二氨基嘌呤。
[0061]術語DNA "調控序列"泛指啟動子序列、多腺苷酸化信號、轉錄終止序列、上游調節(jié) 結構域、復制的起點、內部核糖體進入位點（"IRES")、增強子等，它們共同提供受體細胞中 編碼序列的復制、轉錄和翻譯。不是所有這些控制序列都需要始終存在，只要所選擇的編碼 序列能夠在合適的宿主細胞中被復制、轉錄和翻譯即可。
[0062] 術語"啟動子"在本文中按其普通含義使用，指包含DNA調節(jié)序列的核苷酸區(qū)域， 其中所述調節(jié)序列源自能夠結合RNA聚合酶并起始下游（3'方向）編碼序列轉錄的基因。 轉錄啟動子可以包括"誘導型啟動子"（其中可操作地連接于啟動子的多核苷酸序列的表達 由分析物、輔因子、調節(jié)蛋白等誘導）、"阻遏型啟動子"（其中可操作地連接于啟動子的多核 苷酸序列的表達由分析物、輔因子、調節(jié)蛋白等誘導）和"組成型啟動子"。
[0063]"可操作地連接"指元件的排布，其中如此描述的組分經配置以便執(zhí)行它們通常的 功能。因此，可操作地連接于編碼序列的調控序列能夠實現(xiàn)編碼序列的表達。調控序列不 需要與編碼序列鄰接，只要調控序列發(fā)揮引導編碼序列表達的功能即可。因此，例如，在啟 動子序列和編碼序列之間可以存在間插的非翻譯但轉錄的序列，而啟動子序列仍然可以被 認為是與編碼序列"可操作地連接"。
[0064]當涉及蛋白質或核苷酸序列時，"分離的"意指所指示的分子在基本上不存在其他 相同類型的生物學大分子的條件下存在。因此，例如，"編碼特定多肽的分離的核酸分子"指 基本上不含不編碼主題多肽的其他核酸分子的核酸分子；然而，該分子可以包括一些不有 害地影響組合物的基本特征的額外的堿基或部分。
[0065]在本申請通篇中，為了描述核苷酸序列在特定核酸分子中的相對位置，例如當特 定核苷酸序列被描述為位于相對于另一序列的"上游"、"下游"、"3-撇（3')"或"5-撇 (5') "，應理解為其是如本領域常規(guī)所指的DNA分子的"有義"或"編碼"鏈中序列的位置。 [0066] 術語"約"，尤其是涉及給定的量時，意指涵蓋正負百分之五的偏差。
[0067] 2?發(fā)明的實施方式
[0068] 在詳細描述本發(fā)明之前，應理解本發(fā)明不限于特定的配方或過程參數，因為這些 當然可以變化。還應理解本文使用的術語僅出于描述本發(fā)明的特定實施方案的目的，而不 旨在進行限制。
[0069] 盡管可以使用與本文描述的那些相似或等同的多種方法和材料來實施本發(fā)明，本 文描述了優(yōu)選的材料和方法。
[0070] 本發(fā)明的核心在于發(fā)現(xiàn)微摩爾濃度的金精三羧酸（ATA)增加HSV-1載體產率。這 項發(fā)現(xiàn)對于大規(guī)模HSV生產以及rHSV和rAAV載體的產生都很重要。除此之外令人驚訝 的是，如實施例中所示，rHSV-1儲液中ATA的存在不負面影響rAAV產率。這項結果是令人 驚訝的，因為已知毫摩爾量和更高濃度的ATA是一種抗病毒劑（Cushman等，J. Med. Chem. (1991)34:329-337 ;Zhang 等，Antiviral Res. (1999)43:23-35 ：Yap 等，Computational Biol, and Chem. (2005)29:212-219 ；De Clercq, Advents, Advances, and Adventures Med. Res. Rev. (2011)3i：118-160)〇
[0071] 如上文所闡釋的，研究者們已經報道了一氧化氮（NO)針對幾種病毒的 抗病毒活性，所述病毒如牛痘病毒、水泡性口炎病毒和日本腦炎病毒等（Bi等，J. Virol. (1995)盤：6466-6472;Harris 等，J. Virol. (1995)迎：910-915;Lin 等，1997; Pertile等，Avian Dis. (1996)迦:342-348)。N0是一種自由基氣態(tài)分子，是宿 主防御的中介體（Croen K. D.，J. Clin. Invest. (1993)91:2446-2452 ：Karupiah 等，Science(1993)逆1:1445-1448 ;Rolph 等，Virol. (1996)217:470-477 ;Amaro 等，J. Med. Virol. (1997)^i:326-331;Lane 等，J. Virol. (1997)11:2202-2210)。HSV 感染能夠誘 導誘導型一氧化氮合酶（iNOS)的表達，其是一種編碼產生大量NO的NOS的誘導型同種型 的基因。
[0072] 如本文所示，ATA阻抑HSV上調的iNOS并由此增加培養(yǎng)物中的HSV滴度。其他 iNOS抑制劑，包括地塞米松和丙戊酸，也具有相同的效果。然則在一個實施方案中，這樣的 iNOS抑制劑的使用增加培養(yǎng)物中重組皰疹病毒的滴度，允許產生與不存在該特定抑制劑條 件下產生的相比顯著更多的病毒。通過所述方法產生的病毒可用于多種情形中，包括用于 預防、治療和診斷目的，以及用于以足以在用于基因遞送和基因治療的重組病毒體制備中 使用的量產生重組構建體。
[0073]金精三羧酸（ATA)，即5- ((3-羧基-4-羥基苯基）（3-羧基-4-氧代-2, 5-環(huán)己二 稀亞基）甲基）-2_ 羥基苯甲酸（5-((3-carboxy-4-hydroxyphenyl) (3-carboxy-4_oxo -2, 5-cyclohexadien_l-ylidene)methyl) -2-hydroxybenzoic acid)，是當用甲酸、硫酸和 亞硝酸鈉處理水楊酸時形成的非硫酸化荷負電芳族聚合物的異質混合物（參見Cushman, 等，（1991) J. Med. Chem. 21:329-337 ;Cushman,等，J. Med. Chem.遲:337-342)。金精三羧酸 具有下式：
[0074]
[0075] ATA的異質混合物據描述抑制蛋白質核酸相互作用（Gonzalez等，Biochim. Biophys. Acta, (1979)562:534-545);與類固醇受體在核攝取和核結合水平相互 作用（MelIon, W. S.，Biochem. Pharmacol. (1984) 33.: 1047-1057 ；Moudgil 等，J. Steroid Biochem. (1985) 23:125_132);抑制 DNA 聚合酶（Nakane 等，已111\]\13;[0(3116111. (1988) 177:91-96);和作為 RNA 酶抑制劑發(fā)揮作用（Skidmore 等，Biochem. J. (1989)263:73-80)。
[0076] 用于向培養(yǎng)物中的病毒添加的ATA可以以酸性形式使用或者可以作為鹽提供，如 金精三羧酸三鈉鹽；鈣鹽；銨鹽等。
[0077] 在本發(fā)明方法中會有用的其他物質包括地塞米松（Dex)和丙戊酸（VA)。已經 顯示Dex在大鼠系膜細胞中在轉錄和轉錄后水平抑制iNOS表達（Kunz等，Biochem. J. (1994)304:337-340 ；Kunz 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1996)監(jiān)：255-259)。 已 經顯示Dex增強PC12細胞中的HSV-1 oriL DNA復制。丙戊酸鈉，即VA的鈉鹽，已 經顯示刺激HSV-1、人巨細胞病毒、HIF-1、人皰疹病毒-8、麻疹病毒和骨髓灰質炎病 毒 1 型的復制（Motamedifar 等，Iran. J. Med. Sci. (2006)31:28-32 ：Kuntz~Simon 等，J. Gen. Virol (1995)也：1409-1415 ;Moog 等，J. Gen. Virol (1996)互：1993-1999; Ylisastigui 等，AIDS(2004)1^:1101-1108 ;Shaw 等，AIDS(2000)il:899-902; Kabiri 等 Iran J.Med. Sci. (2001)選:55-61)。此外，已經顯示丙戊酸抑制 iNOS (Guo 等，Surgery (2007) 142:156-162)。與ATA -樣，VA或其鹽，如鈉、鈣、銨鹽等，可用于本方法 中。
[0078] 盡管本文例示了使用ATA、Dex和VA以較高滴度產生rHSV-1載體，這些iNOS 抑制劑可用于增加多種病毒在培養(yǎng)物中的滴度，例如但不限于如下科的病毒：腺病毒科 (Adenoviridae)、小核糖核酸病毒科（Picornaviridae)(例如，脊髓灰質炎病毒等）；杯狀 病毒科（Caliciviridae);披膜病毒科（Togaviridae)(例如，風疹病毒、登革熱病毒等）； 黃病毒科（Flaviviridae);冠狀病毒科（Coronaviridae);呼腸孤病毒科（Reoviridae); 雙核糖酸病毒科（Birnaviridae);彈狀病毒科（Rhabodoviridae)(例如，狂犬病病毒等）； 痕病毒科（Poxviridae);絲狀病毒（Filoviridae);副粘病毒科（Paramyxoviridae)(例 如，聰腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等）；正粘病毒科（Orthomyxoviridae)(例如， 流感病毒甲、乙和丙型，等）；布尼亞病毒科（Bunyaviridae);沙粒病毒科（Arenaviridae); 各種肝炎病毒，如甲肝病毒、乙肝病毒和丙肝病毒；乳頭狀瘤病毒和輪狀病毒；逆轉錄病 毒；等等。對于這些和其他病毒的描述，參見，例如Virology, 3rd Edition(W.K.Joklik ed. 1988) fundamental Virology, 2nd Edition (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds. 1991) 〇 這些病毒或源自它們的免疫原可用于疫苗和診斷劑的生產。另外，這些病毒中的一些，且具 體而言皰疹病毒可用于產生重組載體以供產生用于下文描述的基因遞送技術的重組病毒 體。
[0079] 如此，ATA、Dex和VA可用于增加作為皰疹病毒科成員的任何皰疹病毒的產率。這 包括馬皰疹病毒、牛皰疹病毒（BHV)和人單純皰疹病毒（HSV) 1型和2型如BHV-1、BHV-2、 HSV-1和HSV-2、水痘帶狀皰疹病毒（VZV)、EB病毒（EBV)、巨細胞病毒（CMV)、HHV6和HHV7 等。皰疹病毒可以源自所述許多毒株中的任一。例如，當使用本發(fā)明產生的病毒是HSV時， 所述病毒可源自，例如，HSV-1或HSV-2,并且可以來自多種HSV毒株中的任一，如HSV-1毒 株 K0S、HSV-1 毒株 McIntyre、HSV-1 毒株 Patton、HSV-2 毒株 333、HSV-2 毒株 G 等。另外， 產生的病毒可以是野生型病毒，或其衍生物，包括重組病毒和含有來自HSV-1和HSV-2的 DNA的類型間重組體（inter-type recombinant)。衍生物優(yōu)選與HSV-1或HSV-2基因組中 的任一或其部分具有至少70 %序列同源性，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90或95%。 衍生物可以具有通過核苷酸取代修飾的HSV-1或HSV-2基因組的序列，所述取代例如，1、2 或3至10、25、50或100個取代。HSV-1或HSV-2基因組可以可替代地或額外地通過一個或 多個插入和/或缺失和/或通過在任一末端或兩個末端的延伸來修飾。
[0080] 其他衍生物包括在基因中已經具有突變的毒株，特別是基因中導致病毒減毒的 突變。這些病毒的實例包括毒株1716 (MacLean等，J. Gen. Virol. (1991)12:632-639)、毒 株R3616和R4009(Chou and Roizman，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1992)型：3266-3270)和 R930(Chou等，J. Virol. (1994)迎:8304-8311)，其全部具有ICP34. 5中的突變，毒株dl20， 其具有ICP4中的缺失（DeLuca等，J.Virol. (1985)述:558-570)，毒株d27-l(Rice and Knipe, J. Virol. (1990)M: 1704-1715)其具有ICP27中的缺失，或毒株d92,其具有ICP27 和ICP4二者中的缺失（Samaniego等，J.Virol. (1995)盤:5705-5715)。描述多種HSV基 因時使用的術語可參見，例如，Coffin and Latchman(1996)，In:Genetic Manipulation of the Nervous System(DS Latchman Ed. )pp 99-114:Academic Press, London。
[0081] 正如很容易看出的，任何對于預期目的合適的rHSV均可用于本發(fā)明。在某些實施 方案中，本發(fā)明中使用的rHSV是復制缺陷型。對于rAAV病毒體的產生，用不能復制的rHSV 感染生產者細胞是優(yōu)選的，因為與牽涉腺病毒使用的方法相反，rHSV不成為rAAV產物的顯 著污染物。這可用于通過去掉與去除腺病毒相關的純化步驟來增加rAAV病毒體的最終產 率。在本發(fā)明的具體實施方案中，rHSV構建自HSV-1的突變體，在所述突變體中由于ICP27 基因中的缺失而不能復制。任何展現(xiàn)出復制缺陷型表型的其他合適的HSV突變體也可用于 構建rHSV。
[0082] 一種用于使用提述方法進行rAAV產生的特別優(yōu)選的重組突變體HSV-1毒株是 HSV-1毒株d27-l。這種毒株可以如例如Conway等，Gene Ther. (1999)泛:973 985和美國 專利號7, 091，029中所述制備，將其通過提述整體并入本文。如上文所闡釋的，這種突變載 體不產生ICP27并且有利地用于產生rAAV病毒體，因為已知宿主細胞剪接信使RNA受到 ICP27的抑制。ICP27也可能影響AAV-2 r印和cap信使的適當剪接。這種載體是復制缺 陷型并且顯示出與野生型（wt)HSV-l相比降低的細胞毒性。病毒d27-l展現(xiàn)出其他幾種對 于作為輔助病毒用于rAAV病毒體產生的用途有利的特征。首先，其表達已知為rAAV產生 所需的早期基因（Weindler 等，J. Virol. (1991)迎:2476-2483)。另外，d27. 1 過表達 ICP8， 即作為UL29的產物的單鏈DNA結合蛋白，UL29是對于AAV復制和包裝而言關鍵的HSV-1基 因之一（Weindler 等，J.Virol. (1991)迎:2476-2483)〇
[0083] AAV基因組是一種線性的、單鏈DNA分子，含有約4681個核苷酸。AAV基因組通 常包含內部、非重復基因組，其各個末端的側翼為反向末端重復（ITR)。ITR的長度為大約 145個堿基對（bp)。ITR具有多種功能，包括提供DNA復制的起點和用于病毒基因組的包 裝信號?；蚪M的內部非重復部分包括兩個大開讀框（open reading frame)，稱為AAV復 制（r?。┖鸵職ぃ╟ap)基因。rep和cap基因編碼允許病毒復制和包裝至病毒體中的病毒 蛋白。具體而言，從AAV rep區(qū)表達一個家族的至少四種病毒蛋白，即Rep 78、Rep 68、Rep 52和R印40,根據它們的表觀分子量命名。AAV cap區(qū)域編碼至少三種蛋白質，VPI、VP2和 VP3〇
[0084]"AAV r印編碼區(qū)"意指領域內公認的AAV基因組中編碼復制蛋白R印78、R印 68、R印52和R印40的區(qū)域。已經顯示這些Rep表達產物擁有多種功能，包括識別、結合 和切割（nicking)DNA復制的AAV起點，DNA解旋酶活性和調節(jié)從AAV(或其他異源）啟動 子的轉錄。Rep表達產物共同為復制AAV基因組所需。關于對AAV rep編碼區(qū)的描述，參 見，例如，Muzyczka，N. (1992) Current Topics in Microbiol, and Immunol. 158:97-129 ： 和 Kotin, R.M. (1994)Human Gene Therapy 豆:793-801。AAV rep 編碼區(qū)的合適同源物 包括人皰疹病毒6 (HHV-6) r印基因，其也已知介導AAV-2DNA復制（Thomson等（1994) Virol〇gv204:304-311)。
[0085] "AAV