專利名稱：全基因合成雞α干擾素基因及蛋白表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程生物制藥領(lǐng)域，涉及利用全基因合成技術(shù)獲得雞α干擾素 基因及其干擾素蛋白的原核表達(dá)。
二
背景技術(shù)：
目前，隨著我國養(yǎng)雞規(guī)模的不斷擴(kuò)大和集約化程度的不斷提高，新城疫、禽流感、 雞傳染性支氣管炎等雞病毒性疾病所帶來的危害越來越嚴(yán)重，給養(yǎng)雞業(yè)造成重大的損失。 干擾素系統(tǒng)是機(jī)體對抗病毒感染的重要防御系統(tǒng)，當(dāng)干擾素系統(tǒng)被激活后，血清干擾素可 以在幾分鐘之內(nèi)擴(kuò)散到身體各器官，而細(xì)胞接觸干擾素只需幾分鐘就可產(chǎn)生抗病毒狀態(tài)， 而且，動物可以在一到三周內(nèi)對其他病毒的重復(fù)感染有抵抗作用。根據(jù)干擾素的氨基酸序 列、抗原性和細(xì)胞來源的不同可將其分為2個型1型干擾素的主要成員為α干擾素和β 干擾素，II型干擾素為Y干擾素.而其中α干擾素(IFN-α)以其突出的抗病毒作用而 備受人們重視。由誘生劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的天然雞IFN-α，因來源少、成本高、純化工藝復(fù)雜等諸多原因 而價格昂貴，極大的限制了臨床和科研的應(yīng)用，而利用基因工程技術(shù)選擇一個合適的系統(tǒng)， 使其得到高效表達(dá)，生產(chǎn)具有廉價、廣譜抗病毒活性、無毒害、無殘留等優(yōu)點的干擾素已經(jīng) 無疑是促使干擾素在獸醫(yī)臨床上推廣應(yīng)用的有效途徑。
三

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的之一在于對雞α干擾素基因序列進(jìn)行密碼子改造后，通過全基因 合成技術(shù)合成此序列并構(gòu)建高效表達(dá)載體，實現(xiàn)干擾素在大腸桿菌的高表達(dá)，獲得具有抗 病毒活性的雞α干擾素蛋白。本發(fā)明的另一目的是提供一種通過全基因合成技術(shù)合成的經(jīng)過改造的核酸，其特 征在于所述核酸包含編碼雞α干擾素的閱讀框，并且在該閱讀框內(nèi)全部采用大腸桿菌偏 愛的密碼子。優(yōu)選的，上述閱讀框的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。本發(fā)明的另一目的是提供一種含有上述核酸的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供一種含有上述重組載體的大腸桿菌。本發(fā)明還提供一種在原核表達(dá)系統(tǒng)中提高雞α干擾素表達(dá)量的方法，其包含如 下步驟(1)在不改變雞α干擾素氨基酸序列的基礎(chǔ)上設(shè)計其編碼核酸序列，使閱讀框內(nèi) 的每個密碼子都采用大腸桿菌偏愛的密碼子；(2)人工合成步驟(1)中設(shè)計的編碼核酸； (3)將步驟(2)合成的核酸插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體；(4)將步驟(3)構(gòu)建 的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)方案如下
3
(一)雞α干擾素基因的合成(1)登錄GeneBank，查找編碼雞α干擾素成熟蛋白的基因序列；(2)利用SignalP 3. OServer軟件預(yù)測此基因序列有無信號肽及其位置；(3)利用TargetP 1. IServer軟件檢測此信號肽的功能；(4)將雞α干擾素的編碼密碼子與大腸桿菌偏好密碼子進(jìn)行比對，根據(jù)密碼子的 兼并性，將雞α干擾素密碼子替換為大腸桿菌偏好的密碼子；(5)將替換后的序列5'、3'端分別加上EcoRI、XhoI酶切位點，送生物公司進(jìn)行 全基因合成；(二)雞α干擾素的原核表達(dá)(1)重組質(zhì)粒 pET32a-ChIFN_ α 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)；(2)陽性重組菌誘導(dǎo)表達(dá)，最佳誘導(dǎo)時間的確定及表達(dá)蛋白可溶性鑒定；(3)重組陽性菌穩(wěn)定性檢測；(三)重組雞α干擾素的提取(1)菌體破碎；(2)包涵體洗滌；(3)包涵體變性；(4)目的蛋白透析復(fù)性及蛋白濃度測定；(四)重組雞α干擾素抗病毒活性測定利用微量病變抑制法測定干擾素活性(1)制備雞胚成纖維細(xì)胞；(2)接種96孔細(xì)胞板；(3)濾泡性口炎病毒(VSV)對雞胚成纖維細(xì)胞半數(shù)致死量的測定；(4)干擾素抗VSV活性測定，將抑制50%細(xì)胞病變的干擾素的最高稀釋度定為1 個干擾素單位。
四


圖1是重組雞α干擾素蛋白表達(dá)SDS-PAGE電泳圖泳道1 誘導(dǎo)表達(dá)前；泳道2-6 誘導(dǎo)表達(dá)1，2，3，4，5小時；泳道7 蛋白質(zhì)分子量 標(biāo)準(zhǔn)(Marker)。重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后在分子量32kD處有增加的蛋白表達(dá)條帶，與預(yù)期的蛋 白分子量一致(干擾素分子量17. 8kD，加上載體本身的融合標(biāo)簽14. 3kD)，且在5小時時表 達(dá)量最高，所以選用的最佳誘導(dǎo)時間為5小時。圖2是重組雞α干擾素蛋白可溶性鑒定圖泳道1 菌體破碎后上清；泳道2 菌體破碎后沉淀；泳道3 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) (Marker)。電泳結(jié)果顯示目的蛋白為包涵體形式表達(dá)。圖3是目的蛋白純化效果SDS-PAGE電泳圖泳道1 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道2 純化后的目的蛋白。五
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述。實施例1雞α干擾素基因的合成登錄GeneBank，查找編碼雞α干擾素成熟蛋白的基因序列(序列號為 EU937528)，利用SignalP 3. OServer軟件預(yù)測此基因可能含有一段信號肽序列，為其氨基 酸序列的前30個氨基酸，利用TargetP 1. IServer軟件檢測此序列功能，發(fā)現(xiàn)其為幫助蛋 白分泌的信號肽而非蛋白結(jié)構(gòu)所必需，由于雞α干擾素為真核生物干擾素，但后續(xù)研究需 要在原核生物中進(jìn)行表達(dá)，真核生物的信號肽在原核生物細(xì)胞環(huán)境中由于缺少相應(yīng)的受體 而不能發(fā)揮作用，所以我們?nèi)サ粜盘栯男蛄校Ｏ戮幋a成熟鴨雞α干擾素的基因序列，其 核苷酸長度為489bp ；將雞α干擾素的編碼密碼子與大腸桿菌偏好密碼子進(jìn)行比對，根據(jù) 密碼子的兼并性，在不改變氨基酸組成和排列順序的基礎(chǔ)上，對已知的編碼雞α干擾素的 基因序列進(jìn)行改造，替換為大腸桿菌喜好的密碼子，旨在提高基因在大腸桿菌的表達(dá)水平；然后將替換后的序列5'、3'端分別加上EcoRI、XhoI酶切位點，送上海英 駿生物公司進(jìn)行全基因合成，并連入原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a中，得到重組原核表達(dá)質(zhì)粒 pET32a-ChIFN_α ；實施例2雞α干擾素蛋白的原核表達(dá)1將測序正確的重組質(zhì)粒pET32a-ChIFN_ α轉(zhuǎn)入BL21 (DE3)，挑取單菌落進(jìn)行雙酶 切鑒定；2陽性重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)挑取含有重組陽性質(zhì)粒的單菌落，接種到含有濃度為lOOmg/mL氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。按的比例將過夜培養(yǎng)的菌液接種于Amp+/LB液體 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3h至菌液光密度值達(dá)0. 4-0. 6，立即加入IPTG至工作濃度達(dá)ImM，繼續(xù)培養(yǎng) 5h，每Ih取Iml菌液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以確定最佳誘導(dǎo)時間(見附圖1)；3大腸桿菌表達(dá)的雞α干擾素的可溶性鑒定取經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液，40C，12000rpm,離心IOmin后收集菌體，棄上清，沉淀經(jīng)PBS 洗滌三次后超聲波破碎，超聲條件為功率400w，工作5秒，間隔10秒反復(fù)80次。離心，分別 取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以鑒定目的蛋白的可溶性(見附圖2)；4重組陽性菌穩(wěn)定性檢測挑取含有重組陽性質(zhì)粒的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)，每12小 時以轉(zhuǎn)接一次，傳代過程中均不添加氨芐青霉素，連續(xù)傳代25次，然后取每一代培養(yǎng)的 菌液進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳觀察表達(dá)情況；實施例3重組雞α干擾素的提取1菌體破碎離心收集誘導(dǎo)后的菌體，PBS洗滌三次，超聲破碎細(xì)胞，涂片鏡檢，觀察破碎效果， 棄上清，得到粗制的包涵體；2包涵體的洗滌用含2Μ脲的包涵體洗滌液充分洗滌包涵體，40C，12000rpm,離心15min，棄上清；3包涵體的變性用含8M脲的包涵體溶解液重懸沉淀，并30°C水浴使包涵體充分溶解變性，離心取上清，即得變性蛋白液；4目的蛋白透析復(fù)性將變性蛋白液加入到透析袋中，分別放入含4M、2M、1M、0. 75M、0M脲的PBS溶液中 進(jìn)行透析，每個濃度4°C攪拌透析4h，所得蛋白液離心，上清用直徑0. 22 μ m濾膜過濾除菌 及雜質(zhì)，即得到本發(fā)明重組雞α干擾素基因的表達(dá)蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢驗純化結(jié)果 (見附圖3)，用Broadford法測定蛋白濃度；實施例4重組雞α干擾素抗病毒活性測定采用微量細(xì)胞病變抑制法取孵化9-11日齡的SPF雞胚，連續(xù)消化法制備雞胚成纖維細(xì)胞，上96孔板，待長 成單層后棄去生長液，加入10倍倍比稀釋的重組雞α干擾素，每個稀釋度做8個重復(fù)，培 養(yǎng)24小時后棄上清，用10TCID50的水皰性口炎病毒(VSV)進(jìn)行攻毒，同時設(shè)立陰性對照 (只加10倍稀釋的干擾素，不加病毒)，陽性對照(只加病毒，不加干擾素)，空白對照(不 加干擾素，不加病毒)，倒置顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞病變，待陽性對照孔出現(xiàn)75%病變時判 定結(jié)果。實驗結(jié)果表明(1)陰性對照孔中的細(xì)胞未產(chǎn)生任何病變，說明本發(fā)明得到的干 擾素本身對細(xì)胞沒有毒害作用；(2)經(jīng)1000倍稀釋的干擾素能100%抑制細(xì)胞病變，而 10000倍稀釋的干擾素有6個孔出現(xiàn)細(xì)胞病變，由上述結(jié)果得出雞α干擾素抗VSV活性為 5. 6X104U/mL,比活性為 1. 06X 105U/mg。
權(quán)利要求
一種通過全基因合成技術(shù)合成的經(jīng)過改造的核酸，其特征在于所述核酸包含編碼雞α干擾素的閱讀框，并且在該閱讀框內(nèi)全部采用大腸桿菌偏愛的密碼子。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸，其特征在于所述閱讀框的堿基序列如SEQIDNO. 1所示。
3.一種含有如權(quán)利要求1或2所述核酸的重組載體。
4.一種含有如權(quán)利要求3所述重組載體的大腸桿菌。
5.一種在原核表達(dá)系統(tǒng)中提高雞α干擾素表達(dá)量的方法，其包含如下步驟(1)在不 改變雞α干擾素氨基酸序列的基礎(chǔ)上設(shè)計其編碼核酸序列，使閱讀框內(nèi)的每個密碼子都 采用大腸桿菌偏愛的密碼子；(2)人工合成步驟⑴中設(shè)計的編碼核酸；(3)將步驟⑵合 成的核酸插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體；(4)將步驟(3)構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn) 化適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用全基因合成技術(shù)獲得雞α干擾素基因及進(jìn)行干擾素蛋白的原核表達(dá)，屬于生物制藥領(lǐng)域。包括對雞α干擾素基因序列進(jìn)行密碼子的改造并全基因合成此序列，含雞α干擾素基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建，用所述含雞α干擾素基因的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌及誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白提取及變性復(fù)性，及抗病毒活性的研究。試驗所得干擾素能抵抗水皰性口炎病毒的攻擊，比活性達(dá)到1.06×105U/mg。該方法生產(chǎn)干擾素工藝簡單，表達(dá)量高，生物活性高。
文檔編號C07K14/56GK101928711SQ20101012500
公開日2010年12月29日 申請日期2010年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月16日
發(fā)明者姚火春, 張煒, 潘子豪, 胡偉娟 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)