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iNOS抑制劑用于增加培養(yǎng)物中病毒產(chǎn)率的用圖_5

文檔序號(hào):9291117閱讀:來源:國(guó)知局
rHSV-rep2/cap2 和rHSV-EGFP(Kang等, GeneTher. (2009)^:229-239)和它們的產(chǎn)生者ICP27補(bǔ)充性V27細(xì)胞系獲得自 AGTC(Alachua,FL)。wtHSV-1MacIntyre毒株購(gòu)自AdvancedBiotechnologiesInc. (ABI,ColumbiaMD),并且使wtHSV-1K0S毒株在Vero、293或HeLa細(xì)胞系中增殖。通過回 收培養(yǎng)上清液在感染后72小時(shí)收獲了感染性載體顆粒。通過Taqman測(cè)定法以DNA酶抗性 顆粒/ml為單位測(cè)定了HSV-1儲(chǔ)液的滴度。經(jīng)由在DNA酶I(50U/ml最終;Promega)存在 下在37°C處理60分鐘,接著是在50°C進(jìn)行蛋白酶K(Invitrogen)消化(lU/ml)60分鐘,然 后在95°C變性30分鐘,由此定量了粗制培養(yǎng)基內(nèi)的病毒基因組。使用線性化的質(zhì)粒pZero 195UL36 (獲得自AGTC,Inc.,Alachua,FL)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。引物-探針組對(duì)于載體基因組 UL36 序列是特異性的(HSV-UL36F:5'-GITGGTTATGGGGGAGTGTGG(SEQIDN0:1) ;HSV-UL36 R:5' -TCCTTGTCTGGGGTGTCTTCG(SEQIDN0:2) ;HSV-UL36 探針:5' -6FAM-CGACGAAGACTCC GACGCCACCTC-TAMRA(SEQIDN0:3)。PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增使用下述循環(huán)參數(shù)實(shí)現(xiàn):1個(gè)在50°C 持續(xù)2分鐘的循環(huán),1個(gè)在95°C持續(xù)10分鐘的循環(huán);40個(gè)在95°C持續(xù)15秒和60°C持續(xù)60 秒的循環(huán)。
[0115] ATA實(shí)驗(yàn)
[0116]ATA(Sigma-A1895金精三羧酸專門級(jí),彡85 % (滴定),粉末)儲(chǔ)液按照 500yM濃度在100mM碳酸氫鈉水溶液中生成。將ATA儲(chǔ)液在DMEM+/-10 %胎牛血清 (FBS,Hyclone,Waltham,MA)中進(jìn)一步稀釋成 12-60yMATA(8. 5-21ygATA/ml)的濃度范 圍。感染復(fù)數(shù)為〇. 15(M0I= 0. 15)的HSV-1感染(通常為6孔板中6xl05細(xì)胞)在40% (2/5vol)的總最終培養(yǎng)基體積中進(jìn)行1-2小時(shí),而剩余的培養(yǎng)基(60%或3/5的總最終體 積)在稀釋步驟過程中添加。然后將細(xì)胞溫育72小時(shí),并且收獲上清以進(jìn)行形成單位每毫 升(PFU/ml)和DRP/ml滴度測(cè)定。
[0117] 地塞米松(Dex)實(shí)驗(yàn)
[0118] 將地塞米松(Sigma-D4902)在純酒精中溶解至2mg/ml。將其用DMEM稀釋以達(dá) 到1M濃度并儲(chǔ)存在-20°C。
[0119] 在感染前一天將V27細(xì)胞以6xl05細(xì)胞/孔接種至六孔板中。向所述接種培養(yǎng)基 中添加地塞米松以達(dá)到1yM的濃度。將其充分混合并添加至孔。
[0120] 為培養(yǎng)基通氣(aspirated)并以每lmlDMEM(無添加物)M0I0? 15 (=細(xì)胞接種 密度X〇. 15/pfu滴度的HSV儲(chǔ)液)添加感染性HSV-1d27-l儲(chǔ)液。每孔添加lml的感染 性接種物。將其在37°C,5%C02培養(yǎng)箱中溫育1-2小時(shí),在這段時(shí)間之后添加1. 5ml的 DMEM-10%FBS。將培養(yǎng)物返回至培養(yǎng)箱,保持70-74小時(shí)。
[0121] 將游離培養(yǎng)基收獲,渦旋振蕩,在4°C以1,lOOxg離心10分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至新的 分裝管,渦旋振蕩,分成等分試樣并將儲(chǔ)液在_80°C冷凍。
[0122] 丙戊酸(VA)實(shí)驗(yàn)
[0123] 將丙戊酸(Sigma_P4543)溶解在水中至1M濃度。將V27細(xì)胞在感染前一天以 6xl05細(xì)胞/孔接種在六孔板中。將1M丙戊酸摻入lmlDMEM-10%FBS以達(dá)到5yM的濃 度。將其充分渦旋振蕩并添加至孔。將平板溫育六個(gè)小時(shí),通氣并以每lml的DMEM(無添 加物)M0I0. 15 (=細(xì)胞接種密度X〇. 15/pfu滴度的HSV儲(chǔ)液)添加感染性HSV-1d27-l 儲(chǔ)液。
[0124]每孔添加lml的感染性接種物,并在37°C,5% C02培養(yǎng)箱中溫育1-2小時(shí),在這 段時(shí)間之后添加1. 5ml的DMEM-10%FBS。將平板返回至培養(yǎng)箱,保持70-74小時(shí)。將游離 培養(yǎng)基收獲,渦旋振蕩,在4°C以1,100xg離心10分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至新的分裝管,渦旋振 蕩,并分成等分試樣。將儲(chǔ)液在_80°C冷凍。
[0125] rAAV產(chǎn)生
[0126] 將293細(xì)胞(2. 5xl06)用rHSV-r印2/cap2和rHSV-EGFP兩種載體同時(shí)共同感染, 如Kang等,GeneTher(2009)叢:229-239所述。在感染后2-4小時(shí),將感染性培養(yǎng)基用等 同于將感染前培養(yǎng)物體積加倍的DMEM+10%FBS交換。在收獲時(shí),將細(xì)胞團(tuán)塊在-80°C冷 凍。DRP滴度通過在96孔塊狀熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems;7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng))中的 實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)定量。使粗制樣品經(jīng)歷三個(gè)凍融循環(huán),然后在Benzonase(250U/ ml)、2mMMgCl2、l%終濃度蛋白質(zhì)級(jí)Tween80(Calbiochem)存在下溫育并且在37°C溫育 60分鐘,然后在50°(:用0.25%胰蛋白酶(6讓(3〇)消化60分鐘。最后,用0似%1(501]/1111; Promega)在37°C處理30分鐘,然后在95°C變性20分鐘。將線性化的質(zhì)粒pDC67/+SV40用 于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。所述引物-探針組對(duì)于猿猴病毒40(SV40)多聚(A)序列是特異性的:rA AV-F:5 '-AGCAATAGCATCACAAATTTCACAA-3'(SEQIDNO:4) ;rAAV-R:5'-GCAGACATGATAAGATAC ATTGATGAGTT-3'(SEQIDN0:5) ;rAAV-探針:5'6-FAM-AGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGT TTGTC-TAMRA-3'(SEQIDN0:6)。PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增使用以下循環(huán)參數(shù)實(shí)現(xiàn):1個(gè)在50°C持續(xù) 2分鐘的循環(huán),1個(gè)在95°C持續(xù)10分鐘的循環(huán);40個(gè)在95°C持續(xù)15秒和60°C持續(xù)60秒的 循環(huán)。
[0127] 人基因組陣列
[0128] 將匯集的293細(xì)胞(75cm2燒瓶中2. 4x10 6個(gè)細(xì)胞)在DMEM+10%FCS中培養(yǎng)大約 20小時(shí),然后用一個(gè)蝕斑形成單位每細(xì)胞(PFU/細(xì)胞)的HSV-1MacIntyre毒株感染90分 鐘。在感染后90分鐘添加濃度為20yM(最終)的ATA。在感染后24小時(shí)收獲經(jīng)感染的細(xì) 胞。使用RNeasyPlusMiniKit(QIAGEN,Valencia,CA)根據(jù)制造商的說明分離了足夠質(zhì) 量和數(shù)量的總RNA。在Asuragen,Inc的AffymetrixHumanU133Plus2.0 陣列上進(jìn)行了 完整基因組表達(dá)的分析(profiling)。提供3yg總RNA作為輸入材料。
[0129] 總的來說,在生物分析儀上評(píng)估的RNA質(zhì)量具有>9的RIN值。陣列雜交和比例縮 放因子(scalingfactor)在通過質(zhì)量控制的范圍之內(nèi)。在掃描之后,將原始表達(dá)CEL文 件用AffymetrixExpressionConsolevs. 1.1. 2 (affymetrix.com)處理。將每個(gè)CEL文 件用RobustMultichipAnalysis(RMA)處理,并將總結(jié)出的表格作為文本文件輸出。全 部下游基因組和統(tǒng)計(jì)分析使用JMPGenomics(第5版)(jmp.com/software/genomics)進(jìn) 行。首先,應(yīng)用過濾步驟以濾除低表達(dá),具體而言,在8個(gè)樣品的至少2個(gè)中在log2模式下 低于6的那些值。在54,675個(gè)完整六€€7 1]133?11182探針中,41,569(76%)個(gè)探針在截 留之后得到保留。還發(fā)現(xiàn)了良好雜交的兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣品,分別為人腦和匯集的人通用參 照RNA(pooledhumanuniversalreferenceRNA)。對(duì)于將來的分析,將這兩個(gè)樣品排除。
[0130] PrincipleComponentAnalysis揭示了兩個(gè)截然不同的群體,即使用和不使用 HSV處理的樣品。因此,第一種主要成分分離(91.7% )通過HSV相對(duì)于運(yùn)載體(Vehicle) 的效果得到解釋。將數(shù)據(jù)在每個(gè)探針之間進(jìn)行中值標(biāo)準(zhǔn)化,以具有為0的中值信號(hào)。進(jìn)行 AN0VA以在HSV相對(duì)于運(yùn)載體、ATA相對(duì)于運(yùn)載體、HSV+AVA相對(duì)于運(yùn)載體以及HSV+ATA相 對(duì)于單獨(dú)的HSV之間尋找顯著差異性轉(zhuǎn)錄物。沒有將多重測(cè)試校正(Multipletesting correction)包括在內(nèi),并且認(rèn)為顯著性基因的P值低于0. 01。
[0131] 使用自組織圖譜(self-organizedmap)來檢查運(yùn)載體、HSV1以及HSV1+ATA之間 表達(dá)的模式。期望尋找到通過ATA處理而或者上調(diào)或者下調(diào)的轉(zhuǎn)錄物。發(fā)現(xiàn)了在HSV存在 下顯示出一些刺激的一個(gè)獨(dú)特基因簇,而ATA校正使這些基因回復(fù)至運(yùn)載體基線。類似地, 還發(fā)現(xiàn)了與運(yùn)載體相比受到HSV阻抑的一個(gè)基因簇,并且后續(xù)通過ATA處理激活。這些分 別稱作簇A和B(參見表1和2)。使用GeneGO軟件(genego.com)進(jìn)一步進(jìn)行分析以探詢 這些簇的生物學(xué)功能。
[0132] RT2Profiler?PCR 陣列(SABiosciences-QIAGEN)
[0133] 將 6xl0e5 個(gè) 293 細(xì)胞(來自AGTC)用wtHSV-1McIntyre毒株以M0I1 在 DMEM&10%FBS存在下、具有或不具有50uMATA的條件下感染1-2小時(shí),并且用DMEM&10% FBS稀釋至40% (20uM的最終ATA濃度)。24小時(shí)之后將一式三份總RNA樣品使用Qiagen RNeasy小量試劑盒(QiagenRNeasyminikit)收獲并在柱上用DNA酶處理并洗脫。將洗 脫RNA-式三份樣品合并并在260和280nm對(duì)洗脫物進(jìn)行分光光度計(jì)0.D.讀數(shù)以測(cè)定濃 度。將樣品RNA使用SABiosciencesRT2第一鏈試劑盒轉(zhuǎn)換成模板cDNA。然后將該cDNA用 于人JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑PCR陣列(HumanJAK/STATSignalingPathwayPCRArray) (PAHS-039A)〇
[0134] 實(shí)施例1
[0135] 伸用ATA抑制V27細(xì)朐中HSV誘導(dǎo)的iNOS水平
[0136] 將Dulbecco'sModifiedEagles培養(yǎng)基(DMEM) (Hyclone,Waltham,MA)中的 V27 細(xì)胞用HSV-1d27. 1 載體以 1 的MOI感染,并用 30yMATA(Sigma,St.Louis,M0)在具 有或不具有10%胎牛血清(FBS)的條件下處理。還進(jìn)行了不含ATA的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。感染后 (h.p.i.) 24小時(shí)獲得了V27細(xì)胞裂解物,并且對(duì)該裂解物運(yùn)行蛋白質(zhì)印跡,并通過使用純 化的兔抗iNOS/NOSII型pAb(BDBiosciences,Cat#610332)檢測(cè)iNOS蛋白。結(jié)果示于圖 1〇
[0137] 如所顯示的,HSV感染誘導(dǎo)了那些不包括ATA的培養(yǎng)物中的iNOS表達(dá)(泳道4和 5)。在30yMATA存在下iNOS表達(dá)得到了抑制(泳道2和3)。10 %FBS的存在與否對(duì) iNOS表達(dá)沒有影響。
[0138] 實(shí)施例2
[0139] ATA-HSV方案的優(yōu)化
[0140] 為了測(cè)試ATA是否能夠增加V27細(xì)胞中的rHSV-1d27-l(d27-l)載體產(chǎn)率,在感 染過程中(步驟1)或稀釋步驟中(步驟2)將ATA應(yīng)用于培養(yǎng)基(圖2A)。在最終培養(yǎng)基 體積的2/5中進(jìn)行M0I= 0. 15的d27-l感染,并在稀釋步驟期間添加剩余3/5的培養(yǎng)基。
[0141] ATA處理延遲了V27細(xì)胞單層中的細(xì)胞裂解或HSV-1噬菌斑形成。收獲時(shí),即感染 后(hpi)72小時(shí),細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)與不存在ATA條件下的100%CPE相比為20-60%之 間。在HSV-1感染步驟期間用ATA的處理(在步驟1的ATA)顯示了在72hpi收獲時(shí)V27 細(xì)胞上清液中增加的d27-l滴度(圖4B)。當(dāng)在感染步驟期間(ATAI)添加時(shí)最優(yōu)ATA濃 度為50yM,并且這在稀釋步驟期間通過添加剩余3/5體積的培養(yǎng)基被進(jìn)一步稀釋成20yM ATA的終濃度(f.c.)。在這種情況下,ATA將收獲時(shí)(72h.p.i.)上清液中的d27-l滴度增 加了大約 10 倍:從 4. 0±0. 3xl07DRP/ml或 1. 4±0. 2xl07PFU/ml至 3. 7±0. 2xlOsDRP/ml或 1. 2±0. 3xlOsPFU/ml(圖 4B)。
[0142] 為了確定哪些用于ATA添加的濃度和條件對(duì)HSV產(chǎn)率有影響,進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。將 不同濃度的ATA在如下的兩個(gè)步驟中添加至在六孔板(圖2B)或T150燒瓶(圖2C)中的用 HSV-1d27-l載體感染的V27培養(yǎng)物。在方案的步驟1中,在具有10%FBS和0-60yMATA 濃度的2/5最終體積的DMEM中將V27細(xì)胞用0. 15M0I的rHSV載體感染。將細(xì)胞在37°C培 養(yǎng)1-2小時(shí)以完成步驟1。在步驟2中,通過添加3/5的最終培養(yǎng)基體積,ATA的濃度降低 至12-24yM之間的范圍。將細(xì)胞在37°C培養(yǎng)70-74小時(shí),并收獲上清液。將病毒滴度表示 為每毫升的DNA酶抗性顆粒(DRP/ml)或每毫升的蝕斑形成單位(pfu/ml),并如上所述測(cè) 定。
[0143] 結(jié)果示于圖2B和2C中,并且最優(yōu)ATA濃度為粗體??梢钥吹?,在六孔板(圖2B) 和T150燒瓶(圖2C)二者中無論是步驟1或是步驟2添加了ATA的培養(yǎng)物都具有比沒有 ATA的情況顯著更高的HSV滴度。另外,最高滴度見于步驟1中50yM的ATA濃度,在步驟 2降低至20yM(圖2B),盡管全部ATA濃度均產(chǎn)生了比缺乏ATA的那些培養(yǎng)物更高的病毒 滴度。
[0144] 進(jìn)行了額外的實(shí)驗(yàn)來確定最佳條件和存在或不存在FBS對(duì)HSV滴度的影響。在含 ATA培養(yǎng)基中,血清的存在,具體而言10 %胎牛血清(FBS),對(duì)于ATA誘導(dǎo)的HSV-1滴度產(chǎn)率 是最重要的參數(shù)。在稀釋步驟期間將ATA補(bǔ)充至無血清培養(yǎng)基中(在步驟2的ATA)引起 了病毒滴度的降低,其中"DRP"滴度降低至對(duì)照水平以下,并且PFU/ml滴度低得不可檢測(cè) (belowdetection)(圖3)。當(dāng)在感染步驟1期間以3yM濃度起始來補(bǔ)充ATA時(shí),看到了 在無血清培養(yǎng)基中甚至更富戲劇性的影響,DRP/ml和PFU/ml滴度二者均低于檢出限。
[0145] 在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中,在感染前一天將V27細(xì)胞以6xl05個(gè)細(xì)胞/孔接種至六孔板。HSV 2x感染溶液如下制備:將HSV-1d27. 1儲(chǔ)液以2x滴度添加至DMEM(無FBS),細(xì)胞會(huì)以最終 M0I0. 15受到感染。制備了數(shù)種2xATA溶液組合,含有DMEM中或?yàn)?00yM或?yàn)?0yM的 ATA,并且不含F(xiàn)BS或具有20%FBS。
[0146] 將HSV2x感染溶液與體積相等的DMEM-/+20%FBS或期望的2xATA溶液_/+20% FBS混合,渦旋振蕩,并在步驟1中添加每孔lml的感染性接種物。如果孔在步驟1中含有 ATA,那么濃度為50yM并且將所有孔溫育1-2小時(shí)。在步驟2中,添加了額外的1. 5mlDMEM 組合_/+40yMATA和_/+20%FBS。如果孔含有ATA,無論是在步驟1或步驟2中,那么最 終ATA濃度為20yM。將板放回溫育箱,持續(xù)70-74小時(shí),在這段時(shí)間后收獲游離培養(yǎng)基,渦 旋振蕩,并以1,l〇〇xg在4°C離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至新的分裝管,渦旋振蕩,分成等 分試樣,并將儲(chǔ)液冷凍在-80 °C。
[0147] 實(shí)施例3
[0148] ATA-HSV方案中血清存在的重要件
[0149] 進(jìn)行額外的實(shí)驗(yàn)以測(cè)定最優(yōu)條件和FBS的存在或不存在對(duì)HSV滴度的影響。在含 ATA培養(yǎng)基中,血清的存在,具體而言10 %胎牛血清(FBS),對(duì)于ATA誘導(dǎo)的HSV-1滴度產(chǎn)率 是最重要的參數(shù)。在稀釋步驟期間將ATA補(bǔ)充至無血清培養(yǎng)基中(在步
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