2所示，推導(dǎo)氨基酸序列如序列表中序列3所示。重組真核質(zhì)粒表達(dá)的pIFN-α/γ融合蛋白的抗病毒活性測定 3. 1 重組質(zhì)粒 pMVAXl°-pIFN- α /y 轉(zhuǎn)染 HEK-293A 細(xì)胞
實(shí)驗(yàn)組具體操作按Lipofectamine 2000 (Invitrogen)說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染在6孔細(xì)胞板上進(jìn)行，在轉(zhuǎn)染的前一天，消化HEK-293A細(xì)胞，用10%的胎牛血清DMEM (不含抗生素)稀釋細(xì)胞，使其密度達(dá)到2. 5 X IO5個(gè)細(xì)胞/mL，在6孔細(xì)胞板上每孔接種2. 5mL,于37°C 5v%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在滅菌的1. 5mL的離心管中先加入500μ 37°C預(yù)熱的OPTI-MEM 無血清培養(yǎng)基，然后加入1. 0μδ的重組質(zhì)粒pMVAXl°-pIFN- α/γ,輕輕混勻；在另一個(gè)滅菌的1. 5mL的離心管中先加入500μ 37°C預(yù)熱的OPTI-MEM無血清培養(yǎng)基，然后加入2. 5μ Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，在室溫放置5min ；然后將兩個(gè)1. 5mL的離心管中的液體混勻在一起，室溫放置20min ；從CO2培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞板，棄去上清，把混合物輕輕加入到細(xì)胞面上，然后立即把細(xì)胞板放入CO2培養(yǎng)箱中；溫育6h后，吸掉上清，輕輕加入 2. OmL 37°C預(yù)熱的10%的胎牛血清DMEM，放入CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后反復(fù)凍融細(xì)胞轉(zhuǎn)染物2次，12000rpm離心5min，取上清待檢。對照組1 將實(shí)驗(yàn)組的pMVAXl°-pIFN- α/γ替換為空載體質(zhì)粒pMVAXl°，其余方法同實(shí)驗(yàn)組一致，作為對照。對照組2 將實(shí)驗(yàn)組的pMVAXl°-pIFN- α/γ替換為pVAXl°-pIFN_ α，其余方法同實(shí)驗(yàn)組一致，作為對照。對照組3 將實(shí)驗(yàn)組的pMVAXl°-pIFN- α/γ替換為pVAXl°-pIFN_ γ，其余方法同實(shí)驗(yàn)組一致，作為對照。所述pVAXl°-pIFN- α和pVAXl°-pIFN- γ為真核質(zhì)粒載體pVAXl°中只插入 ρIFN-α 或 pIFN-γ 基因，而不插入 Rabbit β -Globin Intron II 基因。3. 2重組質(zhì)粒pMVAXl°-pIFN- α/γ表達(dá)的融合蛋白抗VSV活性檢測
向生長于96孔板上的Marc-145細(xì)胞單層分別加入上述實(shí)驗(yàn)組、對照組1、對照組2和對照組3得到的倍比維持液稀釋的凍融裂解上清，每個(gè)稀釋度4個(gè)孔，于37°C作用24h，吸去上清，每孔接種IOOTCID5ci的VSV，于37°C含C025v%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24_36h觀察各孔細(xì)胞病變，以能抑制50%細(xì)胞病變的樣品的最高稀釋度定義為IFN的1個(gè)活性單位(1U)。經(jīng)檢測，1. 0μδ的重組質(zhì)粒pMVAXl°-pIFN- α/γ轉(zhuǎn)染ΗΕΚ-293Α細(xì)胞后的裂解上清中，IFN的活性單位高達(dá)1 X 108 °U/0. ImL ；而對照組1空載體質(zhì)粒pMVAXl°轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞后的裂解上清無抗VSV活性；對照組2載體質(zhì)粒PVAXf-PlFN- α轉(zhuǎn)染ΗΕΚ-293Α細(xì)胞后的裂解上清中，IFN的活性單位只有1 X 106_°U/0. ImL ；對照組3載體質(zhì)粒pVAXl°-pIFN_ γ 轉(zhuǎn)染ΗΕΚ-293Α細(xì)胞后的裂解上清中，IFN的活性單位只有1 X 105_°U/0. ImL因此，重組質(zhì)粒pMVAXl°-pIFN- α/γ表達(dá)的IFN活性相比pVAXl°-pIFN- α提高了 100倍，比 pVAXl°-pIFN- γ 提高了 1000 倍。
3. 3重組質(zhì)粒pMVAXl°-pIFN- α/γ表達(dá)的融合蛋白抗高致病性PRRSV活性檢測
向生長于96孔板上的Marc-145細(xì)胞單層分別加入上述實(shí)驗(yàn)組、對照組1、對照組2和對照組3得到的倍比維持液稀釋的凍融裂解上清，每個(gè)稀釋度4個(gè)孔，于37°C作用24h， 吸去上清，每孔接種IOOTCID5ci的高致病性PRRSV，于37°C含C025v%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 天后，觀察細(xì)胞病變情況，對照組1空載體PMVAXf細(xì)胞均產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變；對照組2 pVAXl°-pIFN-a在稀釋度為1:104_°以下，對照組3 pVAXl°-pIFN-γ在稀釋度為1:103_°以下，而pMVAXr-pIFN-α/γ實(shí)驗(yàn)組在稀釋度為1: 106_°以下時(shí)(稀釋度1 106_°即為100U)， 均無細(xì)胞病變。說明本發(fā)明重組質(zhì)粒pMVAXl°-pIFN-a/Y表達(dá)的IFN具有非常強(qiáng)的抗高致病性PRRSV的作用。ρIFN-α的量為100U(稀釋度1: IO6.0即為100U)以上時(shí)，對IOOTCID50 的高致病性PRRSV具有明顯的抑制效果，可以應(yīng)用于制備治療高致病性PRRSV的藥物中。
權(quán)利要求
1.一種高效表達(dá)的串聯(lián)豬α、Y干擾素基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。
2.—種權(quán)利要求1所述序列2的基因通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆至真核表達(dá)載體獲得的重組質(zhì)粒。
3.—種權(quán)利要求1所述的串聯(lián)豬α、Y干擾素基因的合成方法，其特征是包括以下步驟3. 1將真核質(zhì)粒pVAXl°改造為pMVAXl° 由 GenBank 公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列 GenBank No: V00882，在上游引入AiI酶切位點(diǎn)和pCMV即刻早期啟動(dòng)子的一段序列，在下游引入T7啟動(dòng)子序列和feoRI酶切位點(diǎn)，人工合成后的核苷酸序列如序列表中序列1所示，將此段基因序列通過Ai酶切位點(diǎn)插入pVAXl°載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，提取質(zhì)粒經(jīng)篩選得到SstV ^oRI雙酶切陽性克隆，命名為pMVAXl° ；所述 pCMV 即刻早期啟動(dòng)子的一段序列為5，-GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCA TCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3’， 所述 T7 啟動(dòng)子序列為5，-AATACGACTCACTATAGGG-3，； 3. 2構(gòu)建表達(dá)pIFN- α /y的重組真核質(zhì)粒pMVAXl°-pIFN_ α/γ 3.2.1引物的設(shè)計(jì)及合成分別設(shè)計(jì)一對擴(kuò)增PlFN-α成熟蛋白和一對擴(kuò)增pIFN-γ成熟蛋白的基因序列的特異性引物，引物序列如下pIFN-α -Fwd :5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGGCTGCGACCTGCCTCAGA-3’ pIFN-a -Rev :5’ -CTGGCAGTAAGAGCCACCGCCACCGCCACCCTCCTTCTTCCTGAGT-3’ ρIFN-y-Fwd 5 ’ -ACTCAGGAAGAAGGAGGGTGGCGGTGGCGGTGGCTCTTACTGCCAG-3’ pIFN-y-Rev :5’ -GAGCTCGAGAAGCTTATTATTTTGATGCTCTCTG-3’ ； 3. 2. 2從豬的脾或外周血淋巴細(xì)胞中提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到pIFN- α和pIFN- γ的成熟蛋白基因，分別以所述pIFN-a和pIFN-γ的成熟蛋白基因?yàn)槟０?，以相對?yīng)的引物在兩管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出pIFN-a和pIFN-γ的成熟蛋白基因的PCR產(chǎn)物； 3.2.3 pIFN-a/y融合蛋白基因的擴(kuò)增將pIFN-α和pIFN-γ的成熟蛋白基因的PCR產(chǎn)物分別膠回收作為下一步PCR反應(yīng)的模板，PCR過程中生成pIFN-a/γ融合蛋白基因，用引物pIFN-a-Fwd和pIFN-γ-Rev擴(kuò)增pIFN-α/γ融合蛋白基因，產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，得pIFN-α/γ融合蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物；3.2. 4重組真核表達(dá)質(zhì)粒pMVAXl°-pIFN- a/y的構(gòu)建用和損ol限制性內(nèi)切酶雙酶切pIFN-a/Y融合蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收得到編碼pIFN-α/γ成熟蛋白的融合蛋白基因片段1，用和損ol限制性內(nèi)切酶雙酶切質(zhì)粒pMVAXl°，膠回收得到包含序列1的載體基因片段2，將融合蛋白基因片段1和載體基因片段2連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)，挑取菌落于卡那霉素抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行feoRI/ZAoI雙酶切鑒定，篩選出陽性克隆，得重組真核表達(dá)質(zhì)粒pMVAXl°-pIFN- a / Y，真核質(zhì)粒PVAX1°中插入的基因核苷酸序列如序列表中序列2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的合成方法，其特征在于步驟3.2. 2中PCR反應(yīng)體系為25μ 中，含 cDNA μ , Mg2+ 1. 5mmol/L, dNTP 200Mmol/L, 10XLA PCR Buffer 2. 5μ , pIFN-α -Fwd 和 ρIFN- α -Rev 各 400nmol/L 或者 ρIFN- γ -Fwd 和 ρIFN- γ -Rev 各 400nmol/L, TaKaRa LA Taq 2U ；反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C 5min ；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件為95°C 45s，62°C 45s, 72°C Imin ；然后72°C延伸lOmin，取出產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的合成方法，其特征在于步驟3.2. 3中PCR反應(yīng)體系為25PL 中，含pIFN- α和pIFN- γ的成熟蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物各 μ ，Mg2+ 1. 5mmol/L, dNTP 200Mmol/L, IOXLA PCR Buffer 2· 5μ ，pIFN-α-Fwd 和 pIFN-γ-Rev 濃度均為 400nmol/L， TaKaRa LA Taq 2U ；反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C 5min ；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件為95°C 45s, 62°C 45s, 72°C Imin ；然后72°C延伸lOmin，取出產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的合成方法，其特征在于步驟3.2. 2中豬RNA的提取步驟為無菌采集豬的脾臟或者外周血，用淋巴細(xì)胞分離液分離脾或者血液淋巴細(xì)胞，用10%胎牛血清的1640液在37°C含CO2 5v%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh，然后加入50(^g/mL的植物血凝素PHA 刺激1 !后，用TRIzoI試劑提取總RNA。
7.—種權(quán)利要求1所述的高效表達(dá)的串聯(lián)豬α、Y干擾素基因的表達(dá)蛋白在制備治療豬繁殖與呼吸綜合征的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因表達(dá)領(lǐng)域，高效表達(dá)的串聯(lián)豬α、γ干擾素基因核苷酸序列見序列2。序列2的基因克隆至真核表達(dá)載體獲得的重組質(zhì)粒。串聯(lián)豬α、γ干擾素基因的合成方法將Rabbitβ-GlobinIntronII、pCMV即刻早期啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子插入pVAX1 、得到pMVAX1 ，將融合蛋白基因pIFN-α/γ插入pMVAX1 ，得pMVAX1 -pIFN-α/γ。其表達(dá)蛋白在制備治療豬繁殖與呼吸綜合征的藥物中的應(yīng)用。突破了通過pVAX1 表達(dá)pIFN-α、pIFN-γ時(shí)表達(dá)量低活性差的局限性，活性達(dá)1×108.0U/0.1mL，能明顯抑制高致病性PRRSV增殖，減少豬場的經(jīng)濟(jì)損失。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102212539SQ20111008755
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月8日
發(fā)明者叢小燕, 吳家強(qiáng), 孫文博, 張秀美, 時(shí)建立, 李俊, 杜以軍, 王金寶, 齊靜 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所