專利名稱：純化基因工程重組干擾素的免疫磁性分離技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程重組蛋白的分離技術(shù)，特別是利用免疫磁性分離技術(shù)純化干擾素，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
干擾素(Interferon，IFN)是機(jī)體受外源刺激產(chǎn)生的一類調(diào)節(jié)蛋白，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性。在臨床上對(duì)病毒性肝炎、帶狀皰疹、淋巴瘤、白血病等均有一定的療效?；蛑亟M人干擾素α-2b(α-2bIFN)作為最早的基因重組蛋白質(zhì)類藥物之一，1986年即在歐美上市(美國(guó)Schering-Plough公司)。1990年，國(guó)內(nèi)通過(guò)自主研制及引進(jìn)國(guó)外技術(shù)，相繼有多家企業(yè)投入商業(yè)化生產(chǎn)，目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)年銷售額已達(dá)10億元，美國(guó)年銷售額20多億美元?；蛑亟M人干擾素主要利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)，系胞內(nèi)活性表達(dá)產(chǎn)物，分離純化過(guò)程復(fù)雜，要經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎、離心分離、鹽析沉淀、溶解沉淀、疏水層析、陰陽(yáng)離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析等過(guò)程。由于分離過(guò)程步驟多，造成產(chǎn)品收率較低、成本高。目前，一些公司通常采用親和層析以提高純化效率和特異性，但在親和層析之前也要經(jīng)過(guò)鹽析、疏水或離子交換層析等處理才能獲得較高的純化效率。另外，親和層析介質(zhì)同特異性抗體的連接多采用巨毒的溴化氰作為偶聯(lián)劑，增加了工藝的危險(xiǎn)性。目前國(guó)內(nèi)外各企業(yè)均致力于干擾素分離純化的新技術(shù)的開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)工藝的更新。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為蛋白類基因工程產(chǎn)物的分離純化開(kāi)辟一條新的途徑，涉及純化基因工程重組干擾素的磁性微球的制備、活化和致敏，以及磁性分離裝置的制備。
本發(fā)明采用瓊脂糖、聚乙烯醇、纖維素等材料分別制備了表面帶有羥基的磁性微球，以環(huán)氧氯丙烷對(duì)微球進(jìn)行活化，導(dǎo)入活性氨基后，并采用戊二醛作為連接臂與抗干擾素IgG抗體連接，得到可用于干擾素分離純化的免疫磁性微球。所使用的抗干擾素IgG抗體可以是經(jīng)純化精制的抗干擾素單克隆或多克隆IgG抗體。
用上述免疫磁性微球和磁性分離裝置對(duì)干擾素的發(fā)酵菌體裂解液或預(yù)處理的菌體裂解液進(jìn)行免疫磁性分離，活性回收率超過(guò)50％，純化后的人干擾素(IFN)比活性高于1.0×108IU/mg，SDS-PAGE凝膠電泳分析純度接近100％，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。純化后樣品中動(dòng)物源性抗體含量低于國(guó)家規(guī)定的每個(gè)劑量100ng以下的要求。
本發(fā)明的有益效果是利用該免疫磁性分離技術(shù)純化基因工程重組干擾素(IFN)，操作簡(jiǎn)便、快速，無(wú)須對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，可以直接從發(fā)酵菌體的裂解液中，一步純化得到高純度的目的蛋白，大大簡(jiǎn)化分離純化的步驟，提高產(chǎn)品收率。分離純化條件溫和，該免疫磁性微球可重復(fù)使用10次以上。本發(fā)明可望替代免疫親和層析柱，成為一種快速、高效分離純化干擾素的新技術(shù)。


圖1磁性微球的掃描電鏡照片其中 A圖為瓊脂糖磁性微球(×1500)；B圖為纖維素磁性微球(×1200)；C圖為聚乙烯醇磁性微球(×300)。
圖2磁性分離裝置示意圖其中(1)柱狀的反應(yīng)密封容器；(2)免疫磁性微球；(3)磁鐵；(4)末端出液閥；(5)反應(yīng)液；(6)上端通氣閥；(7)收集容器。
圖3干擾素的SDS-PAGE凝膠電泳分析圖中各泳道條件為泳道a標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；泳道bα-2b干擾素發(fā)酵菌體裂解液；泳道c硫胺沉淀處理的菌體裂解液；泳道d瓊脂糖免疫磁性微球分離結(jié)果；泳道e纖維素免疫磁性微球分離結(jié)果；泳道f聚乙烯醇免疫磁性微球分離結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
一.抗干擾素IgG抗體的制備1)Anti-IFN血清的制備取人干擾素(IFN)標(biāo)準(zhǔn)品，與等體積的弗氏完全佐劑充分混合乳化即得人干擾素(IFN)抗原，取人干擾素(IFN)抗原，分別對(duì)2只日本大耳白雄性家兔(體重2Kg)肌肉及皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射。追加注射采用弗氏不完全佐劑乳化制備抗原，每隔兩周加強(qiáng)注射一次，共三次，劑量遞減。最后一次免疫3天后靜脈取血，用間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，測(cè)得血清的抗體中和效價(jià)為大于1∶10000后，腹動(dòng)脈放血，將全血靜置2小時(shí)，3000rpm離心20分鐘，收集血清于55℃水浴中滅活30分鐘，分裝后于-20℃冷凍保存；2)Anti-IFN IgG抗體的純化取Anti-IFN血清，加入等體積的PBS混勻后，分別加入等體積的飽和硫銨沉淀，離心收集沉淀，沉淀物溶于PBS中，4℃透析過(guò)夜，得到粗提的Anti-IFN免疫球蛋白，將上述免疫球蛋白粗品，采用DEAE-cellulose 52離子交換層析進(jìn)行梯度洗脫，收集合并IgG洗脫峰，經(jīng)蒸餾水透析，冷凍干燥后得精制兔抗干擾素IgG多克隆抗體。
二.免疫磁性微球的制備磁性微球，包括反相物理包埋法制備的瓊脂糖磁性微球和纖維素磁性微球，反相懸浮交聯(lián)法制備的聚乙烯醇磁性微球等含有活性羥基基團(tuán)的磁性微球；制備工藝包括下屬過(guò)程1)磁流體的制備取FeCl2·4H2O溶于去離子水中，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾除雜質(zhì)，然后加入一定量的聚乙二醇和雙氧水，混勻后用NaOH溶液調(diào)至pH9～11，在50～80℃水浴中反應(yīng)3～6小時(shí)，得到棕黑色磁性膠體粒子的穩(wěn)定懸浮液即磁流體；
2)瓊脂糖磁性微球的制備取甲苯，四氯化碳以及Span-80，預(yù)熱至60～80℃，作為有機(jī)相；將一定量的磁流體加入到瓊脂糖溶液中，于沸水浴中加熱溶解，并迅速轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中，在2000～5000rpm攪拌下反應(yīng)5～30分鐘后，迅速冷卻至室溫；最后用乙醚、蒸餾水清洗，篩分粒徑在100～300μm之間的瓊脂糖磁性微球，于2～8℃保存?zhèn)溆谩?br> 3)聚乙烯醇磁性微球的制備取200#汽油、四氯化碳以及Span-80混勻，作為有機(jī)相；配制一定濃度聚乙烯醇溶液，加入一定量的磁流體，冰浴5～20分鐘，加入戊二醛溶液和鹽酸，混勻后迅速倒入有機(jī)相中，在2000～5000rpm下分散0.5～2小時(shí)，緩慢升溫至60～80℃再繼續(xù)反應(yīng)1～3小時(shí)；最后用乙醚、蒸餾水淋洗，篩分粒徑在100～300μm之間的聚乙烯醇磁性微球，于2～8℃保存?zhèn)溆茫?)纖維素磁性微球的制備將NaOH溶液加入到一定量的脫脂棉中，浸泡1～4小時(shí)，擠去堿液，10～30℃下老化后，加入一定量的二硫化碳混勻，密封后繼續(xù)反應(yīng)2～8小時(shí)，再加入一定濃度的NaOH溶液反應(yīng)5～10小時(shí)，得到橙紅色的黃原酸酯粘膠液；取氯苯、四氯化碳和油酸鉀，20～50℃水浴攪拌混勻后，加入一定量溶有磁流體的黃原酸酯粘膠液，在2000～5000rpm下分散20～60分鐘后升溫至75～100℃，再繼續(xù)反應(yīng)1～4小時(shí)；最后用乙醚、蒸餾水淋洗，篩分粒徑在100～300μm之間的纖維素磁性微球，于2～8℃保存?zhèn)溆谩?br> 5)磁性微球的活化取一定量的磁性微球在堿性條件下加入一定體積的環(huán)氧氯丙烷，在25～40℃下進(jìn)行活化2～4小時(shí)，洗凈環(huán)氧氯丙烷后加入2～20％氨水，室溫反應(yīng)3～9小時(shí)，充分淋洗后再加2～20％戊二醛溶液，室溫反應(yīng)1～5小時(shí)，最后用蒸餾水洗掉過(guò)量的戊二醛。
6)磁性微球的致敏在2～8℃下，取一定量的活化好的磁性微球，加入含有抗干擾素的單克隆或多克隆IgG抗體的NaHCO3-NaCO3緩沖液，充分反應(yīng)后經(jīng)PBS淋洗，加入NaBH4進(jìn)行還原，然后用PBS洗凈即得到可用于純化干擾素(IFN)的免疫磁性微球，抗體偶聯(lián)量為3～15mg/mL球。
三.干擾素(IFN)的免疫磁性分離取免疫磁性微球經(jīng)PBS充分清洗后，置于磁性分離裝置的容器中；加入用緩沖液稀釋的基因工程重組干擾素(IFN)的發(fā)酵菌體裂解液或預(yù)處理的裂解液，于2～8℃緩慢振蕩反應(yīng)3～24小時(shí)，反應(yīng)后將容器置于磁性分離裝置上，吸附固定磁性微球，棄去反應(yīng)液，經(jīng)PBS清洗后再加入甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH1.5～3.5)，于2～8℃緩慢振蕩反應(yīng)1～5小時(shí)用于解離吸附的干擾素(IFN)，再將玻璃容器置于分離裝置上，吸附磁性微球，收集解離液，立即用高濃度的PB緩沖液(pH6.5～8.0)中和，得到純化的基因工程重組干擾素(IFN)。免疫磁性微球用PBS清洗后，于2～8℃保存可重復(fù)使用。
采用ELISA法測(cè)定純化后的干擾素(IFN)免疫學(xué)活性，用細(xì)胞抑制病變法測(cè)定其生物學(xué)活性。純化后干擾素(IFN)的各項(xiàng)純度指標(biāo)及動(dòng)物源IgG含量均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。直接純化發(fā)酵菌體裂解液和經(jīng)硫銨沉淀預(yù)處理的裂解液的干擾素(IFN)吸附量可達(dá)到9.6×105IU/ml和8.0×105IU/ml。用免疫磁性微球進(jìn)行多次純化實(shí)驗(yàn)，平均活性回收率大于50％，平均比活性大于1.0×108IU/mg。SDS-PAGE凝膠電泳分析免疫磁性分離純化的干擾素(IFN)純度接近100％。
實(shí)施例一.
一.抗IFNα-2b抗體IgG的制備1.抗血清的制備取1mg/mL的IFNα-2b標(biāo)準(zhǔn)品2mL，與等體積的弗氏完全佐劑充分混合乳化后得IFNα-2b乳化抗原。取2mL IFNα-2b的乳化抗原，分別對(duì)2只家兔(日本大耳白，雄性，體重2Kg)進(jìn)行肌肉及皮下的多點(diǎn)注射。追加注射采用弗氏不完全佐劑乳化制備抗原，每隔兩周加強(qiáng)注射一次，共三次，劑量遞減。最后一次免疫6天后，腹動(dòng)脈采血，將全血靜置2小時(shí)，3000rpm離心20分鐘，收集血清于55℃水浴中滅活30分鐘，分裝后于-20℃冷凍保存。
2.抗IFNα-2b IgG抗體的純化取抗IFNα-2b血清10mL，加入等體積的PBS混勻后，分別用50％和33％的飽和硫銨進(jìn)行分級(jí)鹽析，離心收集沉淀，沉淀物溶于PBS中，4℃透析過(guò)夜，得到粗提的抗IFNα-2b免疫球蛋白。將上述分級(jí)鹽析的免疫球蛋白粗品，進(jìn)行DEAE-cellulose 52離子交換層析，以0.02M PB緩沖液(pH8.0)洗脫，收集合并IgG組分，以去離子水透析，冷凍干燥后得精制兔抗IFNα-2b(Anti-IFNα-2b)IgG抗體，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)為單一條帶。
二.瓊脂糖免疫磁性微球的制備1.磁流體的制備取6克FeCl2·4H2O溶于400mL去離子水中，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾除去雜質(zhì)。然后加入150克聚乙二醇和100μL 30％H2O2混勻，用3M NaOH調(diào)溶液pH11，在50～60℃水浴中反應(yīng)4小時(shí)，得到棕黑色磁性膠體粒子的穩(wěn)定懸浮液即磁流體。
2.瓊脂糖磁性微球的制備在250ml三角瓶中加入75mL甲苯，30mL四氯化碳以及1.2mL Span-80，預(yù)熱至70℃，作為有機(jī)相；取1克磁流體，加入到30mL 6％瓊脂糖溶液中，于100℃水浴中加熱溶解作為水相。將水相迅速轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中，3000rpm攪拌15分鐘，然后迅速冷卻至室溫，得瓊脂糖磁性微球。分別用乙醚、蒸餾水淋洗，篩分粒徑范圍在100～300μm之間的磁性微球，于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.瓊脂糖磁性微球的活化和致敏取瓊脂糖磁性微球1mL，加入2mL 2M NaOH和1mL環(huán)氧氯丙烷，30℃下，振蕩反應(yīng)2小時(shí)，抽濾后分別用丙酮，蒸餾水清洗。加入10％氨水2mL，室溫靜置反應(yīng)6小時(shí)。充分洗滌后，加入5％戊二醛2mL，室溫振蕩反應(yīng)2小時(shí)，再用蒸餾水洗去過(guò)量的戊二醛，得活化的瓊脂糖磁性微球。在上述微球1mL中加入5mL含有15mgAnti-IFNα-2b多克隆IgG抗體的0.1MNaHCO3-NaCO3緩沖液(pH9.6)，4℃反應(yīng)過(guò)夜。經(jīng)PBS充分洗滌后，加入2mL0.5％NaBH4進(jìn)行還原，再經(jīng)PBS充分洗滌后即得到可用于純化IFNα-2b的瓊脂糖免疫磁性微球。用Lowry法測(cè)定抗體的偶聯(lián)量為12.8mg/mL球。
三.α-2bIFN的免疫磁性分離取致敏后的瓊脂糖磁性微球1mL，置于磁性分離裝置的玻璃容器中；取IFNα-2b發(fā)酵菌體裂解液1mL，10000rpm離心10分鐘，取200μL上清液于10mLPBS中(稀釋50倍)，然后加入到玻璃容器中，于4℃緩慢振蕩反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)后將玻璃容器置于磁性分離裝置上，吸附固定磁性微球，棄去反應(yīng)液，然后用PBS清洗6次。再加入4mL 0.1M甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH2.5)，4℃振蕩2小時(shí)，解離被免疫磁性微球吸附的IFNα-2b。將玻璃容器置于分離裝置上，吸附磁性微球，并收集解離液，立即用少量1M PB緩沖液(pH7.0)中和，得純化的IFNα-2b。免疫磁性微球經(jīng)PBS清洗后，于4℃保存，備再次使用。
采用ELISA法檢測(cè)純化后的IFNα-2b免疫學(xué)活性，用細(xì)胞抑制病變法測(cè)定其生物學(xué)活性。采用致敏的瓊脂糖磁性微球直接純化α-2bIFN發(fā)酵菌體裂解液，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，平均吸附量為9.6×105IU/ml，平均活性回收率為88.2％，平均比活性為1.5×108IU/mg，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行純度分析，純度接近100％，各項(xiàng)指標(biāo)及兔源IgG含量均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，并顯示了良好的重現(xiàn)性。
實(shí)施例二.
一.纖維素免疫磁性微球的制備1.纖維素磁性微球的制備取100g脫脂棉用19％NaOH溶液800mL浸泡2小時(shí)，擠去堿液，25℃老化3天；加入50mL二硫化碳混勻，密封后28℃振蕩反應(yīng)5小時(shí)，再加入750～850mL的6％NaOH溶液混勻，28℃振蕩5小時(shí)則得到橙紅色黃原酸酯粘膠液。在500ml三頸瓶中加入180mL氯苯、30mL四氯化碳以及0.5克油酸鉀，40℃水浴攪拌混勻作為有機(jī)相。取含有1克磁流體的黃原酸酯粘膠液70mL，加入到有機(jī)相中，3000rpm分散30分鐘后，迅速升溫至90℃，繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，得纖維素磁性微球。分別用乙醚、蒸餾水淋洗，篩分篩選粒徑在100～300μm之間的纖維素磁性微球，于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.纖維素磁性微球的活化和致敏取纖維素磁性微球1mL，加入2mL 3M NaOH和1mL環(huán)氧氯丙烷，40℃下振蕩反應(yīng)2.5小時(shí)，抽濾后分別用丙酮，蒸餾水清洗。加入4mL 5％氨水，室溫靜置反應(yīng)9小時(shí)。充分洗滌后加入5mL 2％戊二醛，室溫振蕩5小時(shí)，再用蒸餾水洗去過(guò)量的戊二醛，得活化的纖維素磁性微球。在上述微球1mL中加入5mL含有12mg Anti-IFNα-2b IgG多克隆抗體的0.1MNaHCO3-NaCO3緩沖液(pH9.6)，4℃反應(yīng)過(guò)夜。經(jīng)PBS充分洗滌后，加入2mL0.5％NaBH4進(jìn)行還原，再經(jīng)PBS充分洗滌后即得到可用于純化IFNα-2b的纖維素免疫磁性微球。用Lowry法測(cè)定抗體的偶聯(lián)量為11.8mg/mL球。
二.α-2bIFN的免疫磁性分離取纖維素磁性微球1mL，置于磁性分離裝置的玻璃容器中；取α-2bIFN發(fā)酵菌體裂解液5mL，10000rpm離心10分鐘，再取上清液加入等體積的PBS混勻，緩慢加入等體積預(yù)冷的飽和硫銨溶液，混勻，置于冰浴上，放置4小時(shí)。4℃，6000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀溶于5ml PBS，用0.1M PBS透析，取500μL透析液于10mL PBS中(稀釋20倍)，然后加入到玻璃容器中，于4℃緩慢振蕩反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)后將玻璃容器置于磁性分離裝置上，吸附固定磁性微球，棄去反應(yīng)液，然后用PBS清洗5次。再加入4mL 0.1M甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH2.5)，4℃振蕩2小時(shí)，解離被免疫磁性微球吸附的IFNα-2b。將玻璃容器置于分離裝置上，吸附磁性微球，并收集解離液，立即用少量1M PB緩沖液(pH7.0)中和，得純化的IFNα-2b。免疫磁性微球經(jīng)PBS清洗后，于4℃保存，備再次使用。
采用ELISA法檢測(cè)純化后的IFNα-2b免疫學(xué)活性，用細(xì)胞抑制病變法測(cè)定其生物學(xué)活性。采用致敏的纖維素磁性微球純化經(jīng)硫胺沉淀預(yù)處理后的IFNα-2b發(fā)酵菌體裂解液，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，平均吸附量為8.0×105IU/ml，平均活性回收率為50.3％，平均比活性為1.4×108IU/mg，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行純度分析，純度接近100％，各項(xiàng)指標(biāo)及兔源IgG含量均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，并顯示了良好的重現(xiàn)性。
實(shí)施例三.
一.聚乙烯醇免疫磁性微球的制備1.聚乙烯醇磁性微球的制備在500ml三頸瓶中加入140mL 200#汽油、110mL四氯化碳以及5mL Span-80混勻作為有機(jī)相；配制10％聚乙烯醇50ml，加入0.6克磁流體后冰浴15分鐘，再加入25％戊二醛5mL和1N HCL 6mL；混勻后迅速加入有機(jī)相中，3000rpm攪拌30分鐘，然后升溫至70℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2小時(shí)，得聚乙烯醇磁性微球。分別用乙醚、蒸餾水淋洗，篩選粒徑在100～300μm之間的聚乙烯醇磁性微球，于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.聚乙烯醇磁性微球的活化和致敏取聚乙烯醇磁性微球1ml，加入10mL二甲基亞砜和3mL環(huán)氧氯丙烷，40℃，緩慢滴加2M NaOH 10mL，繼續(xù)反應(yīng)4小時(shí)后，抽濾，分別用丙酮，蒸餾水清洗。加入1.5mL15％氨水，室溫靜置反應(yīng)3小時(shí)。充分洗滌后加入1mL 10％戊二醛，室溫振蕩1小時(shí)，再用蒸餾水洗去過(guò)量的戊二醛，得活化的聚乙烯醇磁性微球。在上述微球1mL中加入5mL含有8mgAnti-IFNα-2b Mab IgG抗體的0.1M NaHCO3-NaCO3緩沖液(pH9.6)，4℃反應(yīng)過(guò)夜。經(jīng)PBS充分洗滌后，加入2mL 0.5％NaBH4進(jìn)行還原，再經(jīng)PBS充分洗滌后即得到可用于純化IFNα-2b的聚乙烯醇免疫磁性微球。用Lowry法測(cè)定抗體的偶聯(lián)量為3.7mg/mL球。
二.α-2bIFN的免疫磁性分離取聚乙烯醇磁性微球1mL，置于磁性分離裝置的玻璃容器中；取α-2bIFN發(fā)酵菌體裂解液1mL，10000rpm離心10分鐘，取100μL上清液于10mL PBS中(稀釋100倍)，然后加入到玻璃容器中，于4℃緩慢振蕩反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)后將玻璃容器置于磁性分離裝置上，吸附固定磁性微球，棄去反應(yīng)液，然后用PBS清洗6次。再加入4mL 0.1M甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH2.5)，4℃振蕩2小時(shí)，解離被免疫磁性微球吸附的IFNα-2b。將玻璃容器置于分離裝置上，吸附磁性微球，并收集解離液，立即用少量1M PB緩沖液(pH7.0)中和，得純化的IFNα-2b。免疫磁性微球經(jīng)PBS清洗后，于4℃保存，備再次使用。
采用ELISA法檢測(cè)純化后的IFNα-2b免疫學(xué)活性，用細(xì)胞抑制病變法測(cè)定其生物學(xué)活性。采用致敏的聚乙烯醇磁性微球直接純化α-2bIFN發(fā)酵菌體裂解液，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，平均吸附量為4.5×105IU/ml，平均活性回收率為93.9％，平均比活性為1.2×108IU/mg，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行純度分析，純度接近100％，各項(xiàng)指標(biāo)及鼠源IgG含量均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，并顯示了良好的重現(xiàn)性。
權(quán)利要求
1.一種純化基因工程重組干擾素的免疫磁性分離技術(shù)，它包括1)采用瓊脂糖、聚乙烯醇、纖維素等材料分別制備表面帶有羥基的磁性微球；2)對(duì)含有羥基的磁性微球進(jìn)行活化，并引入戊二醛的側(cè)臂；3)通過(guò)與抗干擾素IgG抗體連接，將磁性微球致敏為免疫磁性微球；4)利用該免疫磁性微球和磁性分離裝置直接從基因工程菌的發(fā)酵菌體裂解液或經(jīng)預(yù)處理的菌體裂解液中分離純化干擾素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化基因工程重組干擾素的免疫磁性分離技術(shù)，其特征在于制備的微球是表面帶有羥基的磁性微球，如反相懸浮包埋法制備的瓊脂糖磁性微球和纖維素磁性微球，反相懸浮交聯(lián)法制備的聚乙烯醇磁性微球等含有羥基活性基團(tuán)的磁性微球；制備工藝包括下屬過(guò)程1)磁流體的制備取FeCl2·4H2O溶于去離子水中，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾除雜質(zhì)，然后加入一定量的聚乙二醇和雙氧水，混勻后用NaOH溶液調(diào)至pH9～11，在50～80℃水浴中反應(yīng)3～6小時(shí)，得到棕黑色磁性膠體粒子的穩(wěn)定懸浮液即磁流體；2)瓊脂糖磁性微球的制備在容器中加入甲苯，四氯化碳以及Span-80，預(yù)熱至50～80℃，作為有機(jī)相；將一定量的磁流體加入到瓊脂糖溶液中，于60～100℃水浴中加熱溶解，并迅速轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中，快速攪拌后，迅速冷卻至室溫；最后用乙醚、蒸餾水清洗，經(jīng)篩分處理后，于2～8℃保存?zhèn)溆茫?)聚乙烯醇磁性微球的制備在容器中加入汽油、四氯化碳以及Span-80混勻，作為有機(jī)相；用蒸餾水配制5～20％的聚乙烯醇溶液，加入一定量的磁流體，冰浴5～20分鐘，加入戊二醛溶液和1N HCl，混勻后迅速倒入有機(jī)相中，充分?jǐn)嚢韬?，緩慢升溫?0～80℃再繼續(xù)反應(yīng)1～5小時(shí)；最后用乙醚、蒸餾水淋洗，經(jīng)篩分處理后，于2～8℃保存?zhèn)溆茫?)纖維素磁性微球的制備在一定量的纖維素材料中加入10～30％NaOH溶液，浸泡1～4小時(shí)，擠去堿液，10～50℃下老化，加入一定量的二硫化碳混勻，密封，10～50℃后繼續(xù)反應(yīng)2～10小時(shí)，再加入2～20％NaOH溶液，10～50℃振蕩反應(yīng)2～10小時(shí)，得到橙紅色的黃原酸酯粘膠液；在容器中加入氯苯、四氯化碳和油酸鉀，10～50℃水浴，攪拌混勻后，加入一定量溶有磁流體的黃原酸酯粘膠液，充分?jǐn)嚢韬螅郎刂?5～100℃，再繼續(xù)反應(yīng)1～4小時(shí)；最后用乙醚、蒸餾水淋洗，經(jīng)篩分處理后，于2～8℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化基因工程重組干擾素的免疫磁性分離技術(shù)，其特征在于抗干擾素的IgG抗體可以為抗干擾素的多克隆抗體或單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化基因工程重組干擾素的免疫磁性分離技術(shù)，其特征在于所述磁性微球的活化是在堿性條件下加入一定體積的環(huán)氧氯丙烷，在15～60℃下活化2～6小時(shí)，洗凈環(huán)氧氯丙烷后加入2～20％氨水，室溫反應(yīng)3～12小時(shí)，充分淋洗后再加入2～20％戊二醛溶液，室溫振蕩反應(yīng)1～5小時(shí)，最后再用蒸餾水洗掉過(guò)量的戊二醛。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化基因工程重組干擾素的免疫磁性分離技術(shù)，其特征在于所述磁性微球的致敏是在2～8℃下，于NaHCO3-NaCO3緩沖液中與抗干擾素單克隆或多克隆的IgG抗體進(jìn)行偶聯(lián)，經(jīng)PBS充分洗凈后，加入NaBH4進(jìn)行還原，然后用PBS洗凈即得到可用于純化干擾素(IFN)的免疫磁性微球，其抗體偶聯(lián)量為3～15mg/mL球。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化基因工程重組干擾素的免疫磁性分離技術(shù)，其特征在于所述磁性分離裝置見(jiàn)圖2，其形狀結(jié)構(gòu)為柱狀的反應(yīng)密封容器(1)，內(nèi)盛有免疫磁性微球(2)，倒立，容器外圍(或兩側(cè))設(shè)置磁鐵(3)，末端的出口使用出液閥(4)來(lái)控制稀釋的干擾素(IFN)發(fā)酵菌體裂解液或預(yù)處理的裂解反應(yīng)液(5)，上端設(shè)有通氣孔使用通氣閥(6)來(lái)控制，下面設(shè)置一個(gè)盛放反應(yīng)液的收集容器(7)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化基因工程重組干擾素的免疫磁性分離技術(shù)，其特征在于所述免疫磁性分離過(guò)程是取免疫磁性微球置于磁性分離裝置的容器中，加入用緩沖液稀釋的基因工程重組干擾素的發(fā)酵菌體裂解液或預(yù)處理的裂解液，于2～8℃緩慢振蕩反應(yīng)，反應(yīng)后將容器置于磁性分離裝置上，吸附固定磁性微球，棄去反應(yīng)液，經(jīng)PBS充分清洗后再加入甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH1.5～3.5)，于2～8℃緩慢振蕩解離吸附的干擾素(IFN)，將玻璃容器置于分離裝置上，吸附磁性微球，收集解離液，立即用高濃度的PB緩沖液(pH6.5～8.0)中和，得到純化的干擾素，免疫磁性微球用PBS清洗后，于2～8℃保存可重復(fù)使用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化基因工程重組干擾素的免疫磁性分離技術(shù)，其特征在于該技術(shù)可直接純化稀釋10～100倍的人干擾素(IFN)發(fā)酵菌體裂解液；也可以純化經(jīng)預(yù)處理的菌體裂解液，預(yù)處理方法包括硫銨沉淀、聚乙二醇沉淀、等電點(diǎn)沉淀等。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因工程重組蛋白的分離技術(shù)，特別是利用免疫磁性分離技術(shù)分離純化基因工程重組干擾素(interferon，IFN)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用不同材料制備含有羥基的磁性微球，經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化后，導(dǎo)入活性氨基，用戊二醛作為連接臂與抗干擾素抗體連接，即得到可用于干擾素分離純化的免疫磁性微球。用該免疫磁性微球和磁性分離裝置對(duì)基因工程重組干擾素的發(fā)酵菌體裂解液進(jìn)行分離純化，活性回收率超過(guò)50％，純化后的干擾素比活性高于1.0×10
文檔編號(hào)C07K14/555GK1524878SQ0314427
公開(kāi)日2004年9月1日 申請(qǐng)日期2003年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月15日
發(fā)明者白鋼, 楊文博, 陳家琪, 曹宇, 曹學(xué)琳, 張磊, 白 鋼 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)