專利名稱：抑制病毒復(fù)制的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能有效抑制利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)起動翻譯的傳染性病毒的復(fù)制、和/或能抑制在病毒生命周期任何階段利用La蛋白質(zhì)的病毒的肽。這些肽能與La蛋白質(zhì)競爭并抑制產(chǎn)毒性病毒生命周期對所需La蛋白質(zhì)的多種生化和生理功能的利用。更具體說本發(fā)明包括在這種抑制中具優(yōu)異性能的非天然產(chǎn)生的肽。
背景技術(shù)：
納入本文作為參考文獻(xiàn)的PCT出版物WO96/11211描述了抑制信使RNA在內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)翻譯的方法，依據(jù)的是能結(jié)合這種翻譯所需蛋白質(zhì)的一種寡核苷酸。如該PCT出版物所述，命名為“I-RNA”的此寡核苷酸是根據(jù)對表現(xiàn)出所需抑制性能的酵母菌60個核苷酸的RNA的鑒定。然而如本文進(jìn)一步所述，該I-RNA也可采取此酵母RNA相關(guān)部分的各種模擬形式，如脊髓灰質(zhì)炎病毒186-220核苷酸序列或脊髓灰質(zhì)炎病毒578-618核苷酸序列和其它各種序列。此抑制性寡核苷酸(I-RNA)的重要性在于核苷酸序列本身和其結(jié)合內(nèi)源蛋白質(zhì)的能力。I-RNA結(jié)合的內(nèi)源蛋白質(zhì)命名為人La自身抗原，它能結(jié)合抑制性寡核苷酸從而防止抗原所需的與mRNA結(jié)合并抑制IRES與核糖體互相作用。如同樣納入本文參考文獻(xiàn)的PCT出版物WO99/61613所述，此蛋白質(zhì)的跨越野生型La自身抗原位置11-28的18個-氨基酸部分顯示能抑制病毒復(fù)制。完整的La自身抗原的氨基酸序列先前已由Chambers，J.C.，等，J.Biol.Chem.(1988)25318043-18061描述，也納入本文參考文獻(xiàn)。La自身抗原(LAP)的18個-氨基酸結(jié)合區(qū)域和前述寡核苷酸抑制病毒RNA翻譯的機制在上面所引用的WO99/61613中有所描述。
如前所述，一些病毒包括小核糖核酸病毒、丙肝病毒和其它病毒利用IRES機制來起動翻譯。由于上述寡核苷酸和LAP抑制此種翻譯，它們也抑制病毒復(fù)制和其它病毒必需的功能。如這些出版物所證明，LAP能方便的進(jìn)入細(xì)胞，并位于能影響此種抑制的位置上。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一個相關(guān)肽家族但不包括LAP，在抑制IRES起動翻譯并從而抑制病毒復(fù)制中具有用途。這些肽因此可用于治療病毒感染和研究病毒感染的機制。
發(fā)明公開的內(nèi)容本發(fā)明針涉及可用作抗病毒制劑和作為闡明病毒感染機制研究工具的一個肽家族。這些肽能抑制IRES-起動RNA翻譯。
因此本發(fā)明一方面的內(nèi)容所針對的肽公式為A1n A2n A3n A4A5A6A7A8A9A10A11A12A13A14A15A16A17A18(1)和其?；?或酰胺化形式，其中各個n獨立為0或1；A1、A2和A3各自獨立為任何氨基酸；A4、A12和A17獨立為酸性氨基酸；A13、A14、A15和A18獨立為芳族氨基酸；A5、A7、A8、A11和A16代表任何氨基酸；A6、A9和A10獨立代表堿性氨基酸或極性中性氨基酸；其中各所述氨基酸可以是L型、外消旋形式或D型，條件是所述肽不包括LAP且不包括LAP同源物，由于它們出現(xiàn)在其它種屬中，除非以分離和純化形式。
優(yōu)選氨基酸A5、A7、A8、A11和A16獨立為中性、非芳族氨基酸，更優(yōu)選為疏水性中性、非芳族氨基酸。
優(yōu)選A1、A2和A3為中性，優(yōu)選非芳族氨基酸，優(yōu)選疏水性。
在其它方面，本發(fā)明涉及抑制IRES起動的翻譯和/或其它病毒功能的方法，這是通過將本發(fā)明的肽提供給無細(xì)胞系統(tǒng)或感染了利用IRES起動翻譯的病毒的活細(xì)胞。本發(fā)明還涉及使用發(fā)明的肽或者其藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)組合物抑制病毒復(fù)制和治療病毒感染的方法，且本發(fā)明也涉及這些藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)組合物。植物病毒感染也可用本發(fā)明的肽來抑制且這些肽和編碼它們的核苷酸序列因此也可用于農(nóng)業(yè)和園藝學(xué)。這些肽可這樣提供或原位從核苷酸序列產(chǎn)生。
利用IRES介導(dǎo)的譯從而成為本發(fā)明肽合適靶子的病毒包括但不限于脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、腦心肌炎病毒、口蹄疫病毒、丙肝病毒(HCV)、經(jīng)典的(classic)豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒、弗羅得鼠白血病病毒、莫洛尼鼠白血病病毒、羅斯肉瘤病毒、人免疫缺陷病毒(HIV包括HIV-1和HIV-2)、Plautia stali腸病毒、Rhopalosiphum padi病毒、cricket麻痹病毒、Kaposi肉瘤-相關(guān)皰疹病毒、甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、流感病毒HAV、艾可病毒、柯薩奇病毒、狗霍亂病毒、豬瘟病毒、豬水泡病毒、Pesti病毒和Poty病毒。
這些肽和編碼它們的多核苷酸可與其它抗病毒制劑組合提供。具體說本發(fā)明的肽或它們的編碼核苷酸序列與WO96/11211中所述I-RNA的組合是特別有用的。然而其它抗病毒制劑可和本發(fā)明的肽或與I-RNA組合的本發(fā)明的肽一起施用。
另一方面，本發(fā)明涉及能與本發(fā)明肽起特異性免疫反應(yīng)的抗體。這些抗體包括它們的免疫反應(yīng)片段，可用于純化本發(fā)明的抑制蛋白質(zhì)和評估其在各種藥學(xué)、獸醫(yī)和農(nóng)業(yè)組合物中的水平。
此外，本發(fā)明的肽具有優(yōu)先與一些組織，具體的肝臟相結(jié)合的特性。因此，這些肽可作為其它化合物和組合物的特殊輸送系統(tǒng)，通過使本發(fā)明的肽與需要特殊輸送的物質(zhì)相融合或結(jié)合。
實施本發(fā)明的模式本發(fā)明的肽具有上面列出的公式(1)，其中各氨基酸特征如上所確定。如所指出的，位置1、2和3中3個氨基酸殘基之一可獨立存在或缺失。這些氨基酸最優(yōu)選是疏水性的，但一般任何中性氨基酸可替代且這些位置的氨基酸對于活性確實不重要，因此可使用任何氨基酸。優(yōu)選的是A1、A2和A3從該肽中缺失。
除了一個例外(A14在一些實施方案中出可是中性/極性的)，該肽需要在A4、A12和A17具有酸性氨基酸并在A13、A14、A15和A18具有芳族氨基酸。其余位置不大關(guān)鍵。
常規(guī)氨基酸分類是根據(jù)它們的總體特性從而可進(jìn)行保守替換而不改變分子的性質(zhì)。最簡單的分類是酸性和堿性氨基酸。酸性氨基酸在生理pH下具有負(fù)電荷且在天然產(chǎn)生的氨基酸中由谷氨酸(glu或E)和天冬氨酸(asp或D)為代表。
類似的，堿性氨基酸在生理pH下其有正電荷且在天然產(chǎn)生的氨基酸中由賴氨酸(lys或K)、精氨酸(arg或R)或更小程度上的組氨酸(his或H)為代表。其余氨基酸是中性的，但這些中性氨基酸可進(jìn)一步分成亞類。具體講含芳族體系的氨基酸可置于“芳族”氨基酸分類中且在天然產(chǎn)生的氨基酸中由色氨酸(trp或W)、苯丙氨酸(phe或F)和酪氨酸(tyr或Y)為代表。
中性氨基酸的另一亞類是極性氨基酸，在天然氨基酸中由谷氨酰胺(gln或Q)和天冬酰胺(asn或N)為代表。有時絲氨酸(ser或S)和蘇氨酸(thr或T)由于存在OH也歸于此類中。
中性氨基酸的又一亞類是明顯為疏水性的氨基酸。在天然產(chǎn)生的氨基酸中，這些氨基酸包括纈氨酸(val或V)、亮氨酸(leu或L)、甲硫氨酸(met或M)和異亮氨酸(ile或I)。有時包括在此類中的有半胱氨酸(cys或C)和丙氨酸(ala或A)甚至甘氨酸(gly或G)。然而由于這些氨基酸的小尺寸，它們不象異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸歸類為疏水氨基酸。
唯一的剩余基因-編碼氨基酸脯氨酸(pro或P)很難分類，但顯然是中性的。
因為本發(fā)明肽可以合成以及從核苷酸序列翻譯，沒有必要限制這些氨基酸殘基為由基因編碼的那些殘基。因此這些肽可包括非天然氨基酸如β-丙氨酸(β-ala)、3-氨基丙酸、2，3-二氨基丙酸(2，3-diap)、4-氨基丁酸(4-aba)、α-氨基異丁酸(aib)、肌氨酸(sar)、鳥氨酸(orn)、瓜氨酸(cit)、t-丁基丙氨酸(t-bua)和其它。這些氨基酸可它們的結(jié)構(gòu)分類酸性或堿性。中性形成的可分類為中性/極性或中性/疏水或中性/芳族。其它分類是中性/小氨基酸，其指含4個或更少碳的氨基酸。
另外，因為這些肽可合成產(chǎn)生，故天然肽聯(lián)接可由(電子)等排性(isosteric)聯(lián)接取代，如CH2H、CH2NS、CH2CH2、CH＝CH(順式和反式)、COCH2、CH(OH)CH2、CH2SO作為代表例子。用這些同位取代合成肽-類似分子的方法是本領(lǐng)域熟知的。
類似的，由于已有合成本發(fā)明化合物的合成方法，可采用天然產(chǎn)生和非天然產(chǎn)生的D型氨基酸以及它們的外消旋混合物。尤其優(yōu)選的公式(1)化合物的實施方案包括所有殘基為D構(gòu)型的氨基酸。這種化合物可耐受生物降解并因此特別有效。
公式(1)化合物所述的肽類明確排除了由La抗原結(jié)合區(qū)域(LAP)為代表的肽，這是本領(lǐng)域已知的。此肽在表1中標(biāo)注為LAP公式。表1也列出排布了號碼的天然LAP的具體mutein。同樣也顯示了人LAP同源物中的LAP氨基酸序列。優(yōu)選這些同源物也從權(quán)利要求的肽類中排除，除非這些肽以純化或分離形式提供或以獸醫(yī)、藥學(xué)或農(nóng)業(yè)/園藝學(xué)組合物提供。
如本文所用，“分離的”指一種狀態(tài)，其中該“分離”物質(zhì)取自其天然環(huán)境中。當(dāng)分離時它可能是純化或不純化的，但至少與它天然相關(guān)的一些成分已被去除或被取代。
表1肽 序列LAP AALEAKICHQIEYYFGDF702 AALEAQICQQIEYYFGDF701 AALQAKICHQIQYYFGQF761 QQQEAKICHQIEYYFGDF762 QQQEQKQCHQIEYYFGDF703 AALEAKICHQIEQQQGDQ771 AALEAKICHQIEYYQGDQ772 AALEAKICHQIEQQFGDF631 AALEAKICHQIEYYFGDQ632 AALEAKICHQIEYYQGDF741 AALEAKICHQIEQYFGDF633 AALEAKICHQIEYQFGDF小鼠 ALEAKICHQIEYYFGDF牛 AALEAKICHQIEYYFGDF非洲爪蟾(XENOPUS)LDLDTKICEQIEYYFGDF大鼠 AALEAKICHQIEEYYFGDF線蟲(C.ELEGANS) DDADQRIIKQLEYYFGNI蚊子 VSKLEASTIRQUYYFGDA果蠅(DROSOPHLIA) QERAIIRQVEYYFGDF在公式(1)所述本發(fā)明化合物中，A4、A12和A17必須為酸性氨基酸。這些氨基酸的優(yōu)選實施方案是天冬氨酸和谷氨酸；較佳的A4和A12為谷氨酸且A17為天冬氨酸。優(yōu)選的是任選純化形式D或L存在于這些位置。
A13、A14、A15和A18必須為芳族氨基酸，除了A14可以是中性/極性。優(yōu)選的芳族氨基酸為苯丙氨酸和酪氨酸。較佳的A13和A14為酪氨酸且A15和A18為苯丙氨酸。然而這些殘基可重排如A13和/或A14是苯丙氨酸且A15和/或A18是酪氨酸，或所有這些殘基可以是酪氨酸或所有都是苯丙氨酸。
公式(1)化合物中其余氨基酸較上述氨基酸不太關(guān)鍵。然而具體說，A6和/或A9的殘基優(yōu)選為堿性氨基酸或中性極性氨基酸。中性極性氨基酸優(yōu)選在A10，但也可替換為堿性氨基酸。盡管不太優(yōu)選，任何這些位置可由天冬酰胺取代。雖然在發(fā)明范圍內(nèi)但甚至更不優(yōu)選的是這些位置由甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸或絲氨酸取代。
A7和A3存在時優(yōu)選疏水氨基酸，最優(yōu)選的亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或甲硫氨酸，最優(yōu)選亮氨酸、異亮氨酸或纈氨酸。如果存在，A1和A2以及A5優(yōu)選為疏水小氨基酸，例如丙氨酸、半胱氨酸或甘氨酸，優(yōu)選丙氨酸。A16優(yōu)選甘氨酸，但也可是小氨基酸如丙氨酸或絲氨酸或蘇氨酸。A8優(yōu)選半胱氨酸但也可替換為類似氨基酸，如絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸或甘氨酸。
公式(1)化合物尤其優(yōu)選的實施方案是肽702、肽761和肽633。
肽701也優(yōu)選。
如上所述，本發(fā)明的肽可采用標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)制備，液相或固相為基礎(chǔ)的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，或者如果包括基因-編碼氨基酸的L-異構(gòu)體，可重組獲得。重組產(chǎn)生這些肽可采用合成性多核苷酸，其可用購買儀器方便地合成。編碼區(qū)域可任選地添加能影響分泌的前導(dǎo)序列，隨后在宿主細(xì)胞中表達(dá)，為此目的或事先可操作性連接于能影響表達(dá)的控制序列或使用內(nèi)源性控制序列。此肽可在多種細(xì)胞中產(chǎn)生，包括原核和真核細(xì)胞如酵母和哺乳動物細(xì)胞。如果需要，此肽可在動物或植物中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生。
產(chǎn)生本發(fā)明肽，可提供的形式為N-末端?；缫阴；?，和/或C-末端酰胺化如作為氨甲酰或作為通過羧酸殘基與烴基或二烴基胺反應(yīng)獲得的酰胺。這種烴基或二烴基胺優(yōu)選具有6個碳或更少碳。
除了衍生N或C末端或在此肽的側(cè)鏈上衍生其它反應(yīng)基團，此肽本身的酰胺鍵可由(電子)等排物(isostere)如CH2NH或CH2O、CH2CO等替換。合成這種假-肽的方法也是本領(lǐng)域熟知的。
本發(fā)明的肽也可作為它們的藥學(xué)上可接受鹽提供或可脂化或糖基化。
本發(fā)明的肽包括其酰化和/或酰胺化形式，可制成藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)組合物用于抗病毒治療。這種肽的合適組合物可在雷明頓藥物科學(xué)(Remington’sPharmaceutical Sciences)，最新版，Mack出版公司，Easton，PA中找到，納入本文參考文獻(xiàn)?？蓪⒋嘶衔锱渲瞥捎糜诳诜⑼钙?、透粘膜或其它進(jìn)入途徑或者可注射。標(biāo)準(zhǔn)的組合物是本領(lǐng)域已知的包括片劑、膠囊、溶液、粉末、糖漿、洗液等。這種制劑中包含的賦形劑可包括多種運載體，包括脂質(zhì)體和表面活性劑。給予肽的合適制劑和途徑是普通開業(yè)醫(yī)師所知道的。一種具體的有利制劑包括特此肽與靶因子或某因子如tat蛋白質(zhì)(該蛋白質(zhì)能促進(jìn)相偶聯(lián)的蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞)相偶聯(lián)。劑量水平隨著患者的情況、病毒感染的嚴(yán)重性和主治醫(yī)師的判斷而變化。根據(jù)具體情況優(yōu)化制劑和劑量在醫(yī)師或獸醫(yī)的普通技術(shù)范圍內(nèi)。
在許多可能采用本發(fā)明肽的藥學(xué)/獸醫(yī)學(xué)組合物中，可含有各種以聚合物為基礎(chǔ)的緩-釋系統(tǒng)，此聚合物可以或不降解從而以規(guī)則速度釋放出活性成分或其它基質(zhì)以提供此肽的恒定供應(yīng)。
對于農(nóng)業(yè)應(yīng)用，采用的制劑應(yīng)適于提供此肽給受影響或可能受影響的植物。這種組合物可包括土壤處理組合物、噴射或可采用對單株植物的更精確施用。
除了采用本發(fā)明化合物來治療動物或植物中的病毒感染外，這些肽可用于研究實驗室中病毒感染和復(fù)制的機制。因此，它們對病毒mRNA的各種修飾形式的效果，例如可在無細(xì)胞系統(tǒng)或細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行評估。在這些方面中使用這類肽的方法是熟知的。
在上面所有方面中，用于治療的制劑也可采用編碼核酸給藥，作為裸露DNA或包括在表達(dá)系統(tǒng)中給予。構(gòu)建用于各種宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的；已開發(fā)了在表達(dá)中行使重要功能的適當(dāng)啟動子、增強子、終止信號等，它們適用于各種哺乳動物細(xì)胞、鳥類細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等。啟動子可以是組成型或誘導(dǎo)型。因此，設(shè)計了表達(dá)系統(tǒng)用于待治療的對象。例如對于哺乳動物對象，適合的啟動子包括metalathionin啟動子、各種病毒衍生的啟動子如SV40啟動子等。該表達(dá)系統(tǒng)可包括對于哺乳動物對象給藥特別方便的病毒載體，。特別優(yōu)選的實施方案包括病毒載體如腺病毒載體、或其他病毒載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，這些是本領(lǐng)域已知的?？墒馆d體有條件地復(fù)制從而僅在感染病毒的細(xì)胞中載體自身復(fù)制并產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
可設(shè)計出在對病毒感染的反應(yīng)中或在對其它外部化學(xué)或物理信號的反應(yīng)中能復(fù)制和表達(dá)的載體。該載體也可含同源序列用于將適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)整合到宿主細(xì)胞基因組中或者可另外設(shè)計當(dāng)細(xì)胞分裂時能復(fù)制和傳遞給子代細(xì)胞的載體入。許多合適的載體在本領(lǐng)域已知的，包括例如采用于轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34(+)細(xì)胞的自身-失活慢病毒載體和腺病毒載體與野生型腺病毒的混合物。
如上所述，此肽可與其它抗病毒制劑組合給藥，包括PCT出版物WO96/11211的描述的I-RNA?！癐-RNA”指任何能模擬本文所述內(nèi)源性酵母抑制性RNA的抑制效應(yīng)的核苷酸序列。許多包括這類模擬物的核苷酸序列描述于PCT出版物中。應(yīng)該強調(diào)的是I-RNA抑制效應(yīng)是該核苷酸序列本身的一種功能；因此I-RNA可作為RNA、DNA或替換核酸骨架(如本領(lǐng)域熟知的肽核酸)給藥。“I-RNA”因此包括與任何支持骨架偶聯(lián)的核苷酸序列。確實，形成該核苷酸序列的堿基不需要是天然產(chǎn)生的A、T(U)、G、C，而且也可包括這些堿基的能保持天然核苷酸必須的互補特性的修飾形式。
可制成本發(fā)明方法中所用的一些結(jié)合組合物以控制病毒感染。這些包括將本發(fā)明的肽和上述的I-RNA相結(jié)合。本發(fā)明肽的表達(dá)系統(tǒng)與I-RNA的組合，本發(fā)明肽或其表達(dá)系統(tǒng)與不同的抗病毒制劑如無環(huán)鳥苷、反義抗病毒序列或其表達(dá)系統(tǒng)、靶向病毒RNA或其表達(dá)系統(tǒng)的核酶、或任何其它抗病毒制劑或組合的抗病毒劑的組合。這些抗病毒制劑也可用于與I-RNA和本發(fā)明的肽組合。
另一方面，本發(fā)明涉及能與本發(fā)明肽發(fā)生特異免疫反應(yīng)的抗體。如上所指出，這些抗體可用于評估制劑中該肽的濃度以及監(jiān)測本發(fā)明肽給藥后的水平。如本文所定義，“抗體”或“免疫球蛋白”包括諸如Fab、Fab’等能保持完整抗體免疫特異性的片段，也包括這些抗體的重組形式，包括單鏈形式如Fv形式。產(chǎn)生針對本發(fā)明肽的抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的；免疫特異性可通過與本發(fā)明蛋白質(zhì)的結(jié)合試驗的結(jié)果來確定，與類似但不同的肽的結(jié)合試驗的結(jié)果相比較。10倍的結(jié)合差異，優(yōu)選100倍，更優(yōu)選1000倍的結(jié)合差異是這種特異性的指征。
本發(fā)明的免疫特異性抗體可以是多克隆或單克隆抗體和重組的或免疫產(chǎn)生的抗體。它們可使用本領(lǐng)域熟知的方法修飾成為種屬-特異性。因此，如果需要，例如這些抗體可人源化。
可將上述本發(fā)明肽的特異性免疫球蛋白偶聯(lián)于固體支持物并用于純化本發(fā)明的肽。
雖然本發(fā)明的肽似乎能回到某些組織，具體是肝臟，但可通過將它們偶聯(lián)于其它蛋白質(zhì)或?qū)唧w器官或組織有特異性的其它組合物而自身靶向到所需部位。因此，可將這些肽偶聯(lián)于能結(jié)合所需靶受體的配體或偶聯(lián)于能與細(xì)胞表面蛋白質(zhì)或腫瘤相關(guān)抗原反應(yīng)的化合物。
然而，由于本發(fā)明肽確實能回到肝臟組織，故它們自身可用作輸送系統(tǒng)以運輸其它化合物到這些部位。因此，發(fā)明的另一方面是采用本發(fā)明的肽作為其它化合物的輸送系統(tǒng)。
實施例以下實施例旨在闡明而不是限制本發(fā)明。
制備A制備試驗肽采用Stratagene的QuickChangeTM定點誘變試劑盒(#200518)，將氨基酸變化引入La的野生型cDNA克隆中(Dr.Jack Keene，Duke University，North Carolina友情提供)(Chambers，J.C.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)822115-2119)。該重組蛋白質(zhì)通過0.4mM IPTG誘導(dǎo)4小時在大腸桿菌(BL21(DE3)pLysS)中表達(dá)。用超聲波裂解細(xì)胞4℃離心裂解物(12,000Xg)30分鐘。上清液用硫酸鏈霉素(3％終濃度)處理并如上離心。以緩沖液A(25mM Tris pH8.0，100mM NaCl)4℃透析上清液過夜并隨后裝到緩沖液A平衡的DEAE Sephacel柱上。收集流穿液并用FPLC通過肝素瓊脂糖柱和0到1M NaCl梯度分離。合并含有純化La或La突變體的組分并以緩沖液A透析。
對于測試此肽進(jìn)入細(xì)胞能力的實驗，用Molecular Probe的FluoReporter FITC蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑盒(F-6434)根據(jù)廠商說明并作少量修改以FITC-標(biāo)記這些肽。所有肽由Biosynthesis(http//www.biosyn.com)合成并純化至＞95％均一將這些。肽以5mg/ml溶解于100mM Tris-HCl，pH8.0中并用無核酸酶的水稀釋至1mg/ml，用于隨后的翻譯試驗。對于FITC-標(biāo)記，將肽溶解在PBS，pH8.0中。
實施例1各種肽對體外翻譯的作用在這些實驗中，p2CAT(Coward，P.等，J.Virol(1992)66286-285)質(zhì)粒DNA用BamHI線性化并用SP6 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄的mRNA用酚氯仿抽提和乙醇沉淀來純化。將脊髓灰質(zhì)炎病毒5’UTR的一個克隆，PV 5’UTR(Das，S.，等，J.Virol(1994)687200-7211)用HindIII線性化并用T7 RNA聚合酶在存在α-32PUTP(3000Ci/mmole)時轉(zhuǎn)錄。放射性同位素標(biāo)記的RNA用Quick Spin RNA柱(Roche)純化。
將海拉細(xì)胞單層培養(yǎng)在添加了10％胚胎牛血清的基本必須培養(yǎng)基中。如上所述制備海拉細(xì)胞裂解物(Coward，等，同前；Rose，J.K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)752732-2736)。用海拉細(xì)胞提取物體外翻譯p2CAT基本上如別處所述進(jìn)行(Rose，等，同前)。當(dāng)存在25μCi35S甲硫氨酸和40U RNAsin(Promega)時在25μl反應(yīng)混合物中的80μg海拉細(xì)胞提取物中翻譯微克的體外轉(zhuǎn)錄的p2CATRNA。每次反應(yīng)加入20、40和60μM濃度的肽。作為陰性對照，也測試了3μl稀釋(1∶5)的100mM Tris-HCl，pH8.0.。
表1顯示了這些肽的結(jié)果如下肽702在40和60μM濃度時有效抑制了CAT報道蛋白質(zhì)的翻譯，其中A6的賴氨酸和A9的組氨酸被中性極性氨基酸谷氨酰胺取代；然而肽701在這些濃度時喪失抑制翻譯的能力，其中A4、A12和A17的酸性殘基都被中性極性氨基酸谷氨酰胺取代。
肽761其A1、A2和A3被極性中性氨基酸谷氨酰胺取代，在60μM時為抑制性，40μM時為輕度抑制性。然而除了在A1-A3取代外當(dāng)A5的丙氨酸和A7的異亮氨酸由谷氨酰胺取代時，此肽失去抑制翻譯的能力。
在類似的實驗中，采用肽703、771和772，其位置A13或更遠(yuǎn)位置的一個或多個芳族氨基酸由谷氨酰胺取代也失去抑制活性。在這些實施方案中，A13、A14、A15和A18的芳族殘基至少兩個這樣被取代。
如果僅進(jìn)行一個取代，如肽631、632、741和633中那樣抑制翻譯的能力再次減小。然而，肽633和631在更高濃度水平仍能抑制；肽631在40和60μM濃度抑制時，肽633在60μM時能抑制。肽631中，僅A18由谷氨酰胺取代；肽633中僅A14這樣被取代。
因此，雖然A13、A14、A15和A18通常必須是芳族氨基酸殘基，包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的實施方案中A14或A18由中性氨基酸取代，優(yōu)選不是小的中性氨基酸。
實施例2本身結(jié)合mRNA的能力對于此分析，將32P-標(biāo)記的PV 5’UTR RNA(1×106cpm)探針與重組野生型La或其突變體30℃培養(yǎng)10分鐘。結(jié)合后，如(Banerjee，R.，等)描述反應(yīng)完成“RNA病毒的體外復(fù)制”(In-vitro Replication of RNA Viruses)，第158-164頁，A.Cann(編輯)，RNA病毒一種實踐方法(2000)(RNA VirusesA PracticalApproach)Oxford University Press，New York。
將標(biāo)記的PV 5’UTR RNA通過UV交聯(lián)于500ng、1μg或1.5μg野生型La抗原或兩種肽771或772。RNase消化后，將該蛋白質(zhì)核苷酸復(fù)合物在SDS聚丙烯酰胺上分析。結(jié)果顯示對兩種肽的結(jié)合顯著降低。
在類似的實驗中，肽741獲得相似結(jié)果，其A13從酪氨酸變成谷氨酰胺。當(dāng)A25從苯丙氨酸變成谷氨酰胺和當(dāng)A24的酪氨酸變成谷氨酰胺時觀察到結(jié)合僅輕微降低。
實施例3細(xì)胞進(jìn)入和保持對于這些實驗，使用FITC-標(biāo)記的肽。肽標(biāo)記見上面的制備a所述。標(biāo)記后肽用Quick Spin RNA柱(Roche)純化。將載玻片室(slide chamber)中培育的海拉或Huh-7細(xì)胞用5μM的各種肽培養(yǎng)過夜。(肝細(xì)胞癌細(xì)胞(Huh-7)培育在添加10％胚胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基(GIBCO/BRL))中。細(xì)胞膜隨后用1∶200稀釋的DiIC18(Molecular Probes)以1mg/ml工作濃度染色20分鐘然后用PBS洗3次。細(xì)胞用25μl Gelvatol分層并覆蓋蓋玻片。在Leitz共焦激光掃描顯微鏡系統(tǒng)中用100X油浸鏡頭分析細(xì)胞。
一般，結(jié)果顯示肽進(jìn)入和保持在細(xì)胞中的能力與它們抑制翻譯的活性相平行。各種測試肽的結(jié)果總結(jié)于表2。
表2

權(quán)利要求
1.一種以下公式的化合物A1n A2n A3n A4A5A6A7A8A9A10A11A12A13A14A15A16A17A18(1)及其?；?或酰胺化形式，其特征在于，各個n獨立為0或1；A1、A2和A3各自獨立為任何氨基酸；A4、A12和A17獨立為酸性氨基酸；A13、A14、A15和A18獨立為芳族氨基酸；A5、A7、A8、A11和A16代表任何氨基酸；A6、A9和A10獨立代表堿性氨基酸或極性中性氨基酸；其中各所述氨基酸可以是L型、外消旋形式或D型，條件是當(dāng)所有氨基酸是L型時公式(1)的化合物不是AALEAKICHQIEYYFGDF；當(dāng)所有氨基酸是L型且公式(1)是序列ALEAKICHQIEYYFGDF、AALEAKICHQIEYYFGDF、LDLDTKICEQIEYYFGDF、AALEAKICHQIEEYYFGDF、DDADQRIIKQLEYYF GNI、VSKLEASTIRQEYYFGDA或QERAIIRQVEYYFGDF時，公式(1)的化合物必須是分離形式。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，其中所有氨基酸是基因編碼的。
3.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，其中所有Ai亞基之間的連接鍵是酰胺鍵。
4.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，其中所有Ai是D型。
5.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，其中所有Ai是L型。
6.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，其中各A4、A12和A17各自獨立為天冬氨酸或谷氨酸。
7.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，其中A13、A14、A15和A18各自獨立為苯丙氨酸或酪氨酸。
8.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，其中A8是半胱氨酸。
9.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，其中A6、A9和A10各自獨立為賴氨酸、組氨酸、精氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺。
10.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物選自AALEAQICQQIEYYFGDF、AALQAKICHQIQYYFGQF、QQQEAKICHQIEYYF GDF和AALEAKICHQIEYQFGDF。
11.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物為分離或純化形式并選自ALEAKICHQIEYYFGDF、AALEAKICHQIEYYFGDF、LDLDTKICEQIEYY FGDF、AALEAKICHQIEEYYFGDF、DDADQRIIKQLEYYFGNI、VSKLEASTIRQ EYYFGDA和QERAIIRQVEYYFGDF。
12.一種藥學(xué)、獸醫(yī)或農(nóng)業(yè)/園藝學(xué)組合物，其特征在于，所述組合物包括權(quán)利要求1所述的化合物和適當(dāng)?shù)馁x形劑。
13.一種核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括編碼權(quán)利要求2所述化合物的核苷酸序列。
14.一種重組表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于，所述表達(dá)系統(tǒng)包括包括編碼權(quán)利要求2所述化合物的核苷酸序列，該核苷酸序列操作性連接于有效控制其表達(dá)的序列。
15.一種重組宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞被修飾而含有權(quán)利要求14所述的表達(dá)系統(tǒng)。
16.如權(quán)利要求15所述的重組宿主細(xì)胞，其特征在于，其中表達(dá)系統(tǒng)整合到所述宿主細(xì)胞基因組中。
17.一種產(chǎn)生權(quán)利要求2所述化合物的方法，其特征在于，所述方法包括影響權(quán)利要求14所述表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)所述化合物。
18.如權(quán)利要求14所述的表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于，所述表達(dá)系統(tǒng)包括在一病毒載體中。
19.如權(quán)利要求18所述的病毒載體，其特征在于，所述載體是腺病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
20.一種治療植物或動物對象中病毒感染的方法，其特征在于，所述方法包括給予所述對象抗病毒有效量的權(quán)利要求1所述化合物。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述方法還包括給予至少一種其它的抗病毒制劑。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述化合物的施用和所述至少一種其它的抗病毒制劑的給藥基本上同時進(jìn)行。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，權(quán)利要求1所述化合物和所述至少一種抗病毒制劑的所述給藥是依次的。
24.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述其它的抗病毒化合物是I-RNA。
25.一種治療植物或動物對象中病毒感染的方法，其特征在于，所述方法包括給予所述對象抗病毒有效量的編碼權(quán)利要求2化合物的核苷酸序列。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述核苷酸序列包含在與所述對象細(xì)胞相容的表達(dá)系統(tǒng)中。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述方法還包括給予至少一種其它的抗病毒制劑。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述化合物和所述至少一種其它的抗病毒制劑的給藥基本上同時進(jìn)行。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，權(quán)利要求1所述化合物和所述至少一種抗病毒化合物的所述給藥是依次的。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述其它的抗病毒化合物是I-RNA。
31.一種選擇性輸送化合物給肝臟的方法，其特征在于，所述方法包括給予對象肝臟偶聯(lián)于權(quán)利要求1所述化合物的所需化合物。
32.能與權(quán)利要求1所述化合物發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體。
33.如權(quán)利要求32所述的抗體，其特征在于，所述抗體是免疫特異性片斷。
34.如權(quán)利要求33所述的抗體，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體。
35.一種純化權(quán)利要求1所述化合物的方法，其特征在于，所述方法包括使含所述化合物的樣品與對其有特異免疫反應(yīng)的抗體相接觸，所述抗體偶聯(lián)于一固體支持物上。
全文摘要
描述了具有酸性和芳族氨基酸特定模式的肽，這些肽能抑制病毒感染。這些肽包含15－18個氨基酸并可與其它的抗病毒制劑組合和/或以編碼它們的核苷酸序列形式給藥。
文檔編號C12N15/09GK1636016SQ02812042
公開日2005年7月6日 申請日期2002年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月16日
發(fā)明者A·達(dá)斯谷普塔, S·達(dá)斯, N·拜德亞 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會