iNOS抑制劑用于增加培養(yǎng)物中病毒產(chǎn)率的用圖
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明總體涉及用于在培養(yǎng)物中產(chǎn)生病毒和重組病毒體（Virion)的方法。具體 而言，本發(fā)明涉及iNOS抑制劑如金精三羧酸、地塞米松和丙戊酸用于增加多種病毒在培養(yǎng) 物中的產(chǎn)率的用途，所述病毒包括重組皰疹病毒，其繼而能夠用作輔助病毒用于產(chǎn)生重組 腺伴隨病毒病毒體。
【背景技術(shù)】
[0002] 皰疹病毒在自然界中高度傳播并且發(fā)現(xiàn)于大多數(shù)動物物種中。已經(jīng)表征了至少 100種皰疹病毒，包括來自人的數(shù)種，如單純皰疹病毒1型（HSV-1)和單純皰疹病毒2型 (HSV-2)、水痘帶狀皰疹病毒（VZV)、EB病毒（EBV)、巨細胞病毒（CMV)和其他人皰疹病毒如 HHV6和HHV7。這些病毒是造成多種人類疾病的原因，如皮膚感染、生殖器皰疹、病毒性腦炎 等。
[0003] HSV-1感染通過誘導胞內(nèi)信號傳導途徑而激活宿主防御和先天免疫系統(tǒng)，所 述胞內(nèi)信號傳導途徑導致具有促炎活性和殺微生物活性的蛋白質(zhì)的表達，包括細胞 因子和干擾素（INF) (Sainz and Halford, J. Virol. (2002)^:11541 - 11550 ;Haller 等，Virology(2006)344:119 - 130 ;Paludan 等，Nat. Rev. Immunol. (2011) 11:143-154)〇 INF信號傳導是最重要的用于病毒清除的細胞防御機制之一（Brandner&Mueller, Hoppe-S eylerr s Zeitschriftfur physiologische Chemie (1973) 354:1176 ：De Vries 等，Gene Ther. (2008)15:545-552)〇
[0004] 研究者們已經(jīng)報道了一氧化氮（NO)針對數(shù)種病毒的抗病毒活性，這些病毒包 括牛痘病毒、水泡性口炎病毒和日本腦炎病毒等（Bi等，J.Virol. (1995)迎:6466-6472; Harris 等，J.Virol. (1995)臉：910-915 ;Lin 等，J.Virol. (1997)11:5227-5235 ; Pertile等，Avian Dis.(1996)迎:342-348)。NO是一種自由基氣態(tài)分子并且是宿主防 御的中介體（mediator) (Croen K. D.，J. Clin. Invest. (1993)91：2446-2452 ；Karupiah 等，Science(1993)逆1:1445-1448 ;Rolph 等，Virol. (1996)217:470-477 ;Amaro 等，J. Med. Virol. (1997)^i:326-331;Lane 等，J. Virol. (1997)11:2202-2210)。已知 HSV-1 既誘 導又規(guī)避宿主抗病毒應答（Mossman等，J. Virol. (2001)邊:750-758)。HSV感染能夠誘導 誘導型一氧化氮合酶（iNOS)的表達，其是一種編碼產(chǎn)生大量N0的N0S的誘導型同種型的 基因。
[0005] 已經(jīng)將皰疹病毒及其重組蛋白用于制造多種疫苗。除腺病毒以外，已經(jīng)顯示皰 疹病毒為重組腺伴隨病毒病毒體的產(chǎn)生提供了完整的輔助病毒功能（Buller，R. M. L.，J. Virol. (1981)迎：241-247 ;Mishra 等，Virology (1990) 179:632-639)。已經(jīng)鑒定出 AAV 復 制和包裝所需的HSV-1基因的最小集合為早期基因UL5、UL8、UL52和UL29 (Weindler等，J. Virol. (1991)迎:2476-2483)。這些基因編碼HSV-1核心復制機構(gòu)的組分--解旋酶、引發(fā) 酶和引發(fā)酶輔助蛋白（隊5、隊8和隊52)和單鏈DNA結(jié)合蛋白（隊29)。
[0006] 重組AAV(rAAV)載體已經(jīng)成功地用于實現(xiàn)長期、高水平體內(nèi)轉(zhuǎn)導。盡管取得了上 述進展，用于基因治療的大量臨床級高滴度rAAV病毒體的生產(chǎn)依然是挑戰(zhàn)性的，因為共轉(zhuǎn) 染方案的可擴展性（scalability)有限。該過程需要三種組分的有效細胞遞送：（1)包括側(cè) 翼為AAV反向末端重復（ITR)的感興趣的基因的載體；（2)包括AAV rep和cap基因的載 體；和（3)使用輔助病毒如腺病毒或單純皰疹病毒或使用無病毒輔助質(zhì)粒提供的基因（參 見，Muzyczka, N.，Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1992)158:97-129) 〇 如此，在基于 rHSV 的rAAV生產(chǎn)方案中，rAAV的產(chǎn)率受到輔助rHSV載體最大滴度的限制。
[0007] 一種稱為d27. l_rc的復制缺陷型HSV-1載體表達AAV-2 rep和cap基因（Conway 等，Gene Ther. (1999^:986-993)，并且其已經(jīng)從原始的d27-l病毒經(jīng)工程改造（Rice 等，J. Virol. 1989vol. 63(8)pp. 3399-407)，其不產(chǎn)生 ICP27, 一種 HSV-1 復制所需的蛋白 質(zhì)。盡管這種載體是復制缺陷型的，但是它確實表達rAAV復制和包裝所需的HSV-1早期基 因（Conway 等，Gene Ther. (1999)泛：986-993) 〇
[0008] 通常而言，將一種攜帶rAAV模板的載體和其他表達AAV rep和cap區(qū)的載體共轉(zhuǎn) 染至293細胞中以產(chǎn)生rAAV病毒體。兩種HSV-1載體均為復制缺陷型的，并且因此只能在 ICP27 補充細胞系 V27 中增殖（Rice 等，J. Virol. 1989vol. 63 (8)pp. 3399-407)。在基于 HSV的AAV產(chǎn)生方案中，293細胞需要以較高的感染復數(shù)（M0I) 12來感染。這代表了某種限 制，因為d27-1-衍生載體在V27細胞中的產(chǎn)率通常在1X107蝕斑形成單位（PFU)/ml左右。
[0009] 為了進一步增加HSV-1滴度，已經(jīng)調(diào)查了數(shù)種方法和試劑（參見，例如， Wechuck 等，Biotechnol.Prog. (2000)16:493-496；0zuer 等，Biotechnol. Prog. (2002)叢：476-482 ;Erlandsson等，J. Endocrinol.，(2002) 175:165-176 ;0tsuki等，]?〇1. Ther. (2008)叢:1546-1555)。地塞米松和丙戊酸二者抑制了由數(shù)種干擾素（IFN)應答性 抗病毒基因代表的宿主防御機制，加強了病毒基因的轉(zhuǎn)錄水平，并因此改進了 HSV-1的病 毒增殖和產(chǎn)率（Erlandsson 等，J. Endocrinol. (2002) 175:165-176 ;0tsuki 等，Mol. Ther. (2008)16:1546-1555)〇
[0010] 盡管已有上述知識，需要更多抑制宿主防御從而改進培養(yǎng)物中病毒產(chǎn)生的方 法。如上所解釋的，研究者們報道了一氧化氮（N0)針對數(shù)種病毒如牛痘病毒、水泡 性口炎病毒和日本腦炎病毒等的抗病毒活性（Bi等，J. Virol. (1995)^:6466-6472 ; Harris 等，J.Virol. (1995)臉：910-915 ;Lin 等，J.Virol. (1997)11:5227-5235 ; Pertile等，Avian Dis.(1996)迎:342-348)。NO是一種自由基氣態(tài)分子并且是宿主防 御的中介體（mediator) (Croen K. D.，J. Clin. Invest. (1993)91：2446-2452 ；Karupiah 等，Science(1993)逆1:1445-1448 ;Rolph 等，Virol. (1996)217:470-477 ;Amaro 等，丄 Med. Virol. (1997)處：326-331 ;Lane 等，J. Virol. (1997)11:2202-2210)。如上所述，HSV 感染能夠誘導iNOS表達，其是一種編碼產(chǎn)生大量NO的NOS的誘導型同種型的基因。
[0011] iNOS抑制劑N-甲基-L-精氨酸（L-NMA)的存在對于全部三種這些病毒逆轉(zhuǎn)了對 病毒復制的抑制(KaruDiah等，Science (1993) 261:1445-1448)。關于iNOS抑制劑的綜述， 參見Southan等，Biochem. Pharmacol. (1996)^1:383-394。已經(jīng)顯不另一化合物金精三駿 酸（ATA)通過下調(diào)iNOS表達并因此減少N0產(chǎn)生來保護巨噬細胞免于由細菌脂多糖誘導的 細胞死亡（Chen 等，British Journal of Pharmacology(2002)vol.l37(7)pp. 1011-20)。 ATA是一種聚合物的異質(zhì)混合物，被認為具有數(shù)量增加的生物活性，如與多種酶包括DNA聚 合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶（RNA依賴性DNA聚合酶）、氨?；?tRNA-合成酶、核糖核苷酸還 原酶、核糖核酸酶、核酸酶的相互作用，蛋白質(zhì)合成抑制，對凋亡的防止和阻斷少突膠質(zhì)細 胞中由氧化應激誘導的 DNA 斷裂（Tscherne and Pestka，Antimicrob.Agents Chemother. (1975)呈：479-487 ;Mikelens 等，Biochemical Pharmacology (1976) 25:821-827 ；Vollgraf 等，J. Neurochem. (1999)垃：2501-2509) 〇
[0012] 也已經(jīng)報道了金精三羧酸（ATA)防止IFN-介導的轉(zhuǎn)錄激活（Tsi等，Mol. Pharmacol. (2002) 101:90-101 ;Chen 等，British J. Pharmacol. (2002) 137:1011-1020)〇 已知ATA是Raf/MEK/MAPK途徑、IGF-1受體和蛋白激酶C信號轉(zhuǎn)導的激活劑（Beery等， Endocrinology(2001) 142:3098-3107 ；Chen 等，J. Biol. Chem. (2001)276:46722-46728)〇 細胞因子如干擾素的抗病毒抗微生物和抗增殖作用可能是因為它們誘導iNOS表達的能 力，iNOS是一種編碼一氧化氮合酶（N0S)的同種型的基因，一氧化氮合酶從L-精氨酸 的胍基氮產(chǎn)生大量的自由基氣體（radical gas)N0(Nathan，C.，F(xiàn)ASAB J. (1992)g:3051; Werner-Felmayer 等，J. Exp. Med. (1990)m 1599)。已經(jīng)顯示用 IFN-y 處理巨噬細胞嚴 重限制鼠痘病毒（ectromelia virus ;EV)、牛痘病毒（VV)和HSV-1的復制。
[0013] 一方面，還已知ATA是一種對抗數(shù)種病毒的抗病毒劑，所述病毒包括HIV、 皰疹病毒 HHV-7、SARS-CoV 等（Cushman 等，J. Med. Chem. (1991)24:329-3371991 ; Zhang 等,Antiviral Res. (1999)43:23-35 ；Yap 等,Computational Biol, and Chem. (2005) 29:212-219 ；De Clercq,Advents,Advances,and Adventures Med. Res.Rev. (2011)丑:118-160)。然而，ATA不阻斷腺病毒5型（Ad5)在HEK-293細胞中的復制 (He, Biochem. Biophys. Res. Comm. (2004)320:1199-1203)。另外，已經(jīng)報道了 ATA 出乎預料 地增加了對照腺病毒載體在293細胞中的滴度，同時對牛痘病毒具有抗病毒效果（Myskiw 等，J. Virol. (2007)^1:3027-3032)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明通過解決限制病毒生產(chǎn)的問題，如低rHSV產(chǎn)生，其妨礙產(chǎn)生足量rHSV用于 多種目的（包括用于疫苗生產(chǎn)以及用于rAAV病毒體以有效基因治療過程所必需的量生產(chǎn)） 的努力，由此克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷。使用本文描述的方法，能夠獲得更高滴度的多種病 毒，如比傳統(tǒng)方法高至少一個數(shù)量級。
[0015] 具體來說，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了金精三羧酸（ATA)抑制iNOS并增加HSV產(chǎn)生。 如本文實施例中所示，微摩爾濃度的ATA在胎牛血清（FBS)的存在下同時增加了 V27細胞 中HSV-l/d27-l載體的產(chǎn)率和Vero、V27和293細胞中的野生型（wt) HSV-1病毒。其他iNOS 抑制劑，包括地塞米松和丙戊酸，也增加了培養(yǎng)物中的HSV-1滴度。如通過SABiosciences Microarray所分析的，已經(jīng)顯示了在HSV+ATA樣品中HSV誘導的iNOS表達是減少的。類似 地，Affymetrix人類基因組陣列分析確認了 HSV上調(diào)的全部三種一氧化氮合酶基因（nNOS、 iNOS和eNOS)的表達在HSV+ATA樣品中是下調(diào)的。Affymetrix Gene Array也檢測到了炎 性IgE和IFN信號傳導中牽涉的基因和全身性免疫應答通過HSV-1上調(diào)并且在添加ATA之 后受到阻抑。另一方面，細胞周期G1/S中主要牽涉的基因、WNT發(fā)育中的信號轉(zhuǎn)導通過HSV 顯著下調(diào)并且在添加ATA之后受到上調(diào)。
[0016] 鑒于對用于rAAV病毒體生產(chǎn)以及用于預防、治療和診斷目的的更高HSV-1滴度的 需求，這些結(jié)果意義重大。
[0017]因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生病毒的方法，包括在包含金精三羧 酸的細胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)病毒。在某些實施方案中，所述病毒是皰疹病毒，如HSV-1。
[0018] 在另外的實施方案中，所述皰疹病毒是野生型HSV-1或重組HSV-1載體，如HSV-1 d27. 1載體。
[0019] 在進一步的實施方案中，將所述病毒培養(yǎng)在293、HeLa或Vero細胞中，如V27細胞 中。
[0020] 又在另外的實施方案中，本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)HSV-1 d27. 1載體的方法，包括：
[0021] (a)用HSV-1 d27. 1載體感染V27細胞；和
[0022] (b)將感染的V27細胞在包含金精三羧酸、丙戊酸或地塞米松的細胞培養(yǎng)物中培 養(yǎng)。
[0023] 在某些實施方案中，所述細胞培養(yǎng)物進一步包含血清，如胎牛血清。
[0024] 在進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)物，其包含金精三羧酸和293、HeLa 或Vero細胞，如V27細胞。
[0025] 鑒于本文公開的內(nèi)容，題述發(fā)明的這些和其他實施方案對于本領域技術(shù)人員而言 將會是容易想到的。
[0026] 附圖簡述
[0027] 圖1是顯示金精三羧酸（ATA)抑制d27-l感染的V27裂解物中iNOS表達的蛋白 質(zhì)印跡的圖示。
[0028] 圖2A-2C顯示ATA-HSV方案原理（圖2A)和對V27上清中d27-l HSV-1滴度的優(yōu) 化以確定哪些關于ATA添加的濃度和條件對HSV產(chǎn)率有影響。圖2B顯示病毒滴度，表示為 六孔板（圖2B)和T150燒瓶（圖2C)中在多種ATA濃度下的DNA酶抗性顆粒（DRP/ml)。
[0029] 圖3顯示ATA-HSV方案中血清存在的重要性。ATA-HSV方案中FBS存在的其他優(yōu) 化和重要性在表示為drp/ml和pfu/ml的d27-l HSV-1滴度上顯示。
[0030] 圖4A-4B顯示ATA對培養(yǎng)物中野生型HSV K0S和McIntyre株的效果。ATA增加了 兩種病毒類型在Vero細胞中的產(chǎn)率，然而，ATA似乎抑制了 293細胞中的HSV-1 K0S生長。 另一方面，wtHSV-1 McIntyre株在293細胞中ATA誘導之后達到了最高滴度。另外，ATA似 乎抑制了 HeLa細胞中兩種類型的HSV-1病毒。
[0031] 圖5A-5B顯示HSV儲液中ATA對rAAV病毒體生產(chǎn)的效果。當使用在感染過程中 添加了 20 y M ATA制備的HSV儲液時，rAAV滴度稍有升高。當在2小時的HSV共感染步驟 期間將10 y M ATA直接摻入293細胞培養(yǎng)基中時，還顯示ATA增加了 rAAV滴度。
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