專利名稱：多葉老芒麥高分子量谷蛋白亞基基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及多葉老芒麥高分子量谷蛋白亞 基基因，以及基于此基因通過生物技術(shù)方法改良小麥品質(zhì)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥胚乳儲藏蛋白可分為醇溶蛋白(gliadins)和谷蛋白(glutenins)，二者使小 麥面團(tuán)具有延展性和彈性，因而能加工成各種各樣的食品，其中決定面團(tuán)彈性的谷蛋白又 可分為高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亞基(LMW-GS) (Payne et al.， 1985 ；Gupta and Shepherd, 1990) 0盡管高分子量谷蛋白亞基只占小麥種子總蛋白的很 小一部分(約12% ) (Halford et al.，1992)，但其對面包烘烤品質(zhì)的貢獻(xiàn)率卻達(dá)到70% (Payne, 1987)。在普通六倍體小麥中，高分子量谷蛋白亞基有3個位點(diǎn)編碼，即Glu_lA、 Glu-IB和Glu-ID，三者分別位于1A、1B和ID染色體的長臂上，且每一位點(diǎn)由緊密連鎖的編 碼χ-型亞基(分子量較大)和編碼y-型亞基的基因(分子量較小)組成(Payne，1987 ； Shewry et al.，1992)。通常，由于基因沉默等原因，在一個小麥品種中通常有3 5個亞 基基因表達(dá)(Payne，1987)。所有的高分子量谷蛋白亞基都有相似的結(jié)構(gòu)信號肽(在成熟 的谷蛋白亞基中被切除)、保守的非重復(fù)N-、C-端區(qū)和中間重復(fù)區(qū)(Shewry et al. 1992)。 一般情況下，位于N-端和C-端的半胱氨酸的數(shù)量和位置非常保守，高分子量谷蛋白的變異 主要由中間重復(fù)區(qū)中重復(fù)單元的數(shù)量變化決定，含有優(yōu)質(zhì)高分子量谷蛋白亞基的小麥籽粒 面粉具有較高的SDS(十二烷基磺酸鈉)沉淀值和谷蛋白膨脹指數(shù)(SIG) (McDermott and Redman，1977 ；Wang and Kovacs，2002)。大量研究表明，高分子量谷蛋白亞基的組成和數(shù)目對小麥烘烤品質(zhì)影響很大。一 般認(rèn)為具有Dx5+Dyl0亞基組合的品種具有較好的烘烤品質(zhì)，而具有Dx2+Dyl2亞基組合的 品種具有較差的烘烤品質(zhì)。我國大多數(shù)小麥品種具有Dx2+Dyl2亞基組合，而具有Dx5+Dyl0 等優(yōu)質(zhì)亞基組合的品種則很少。除了充分利用現(xiàn)有的優(yōu)質(zhì)高分子量谷蛋白基因基因資源 外，鑒定新的優(yōu)質(zhì)谷蛋白亞基及其基因，用來培育含有優(yōu)質(zhì)高分子量谷蛋白亞基的小麥品 種，將是改良我國小麥烘烤品質(zhì)的重要途徑。老芒麥(Elymus Sibiricus L. ) (StStHH)為小麥近緣種，具有抗旱、耐鹽堿等特 性，其St和H染色體組可分別編碼谷蛋白和大麥醇溶蛋白，是提高小麥產(chǎn)量和改良小麥品 質(zhì)的重要種質(zhì)資源。目前，還未見從老芒麥克隆出優(yōu)質(zhì)高分量谷蛋白亞基的報道，因此，從 老芒麥中克隆鑒定優(yōu)質(zhì)高分子量谷蛋白亞基，通過遠(yuǎn)緣雜交、基因工程等方法將其轉(zhuǎn)到普 通小麥中，對小麥品質(zhì)的改良具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種培育優(yōu)質(zhì)小麥、改善小麥品質(zhì)的多葉老芒 麥高分子量谷蛋白亞基基因。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供基于該基因在改良小麥品質(zhì)方面的應(yīng)
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為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種多葉老芒麥高分子量谷蛋白亞基基因，其特 征在于該基因為Sty8. 1編碼基因，來源于多葉老芒麥，它具有序列表中SEQ ID NO. 1第1 位到1824位所示的核苷酸序列。所述基因具有序列表中SEQ ID NO. 1第1位到1824位中因一個或多個堿基的缺 失、插入或替換而形成的具有功能活性的等位基因。所述基因具有序列表中SEQ ID NO. 2第1位到606位所示的氨基酸殘基序列的蛋 白質(zhì)。所述基因具有序列表中SEQ ID NO. 2第1位到606位所示的氨基酸殘基序列經(jīng)過 一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO. 2氨基酸殘基序列相同活 性的由SEQ ID N0. 2衍生的蛋白質(zhì)；所述由SEQ IDN0. 2衍生的蛋白質(zhì)的序列與所述等位基 因的序列相對應(yīng)。如上所述的多葉老芒麥高分子量谷蛋白亞基基因在培育改良小麥方面的應(yīng)用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明通過分別測定多葉老芒麥，普通小麥品種寧春4號(lAxl，lBxl7+lByl8， lDx5+lDylO)(優(yōu)質(zhì)小麥)的谷蛋白膨脹指數(shù)(SIG)后發(fā)現(xiàn)多葉老芒麥谷蛋白膨脹指數(shù) (SIG)為5. 35，而寧春4號谷蛋白膨脹指數(shù)(SIG)為4. 23，從而表明多葉老芒麥極有可能含 有優(yōu)質(zhì)亞基。而本發(fā)明通過SDS-PAGE電泳，結(jié)合PCR技術(shù)，在多葉老芒麥中分離到一個新的 高分子量谷蛋白Sty8. 1亞基及其編碼基因Sty8. 1。用Anth印rot 6. 0G0R方法對Sty8. 1 和IDylO蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測比較(如圖3所示)，結(jié)果顯示Sty8. 1的β轉(zhuǎn)角含量 為34%，而DylO的β轉(zhuǎn)角含量為28%，說明StyS.l為優(yōu)質(zhì)亞基，具有比優(yōu)質(zhì)高分子量谷 蛋白亞基IDylO更優(yōu)良的二級結(jié)構(gòu)，因此，可在小麥品種改良中發(fā)揮重要作用。其中β轉(zhuǎn)角是決定高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)彈性區(qū)域的結(jié)構(gòu)單元，并賦 予其蛋白顯著抗變形的能力，β轉(zhuǎn)角含量高的HMW-GS，通常為優(yōu)質(zhì)亞基(Tatham，et al., 1985 ；Flavell,et al.，1989)。2、通過對本發(fā)明中的多葉老芒麥高分子量谷蛋白亞基進(jìn)行SDS-PAGE(十二烷基 磺酸鈉_聚丙烯酰胺凝膠電泳)電泳(如圖Ia所示)，可以看到多葉老芒麥具有兩條高分 子量蛋白質(zhì)條帶，因此，表明在多葉老芒麥中有兩個高分子量谷蛋白亞基基因表達(dá)。3、本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)特征根據(jù)蛋白質(zhì)N-端和C-端保守序列及已發(fā)表的基因序列設(shè)計PCR引物，其中引物 P1+P2用于擴(kuò)增Sty8. 1基因的編碼區(qū)(圖2)，引物P3+P4用于擴(kuò)增編碼去除信號肽的成熟 蛋白質(zhì)的核苷酸序列，用于原核表達(dá)鑒定克隆基因的功能活性。用引物P1+P2，多葉老芒麥基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到1300bp和ISOObp的 兩條帶。測序后獲得Sty8. 1基因1824bp如序列表SEQ ID NO. 1所示的編碼區(qū)全序列，以 及在第1029-1031位有TAG終止突變的1326bp序列。由SEQ ID NO. 1序列推導(dǎo)出的氨基 酸序列如SEQ ID N0. 2所示。該氨基酸序列顯示，Sty8. 1亞基與其它y-型高分子量谷蛋 白亞基結(jié)構(gòu)相似，N-末端是21個信號肽序列，其后與其它高分子量谷蛋白亞基一樣，有三 個明顯的結(jié)構(gòu)區(qū)域99個氨基酸殘基的非重復(fù)N-端區(qū)、444個氨基酸殘基的中央重復(fù)區(qū)和 42個氨基酸殘基的非重復(fù)C-端區(qū)。Sty8. 1亞基含有有6個半胱氨酸殘基，其中N-端5
4個，C-端1個。重復(fù)區(qū)主要由六肽(主要為PGQGQQ)和九肽(主要為GYYPTSPQQ)組成，無
χ-型亞基的三肽重復(fù)。4、由于本發(fā)明高分子量谷蛋白亞基Sty8. 1的基因具有的優(yōu)良二級結(jié)構(gòu)，因此，利 用此基因，通過遠(yuǎn)緣雜交、基因工程等技術(shù)，可培育優(yōu)質(zhì)小麥，從而改善小麥品質(zhì)。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1為本發(fā)明多葉老芒麥高分子量谷蛋白亞基SDS-PAGE分析及Sty8. 1基因在大 腸桿菌E. coli中的表達(dá)；其中a為多葉老芒麥高分子量谷蛋白亞基SDS-PAGE分析(圖中 1-寧春4號，2-中國春，3-、4_多葉老芒麥)，b為Sty8. 1基因在大腸桿菌E. coli中的表達(dá) (圖中1-寧春4號，2-中國春，3-多葉老芒麥，4-IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h后菌體總蛋白，5-IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)前菌體總蛋白)。圖2為本發(fā)明多葉老芒麥高分量谷蛋白亞基基因編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增；其中I-Ikb DNA ladder marker (上海生工產(chǎn)品)，2-多葉老芒麥高分量谷蛋白亞基基因編碼區(qū)的PCR 擴(kuò)增。圖3為本發(fā)明Sty8. 1亞基和IDylO亞基蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析(G0R法)；其中 a. Sty8. 1亞基蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析，b. IDylO亞基蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析。
具體實施例方式實施例1多葉老芒麥高分子量谷蛋白亞基基因，該基因為Sty8. 1編碼基因，它具 有序列表中SEQ ID NO. 1第1位到1824位所示的核苷酸序列。一、多葉老芒麥高分子量谷蛋白亞基Sty8. 1基因的克隆。1、引物設(shè)計根據(jù)蛋白質(zhì)N-端和C-端保守序列及已發(fā)表的基因序列設(shè)計PCR引物，具體如下P15 ‘ -ATGGCTAAGCGG(C/T)T(A/G)GTCCTCTTG-3‘P25 ‘ -CTATCACTGGCT(A/G)GCCGACAATGCG-3‘2、CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)法提取基因組DNA (1)取50mg新鮮多葉老芒麥葉片，用液氮和石英砂研磨至粉末狀。(2)將粉末放入離心管中，加 500 μ 1 2 X CTAB 提取液(2% CTAB 1. 4mol/LNaCl ； 0. lmol/L Tris-HCl ；0. lmol/L EDTA, pH = 8. 0 ；)禾口 1 μ 1 β _ 巰基乙醇，混勻。(3)將離心管在65°C水浴中加熱2h，其間每隔IOmin搖1次。(4)將離心管冷卻至室溫，加入500 μ 1氯仿異戊醇(24 1體積比)，上下顛倒 混勻，直至上清呈現(xiàn)乳狀。(5)將離心管以IOOOOrpm的速率離心lOmin，取上層水相于另一干凈離心管中，加 入與水相等體積的氯仿異戊醇(24 1體積比)，上下顛倒混勻，直至上清呈乳狀。(6)將裝有水相的離心管以IOOOOrpm的速率離心lOmin，吸取上層水相，加入與該 水相等體積的異丙醇，上下顛倒7 8次后，在_20°C放置1 2h ；然后再以IOOOOrpm的速 率離心3min，棄上清液，用質(zhì)量濃度為70%的酒精洗沉淀2次，室溫風(fēng)干。(7)將DNA溶于30 μ 1 TE緩沖液中。
3、Sty8. 1編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體系由 12. 5μ 1 2XLA Buffer ΙΙ、4μ1 dNTPU μ 1 PUl μ 1 Ρ2、 0. 2 μ ILATaq酶(Takara產(chǎn)品)、1 μ 1模板DNA組成，并用ddH20(重蒸水)加至終體積為 25 μ 1。
其中dNTP由dATP (三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸)、dTTP (脫氧胸苷三磷酸)、dGTP (脫 磷酸三鈉)和dCTP (脫氧胞苷三磷酸)組成；dATP、dTTP、dGTP和dCTP均為2. 5mM。 PCR反應(yīng)體系按下列程序進(jìn)行
氧鳥苷
95 "C4 min94 0C1 min ^58°C50s72 °C2 min 一72 °C10 min
33個循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后，用質(zhì)量濃度為0. 7%的瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，得到如圖2所示的 1300bp 和 1800bp 兩條帶。4、PCR產(chǎn)物的回收用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工產(chǎn)品)回收。5、目的DNA片段的克隆(1)連接體系連接體系總量為5 μ 1，由0. 5 μ 1 pMD19_T載體(Takara產(chǎn)品)、2 μ 1目的DNA片 段和2. 5 μ 1連接緩沖液I組成。其中連接緩沖液I來源于PMD19-T載體試劑盒。(2)將5 μ 1連接體系在4°C下連接過夜。(3)將5μ 1連接體系全部加入至50μ 1大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后，冰 浴 30min。(4)將步驟(3)所得的混合體系在42°C水浴中熱激90s后，立刻置于冰浴中2min。(5)在步驟(4)所得的混合體系中加入400 μ 1 LB培養(yǎng)基，于37°C下以130rpm的 速率振蕩lh，得到活化后的DH5a菌液。(6)取100 μ 1活化后的DH5 α菌液，在含有氨芐青霉素(Amp)的LB (100 μ g/ml) 平板培養(yǎng)基上涂板，于37°C下培養(yǎng)12 16h，即得目的DNA片段菌落。6、陽性克隆的鑒定與測序(1)用牙簽挑取LB平板培養(yǎng)基上長出的抗氨芐青霉素陽性菌落，于另一含有 Amp (100 μ g/ml)的LB平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)8 14h，得到單菌落。(2)用牙簽挑取畫線培養(yǎng)的單菌落，涂于一干凈PCR管的底部。(3) PCR 反應(yīng)體系PCR 反應(yīng)體系由 1. 6μ 1 dNTP, 2 μ 1 10XPCR Buffer、。· 4μ1 Ρ1、0·4μ1 Ρ2、 0. 1μ 1 Taq酶(Takara產(chǎn)品)組成，并用ddH20加至終體積為20 μ 1。其中dNTP 由 dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 組成；dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 均為 2. 5mM。PCR反應(yīng)體系按下列程序進(jìn)行
權(quán)利要求
一種多葉老芒麥高分子量谷蛋白亞基基因，其特征在于該基因為Sty8.1編碼基因，它具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到1824位所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的多葉老芒麥高分子量谷蛋白亞基基因，其特征在于所述基因 具有序列表中SEQ ID NO. 1第1位到1824位中因一個或多個堿基的缺失、插入或替換而形 成的具有功能活性的等位基因。
3.如權(quán)利要求1所述的多葉老芒麥高分子量谷蛋白亞基基因，其特征在于所述基因 具有序列表中SEQ ID NO. 2第1位到606位所示的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
4.如權(quán)利要求3所述的多葉老芒麥高分子量谷蛋白亞基基因，其特征在于所述基因 具有序列表中SEQ ID NO. 2第1位到606位所示的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸 殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO. 2氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO. 2 衍生的蛋白質(zhì)；所述由SEQ IDN0. 2衍生的蛋白質(zhì)的序列與所述等位基因的序列相對應(yīng)。
5.如權(quán)利要求1、2、3或4所述的多葉老芒麥高分子量谷蛋白亞基基因在培育改良小麥 方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多葉老芒麥高分子量谷蛋白亞基基因及其應(yīng)用。該基因為Sty8.1編碼基因，它具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或者具有序列表中SEQ ID NO.1中因一個或多個堿基的缺失、插入或替換而形成的具有功能活性的等位基因；或者具有序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；或者具有序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO.2氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所獲得的基因具有比優(yōu)質(zhì)基因1Dy10更優(yōu)良的二級結(jié)構(gòu)，可以在小麥品質(zhì)改良中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C07K14/415GK101974539SQ20101053412
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者劉永安, 王海慶, 竇全文, 陳志國 申請人:中國科學(xué)院西北高原生物研究所