一種優(yōu)化的豬干擾素-α8基因及其表達方法
【專利說明】-種優(yōu)化的豬干擾素_a 8基因及其表達方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明屬于生物技術(shù)高科技研宄領(lǐng)域，涉及一種優(yōu)化的豬干擾素-a8基因及其表達 方法。
[0002]
【背景技術(shù)】： 目前，豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)、豬瘟病毒（CSFV)、偽狂犬病毒（PRV)和口蹄 疫病毒（FMDV)等病毒性疫病已成為阻礙養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的重大問題。每年因病毒感 染而造成的經(jīng)濟損失無法估量。對這些常見的病毒病，雖然有些可用疫苗作常規(guī)免疫，但由 于免疫程序、疫苗本身和動物個體等原因，使其在實際應(yīng)用中的效果并不十分理想。干擾素 (interferon,INF)是由細胞產(chǎn)生的一類誘生性蛋白質(zhì)，具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤、抑制 細胞分裂活性和免疫調(diào)節(jié)活性，是目前應(yīng)用前景較為廣闊的生物制劑之一。干擾素可分為 a、0和Y三大類型。其中《干擾素的抗病毒作用最廣、效果最顯著。研宄表明，豬干 擾素-a對豬痘病毒（SPV)、豬瘟病毒（CSFV)，豬流感病毒（SIV)、水泡性口炎病毒（VSV)、 傳染性胃腸炎病毒（TGEV)、偽狂犬病毒（PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)和口蹄 疫病毒（FMDV)都具有較好的抗病毒作用。更重要的是，豬干擾素-a對口蹄疫病毒等病毒 的感染具有防治作用，有望開發(fā)成新型的抗病毒制劑。豬干擾素是一個多基因家族， 包括17個干擾素-a亞型，其中，豬干擾素-a1是研宄得最清楚的干擾素。研宄表明， 不同豬干擾素及其亞型在不同組織細胞中的表達譜不同。豬干擾素-a1、豬干擾素-a8 和豬干擾素-a12幾乎在所有的組織中均有表達，提示其在機體正常防御中的重要地位， 從而有望開發(fā)成最有效的抗病毒制劑（Sang,Y.，etal.，Differentialexpression andactivityoftheporcinetypeIinterferonfamily.PhysiolGenomics, 2010. 42(2):p. 248-58.)。目前尚未有成功利用基因工程技術(shù)手段生產(chǎn)出有活性的豬干擾 素_a8的報道，也無商品化豬干擾素-a8報道。由于豬干擾素-a8在組織中的廣泛分布 性和高抗病毒活性，其市場前景非常廣闊。
[0003] 大腸桿菌表達系統(tǒng)由于生長快、成本低、表達水平高而成為應(yīng)用最為廣泛的表達 系統(tǒng)，但外源蛋白由于不正確的折疊通常在大腸桿菌中以包涵體的形式表達。應(yīng)用大腸 桿菌表達系統(tǒng)制備豬干擾素-a也面臨同樣的問題。如陳濤等構(gòu)建的PGEX-IFN/大腸桿 菌表達系統(tǒng)（Chen,T. ,et al.,[Site-directed mutation of PoIFN-alpha and its expression in Escherichia coli].Sheng ffu Gong Cheng Xue Bao, 2002. 18(3): p. 339-42.)、曹瑞兵等構(gòu)建的pRLC-al/大腸桿菌表達系統(tǒng)（Cao, R.B., et al., [Gene modification and high prokaryotic expression of porcine interferon alpha-1]. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 2004. 20(2): p. 291-4.)、夏青等構(gòu)建的pQE3〇-a ac/大 腸桿菌表達系統(tǒng)所表達的豬干擾素-a均以包涵體形式存在（Xia，C.，etal.，Cloning and expression of interferon-alpha/gamma from a domestic porcine breed and its effect on classical swine fever virus. Vet Immunol Immunopathol, 2005. 104(1-2):p.81-9.)。豬干擾素-a在大腸桿菌中以包涵體形式表達，需要經(jīng)變性、復性、 純化等才能獲得具有抗病毒活性的干擾素_a，不僅費時費力，而且得率較低，成為規(guī)模化 生產(chǎn)中面臨的技術(shù)瓶頸。2003年青島寶依特生物技術(shù)研宄所公布了"豬a-干擾素的基因 合成、表達載體構(gòu)建及產(chǎn)物的制法"(專利申請?zhí)枮?00310109820. 6)，將豬a-干擾素的基 因克隆入pRLC表達載體，目標蛋白以包涵體形式表達。2007年中國科學院微生物研宄所公 布了"一種改良重組豬a干擾素蛋白及其編碼基因與應(yīng)用"(專利號為200710176867. 2)， 將豬a-干擾素的基因克隆入PBV220表達載體，目標蛋白以包涵體形式表達。黑龍江省農(nóng) 業(yè)科學院畜牧研宄中心和東北農(nóng)業(yè)大學公布了 "野豬a-干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及 產(chǎn)物的生產(chǎn)方法"（專利號為200710144345. 4)，將野豬a-干擾素的基因克隆入PWL表達 載體，目標蛋白以包涵體形式表達。2010年山東羅朗科技有限公司公布了"編碼豬a-干擾 素的DNA分子和重組大腸桿菌及其應(yīng)用"（專利號為201010295921. 7)，將豬a-干擾素的 基因克隆入PQE30表達載體，目標蛋白以包涵體形式表達。2011年上海交通大學和上海市 浦東新區(qū)動物疫病預防控制中心公布了"一種提高原核表達豬干擾素抗病毒活性的方法" (專利申請?zhí)枮?01110237881. 5)，將豬a和y-干擾素的基因克隆入pET30a表達載體，目 標蛋白以包涵體形式表達。上述專利均未能有效解決豬干擾素在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的可 溶性表達問題。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明的保護范圍只由權(quán)利要求書所規(guī)定，在任何程度上都不受這一節(jié)
【發(fā)明內(nèi)容】
的陳 述所限。
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種優(yōu)化的豬干擾素_a8基因，具有序列表中序列1的核 苷酸序列。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種表達上述豬干擾素_a8基因的方法，包括以下 步驟： (1) 將所述的豬干擾素-a8基因克隆入冷應(yīng)激表達載體pColdII，構(gòu)建表達載體 pColdII-PoIFN_a8,轉(zhuǎn)化到宿主細胞中； (2) 從所述宿主細胞中篩選含有所述pColdII-P〇IFN-a8載體的重組細胞； (3) 培養(yǎng)所述重組細胞，表達得到豬干擾素-a8蛋白； 所述方法中使用的宿主細胞為大腸桿菌BL21 (DE3); 所述方法中的表達條件為16°C，0. 02mM異丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導24h。
[0007] 所述方法還包括在非變性條件下，使用Ni2+_柱對所述豬干擾素-a8蛋白進行純 化的步驟。
[0008] 本發(fā)明首次在大腸桿菌系統(tǒng)中表達出有活性的豬干擾素-a8蛋白，具有以下優(yōu) 占. A. 本發(fā)明人工設(shè)計合成的豬干擾素-a8基因選用大腸桿菌偏愛密碼子，有利于密碼 子在大腸桿菌中的識別和表達，從而可達到高效表達的目的； B. 本發(fā)明的表達系統(tǒng)有利于重組蛋白的正確折疊，促進了豬干擾素_a8以可溶性形 式表達，該蛋白在非變性條件下經(jīng)一步純化即可獲得高純度產(chǎn)品，工序少，生產(chǎn)效率高； C. 本發(fā)明獲得的可溶性表達的豬干擾素-a8表達量高，能達到100mg/L，為后續(xù)規(guī)模 化生產(chǎn)打下了良好的基礎(chǔ)； D. 上述豬干擾素_a8蛋白實現(xiàn)良好的抗病毒活性，在PK-15細胞上的抗水泡性口炎病 毒（VSV)的活性可達1.0X109U/mg，具有良好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。
[0009]
【附圖說明】： 圖1是在誘導劑異丙基_B-D-硫代吡喃半乳糖苷不同濃度對所得菌體的上清和沉淀 進行SDS-PAGE實驗的結(jié)果； 圖2是在不同誘導時間對所得菌體的上清和沉淀進行SDS-PAGE實驗的結(jié)果； 圖3是經(jīng)純化后的豬干擾素-a8蛋白SDS-PAGE實驗的結(jié)果； 圖4是經(jīng)純化后的豬干擾素-a8蛋白WesternBlot(WB)實驗的結(jié)果。
[0010]
【具體實施方式】： 下面結(jié)合具體實施例詳細闡述本發(fā)明，但并不將本發(fā)明限制在所述的【具體實施方式】的 范圍中。如無特別說明，本發(fā)明各個實施例所用方法均為相關(guān)商品化試劑的說明書所列方 法、實驗材料均為常規(guī)實驗材料。
[0011] 實施例1豬干擾素-a8基因的優(yōu)化設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上poIFN-a8的氨基酸序列（登錄號：ABI26100. 1，氨基酸序列如序列表 中序列2所示）和豬干擾素-(18天然基因序列（登錄號：0〇872661.1，0嫩序列如序列表中 序列3所示)，本發(fā)明對天然基因序列的密碼子進行了優(yōu)化、設(shè)計出編碼poIFN-a8成熟蛋 白的基因。
[0012] 密碼子沒有優(yōu)化前，豬干擾素-a8天然基因在大腸桿菌中密碼子適應(yīng)指數(shù) (CAI)為0. 60,通過密碼子優(yōu)化后，使得本發(fā)明的豬干擾素-a8基因在大腸桿菌中CAI 指數(shù)為0.80,CAI指數(shù)升高表明經(jīng)過了密碼子優(yōu)化后得到的基因序列可以提高豬干擾 素-a8基因在大腸桿菌中的表達水平。
[0013] 密碼子沒有優(yōu)化前，豬干擾素-a8天然基因在大腸桿菌中的低利用率密碼子出 現(xiàn)百分比為13%，而本發(fā)明的豬干擾素-a8基因在大腸桿菌中低利用率密碼子的出現(xiàn)百分 比為3%，顯著提高了翻譯的效率。
[0014] 密碼子沒有優(yōu)化前，豬干擾素-a8天然基因的GC堿基平均含量為60. 37%，而本 發(fā)明的豬干擾素-a8基因GC堿基平均含量為57. 19%。GC堿基過高時容易發(fā)生錯誤配對， 影響基因的表達，將GC含量優(yōu)化后更利于目的基因的表達，提高其表達水平。
[0015] 該p〇IFN-a成熟蛋白編碼基因全長498bp，在其5'端添加起始密碼子ATG、在 3'端添加了終止密碼子TGA，并分別在兩端設(shè)計了Ndel和Hindlll酶切位點，得到了本發(fā) 明的豬干擾素-a8基因，其完整的核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
[0016] 實施例2豬干擾素-a8基因表達載體構(gòu)建 將實施例1獲