專利名稱：用于檢測百合無癥病毒的引物、試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于RT-PCR檢測百合無癥病毒的引物、試劑盒及檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
百合無癥病毒屬于香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)，暫時無科。主要分布在瑞典、英國、德國、丹麥、荷蘭、比利時、意大利、拉脫維亞、美國、加拿大、日本等國家。限于百合科，多為系統(tǒng)侵染。LSV —般不會造成明顯癥狀，但會造成百合采后下部葉片提前黃化，影響瓶插壽命，與黃瓜花葉病毒(CMV)復(fù)合侵染時，可造成脈明、花葉、畸形、壞死斑等癥狀。自然條件下由蚜蟲非持久性傳播，介體蚜蟲有棉蚜、桃蚜，百合汁液和種子不傳。病毒粒子彎曲狀，大小為640X17-18nm，外殼分子量為32KD，由292個氨基酸組成，核酸約占粒體重的8.3 %，由單一 RNA組成。病毒顆粒沉降系數(shù)為172S, A260/280=l.20-1.43，致死溫度為 65_70°C，稀釋限點(diǎn)為 10'LSV為RNA病毒，其基因組全長8393bp，共有6個開放閱讀框(0RF)，只編碼5個蛋白，從5’端到3，端分別為25KD、12KD、7KD、32KD和16KD，其中最長的ORF為876bp，編碼32KD病毒外殼蛋白。現(xiàn)有用于RT-PCR檢測百合無癥病毒的引物其特異性相對不夠強(qiáng)，靈敏性相對較差，這往往會造成檢測結(jié)果準(zhǔn)確性不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種用于RT-PCR檢測百合無癥病毒的引物以及包含該引物的試劑盒及方法，利用該引物及檢測方法檢測百合無癥病毒準(zhǔn)確性高，特異性強(qiáng)、靈敏性高。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下方案:一種用于檢測百合無癥病毒的引物，其特征在于:引物序列: LSV Primer-1:5’-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3’，LSV Primer-2:5’-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3’ 。一種檢測百合無癥病毒的試 劑盒，其特征在于該試劑盒包括有:A、EnzymeM丄久100 μ I
B、Buffer625 μ 1X2
C、LSVPrimer-150 μ I
D、LSVPrimer-250 μ I
E、PositiveControl50 μ I
F、RNaseFree dH201 000 μ I ；其中所述的LSV Primer-1 序列為 5’ -AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3’ ；所述的 LSVPrimer-2 序列為 5’ -CACAAGCATGCTGTTCCACA-3’。如上所述的一種檢測百合無癥病毒的試劑盒，其特征在于所述的Enzyme Mix包括反轉(zhuǎn)錄酶、PCR擴(kuò)增用的Taq聚合酶、RNA酶抑制劑；所述的Buffer包括MgCl225mM、dNTPslOmM ;所述Positive Control為百合無癥病毒的核酸；所述RNase Free dH20為除去RNA酶后的去離子水。一種檢測百合無癥病毒的檢測方法，其特征在于包括以下步驟:A、待測樣品RNA提取，得模板RNA溶液；B、將步驟A中的模板RNA溶液反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再采用引物L(fēng)SVPrimer-1和LSV Primer-2對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR反應(yīng)液；其中所述的LSVPrimer-1 序列為 5’ -AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3，;所述的 LSV Primer-2 序列為5’-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3’ ；C、取PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析；D、若存在297bp的DNA條帶，則證明所檢測用品中帶有百合無癥病毒。本發(fā)明中所述297bp的DNA條帶序列為:AAGATGAAAGTTGGCGTCGTATCTAACAACATGGCAACCACTGAACAAATGGCCA AGATAGCGTCAGACATCGCAGGGCTTGGGGTACCAACGGAGCACGTCGCGTCAGTAATA TTGCAAATGGTCATCATGTGTGCTTGCGTGAGCAGTTCTGCGTTCCTTGACCCTGAGGG CAGCATTGAGTTTGAGAATGGAGCGGTGCCCGTCGACTCCATCACTGCGATCATGAAGA AGCACGCTGGACTGCGGAAAGTCTGCCGGCTCTATGCCCCTATCGTGTGGAACAGCATGCTTGTG。如上所述的一種檢測百合無癥病毒的檢測方法，其特征在于步驟A中所述待測樣品RNA提取,具體包括如下步驟:al、選取0.1-0.2g表現(xiàn)可疑癥狀的百合葉片組織，同時用等量健康組織作為對照；將百合葉片組織加液氮冷凍，充分研磨后裝入1.5mL離心管中；

a2、在離心管中加入冰冷的400 μ L RNA抽提液，顛倒混合均勻；a3、臺式冷凍離心機(jī)4°C, 12000g離心IOmin ；a4、取上清，加入400 μ L苯酚、氯仿、異戊醇的混合液，其中苯酚、氯仿、異戊醇的體積比為25:24:1，顛倒混合均勻；a5、臺式冷凍離心機(jī)4°C, 12000g離心IOmin ；
a6、取上清，加入400 μ L氯仿、異戊醇的混合液，其中氯仿、異戊醇的體積比為24:1，顛倒混合均勻；a7、臺式冷凍離心機(jī)4°C, 12000g離心IOmin ；a8、取上清，加入1000 μ L無水乙醇和40 μ L3M醋酸鈉ρΗ5.2，顛倒混合均勻；a9、臺式冷凍離心機(jī)4°C 12000g離心IOmin ；alO、留沉淀，用500 μ L70%冷乙醇洗滌一次，置于超凈工作臺上吹干，然后溶于20μ L無RNA酶的水中。如上所述的一種RT-PCR檢測百合無癥病毒的檢測方法，其特征在于步驟B中所述模板RNA溶液反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體包括以下步驟:在0.5mL離心管中加入去離子水9.5 μ L，加入總RNA2 μ L，Primer-2引物I μ L，濃度為10mmol/L的dNTP sl μ L, 70°C水浴5min后立即置于冰上2min ;然后3000rpm離心30s ；再加入 5XcDNA 第一鏈合成緩沖液 4yL，0.lmol/L DTTl μ L ;RNase 抑制劑 I μ L(30U)；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 I μ L(20U) ；37°C 60min。如上所述的一種RT-PCR檢測百合無癥病毒的檢測方法，其特征在于步驟B中所述PCR擴(kuò)增具體包括以下步驟:在0.2mL離心管中加入10 X PCR擴(kuò)增緩沖液2.5 μ L，濃度為25mmol/L的MgCl22 μ L,濃度為 10mmol /I,的 dNTPsl μ L, Primer-1l μ M (50pmol), Primer-21 μ M(50pmol), cDNA第一鏈合成反應(yīng)液2 μ L，加水至25 μ L，然后加入Taq聚合酶0.5 μ L(IU)；PCR 循環(huán)條件:94°C變性 3min ;然后 94°C lmin，52°C lmin，72°C lmin，循環(huán) 35 次;最后 72°C延伸IOmin ;4°C保存反應(yīng)產(chǎn)物。如上所述的一種檢測百合無癥病毒的檢測方法，其特征在于步驟C中所述瓊脂糖凝膠電泳分析具體包括以下步驟:Cl、用I XTAE緩沖液和瓊脂糖按1.5%的濃度配好，在微波爐中熔化均勻，冷卻至50-60 0C ； C2、加入SYBR GREEN I核酸染料或濃度為I μ g/mL的溴化乙錠，混合均勻，倒入
凝膠平臺上，插上樣品梳；c3、待凝膠凝固后,拔出梳子,加入適量的TAE緩沖；c4、取I μ L加樣緩沖液與5 μ L PCR反應(yīng)液混合均勻，然后分別將其和合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物加入樣品孔中；c5、接通電源進(jìn)行電泳，電壓5V/cm ;c6、當(dāng)加樣緩沖液中的溴酚藍(lán)遷移至足夠分離DNA片段時，停止電泳；將整個膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，并照像記錄。本發(fā)明檢測方法中所采用到的試劑:IPCR檢測試劑2RNA抽提緩沖液:20mmol/L Tris-HCl, ρΗ8.0lmmol/L EDTA, pH8.0
1%SDS, 0.2% β -巰基乙醇3ΤΕ緩沖液
IOmmoI/L Tris-HCl, ρΗ8.0lmmol/L EDTA, pH8.04TAE 緩沖液40mmol/L Tris-HAc,lmmol/L EDTA, pH8.056 X加樣緩沖液溴酚藍(lán)0.25%6引物合成根據(jù)LSV保守序列設(shè)計(jì)特異性引物:BSV Primer-1:5’-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3’BSV Primer-2:5’-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3’本發(fā)明檢測方法中使用的儀器和用具包括:1、PCR 擴(kuò)增儀

2、電泳儀3、臺式高速冷凍離心機(jī)4、凝膠成像系統(tǒng)5、電子分析天平6、移液器(0.1-2 μ L, 2-10 μ L, 10-100 μ L, 100-1000 μ L)7、研缽8、0.2mL、0.5mL、1.5mL 離心管綜上所述，本發(fā)明的有益效果:本試劑盒專門用于檢測香蕉線條病毒BSV。陽性對照是含有發(fā)病香蕉葉片中克隆出來的BSV基因的載體；使用本試劑盒，只要加入待檢樣品的核酸和本試劑盒中的BSV的一對引物，便可以進(jìn)行PCR反應(yīng)，大大地簡化了操作過程，減少了 PCR操作過程中的污染，同時使檢測效率大幅度提高，檢測靈敏度也非常高，可以達(dá)到0.1pg ;另外使用本制品擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物:V端還附有一個“A”堿基，可直接克隆于T-Vector中。


圖1為本發(fā)明中用RT-PCR方法檢測百合無癥病毒的凝膠電泳圖。其中，1:分子量標(biāo)準(zhǔn)；2:陽性對照；3-7:樣品檢測；8:陰性對照。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步描述:實(shí)施例1本發(fā)明試劑盒:1、用途:PCR法檢測百合植株中的LSV。
2、包裝量:50 μ I的RT-PCR反應(yīng)體系50次量。3、制品說明本試劑盒采用一步(One St印)RT-PCR法，對百合植株中的LSV進(jìn)行檢測。本試劑盒包含酶混合試劑、緩沖液、LSV檢測引物和陽性對照。實(shí)驗(yàn)操作簡單方便，防止交叉污染。本試劑盒具有以下特點(diǎn):3.1進(jìn)行高效的RT-PCR擴(kuò)增，檢測靈敏度為0.lpg。3.2使用本試劑盒擴(kuò)增得到的目的產(chǎn)物3，端附一個A堿基，可以直接克隆于T-Vector 中。4、制品內(nèi)容(50次量)
權(quán)利要求
1.一種用于檢測百合無癥病毒的引物，其特征在于: 引物序列:LSV Primer-1:5’-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3’ ，LSV Primer-2:5’-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3’ 。
2.一種檢測百合無癥病毒的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括有: A、EnzymeMix100 μ I B、Buffer625 μ 1X2 L LSV Primer-150P I D' LSV Primer-250P IE、PositiveControl50 μ IF、RNaseFree dH201 000 μ I ； 其中所述的 LSV Primer-1 序列為 5’ -AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3，;所述的 LSVPrimer-2 序列為 5’ -CACAAGCATGCTGTTCCACA-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測百合無癥病毒的試劑盒，其特征在于所述的EnzymeMix包括反轉(zhuǎn)錄酶、PCR擴(kuò)增用的Taq聚合酶、RNA酶抑制劑；所述的Buffer包括MgCl225mM、dNTPslOmM ;所述Positive Control為百合無癥病毒的核酸；所述RNase Free dH20為除去RNA酶后的去離子水。
4.一種檢測百合無癥病毒的檢測方法，其特征在于包括以下步驟: A、待測樣品RNA提取，得模板RNA溶液； B、將步驟A中的模板RNA溶液反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再采用引物L(fēng)SVPrimer-1和LSV Primer-2對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR反應(yīng)液；其中所述的LSV Primer-1序列為 5’ -AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3’ ；所述的 LSV Primer-2 序列為5’-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3’ ； C、取PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析； D、若存在297bp的DNA條帶，則證明所檢測用品中帶有百合無癥病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測百合無癥病毒的檢測方法，其特征在于步驟A中所述待測樣品RNA提取，具體包括如下步驟: al、選取0.1-0.2g表現(xiàn)可疑癥狀的百合葉片組織，同時用等量健康組織作為對照；將百合葉片組織加液氮冷凍，充分研磨后裝入1.5mL離心管中； a2、在離心管中加入冰冷的400 μ L RNA抽提液，顛倒混合均勻； a3、臺式冷凍離心機(jī)4°C, 12000g離心IOmin ； a4、取上清，加入400 μ L苯 酚、氯仿、異戊醇的混合液，其中苯酚、氯仿、異戊醇的體積比為25:24:1，顛倒混合均勻； a5、臺式冷凍離心機(jī)4°C, 12000g離心IOmin ； a6、取上清，加入400 μ L氯仿、異戊醇的混合液，其中氯仿、異戊醇的體積比為24:1，顛倒混合均勻； a7、臺式冷凍離心機(jī)4°C, 12000g離心IOmin ； a8、取上清，加入1000 μ L無水乙醇和40 μ L3M醋酸鈉ρΗ5.2，顛倒混合均勻； a9、臺式冷凍離心機(jī)4°C 12000g離心IOmin ； alO、留沉淀，用500 μ L70%冷乙醇洗滌一次，置于超凈工作臺上吹干，然后溶于20 μ L無RNA酶的水中。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測百合無癥病毒的檢測方法，其特征在于步驟B中所述模板RNA溶液反轉(zhuǎn)錄成cDNA,具體包括以下步驟: 在0.5mL離心管中加入去離子水9.5 μ L，加入總RNA2 μ L，Primer-2引物I μ L，濃度為IOmmoI/L的dNTPsl μ L，70°C水浴5min后立即置于冰上2min ;然后3000rpm離心30s ;再加入 5 X cDNA 第一鏈合成緩沖液 4 μ L，0.lmol/L DTTl μ L ；RNase 抑制劑 I μ L (30U) ；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 I μ L(20U) ；37°C 60min。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測百合無癥病毒的檢測方法，其特征在于步驟B中所述PCR擴(kuò)增具體包括以下步驟: 在0.2mL離心管中加入10 X PCR擴(kuò)增緩沖液2.5 μ L，濃度為25mmol/L的MgCl22 μ L，濃度為 10mmol/L 的 dNTPsl μ L, Primer-1l μ M (50pmol), Primer-21 μ M (50pmol), cDNA 第一鏈合成反應(yīng)液2 μ L，加水至25 μ L，然后加入Taq聚合酶0.5 μ L(IU) ;PCR循環(huán)條件:94°C變性 3min ;然后 94°C lmin,52°C lmin,72°C lmin，循環(huán) 35 次；最后 72°C延伸 IOmin ;4°C保存反應(yīng)產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測百合無癥病毒的檢測方法，其特征在于步驟C中所述瓊脂糖凝膠電泳分析具體包括以下步驟: c 1、用I X TAE緩沖液和瓊脂糖按1.5 %的濃度配好，在微波爐中熔化均勻，冷卻至50-60 0C ； C2、加入SYm作I核酸染料或濃度為I μ g/mL的溴化乙錠，混合均勻，倒入凝膠平臺上，插上樣品梳； c3、待凝膠凝固后，拔出梳子，加入適量的TAE緩沖； C4、取I μ L加樣緩沖液與5 μ L PCR反應(yīng)液混合均勻，然后分別將其和合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物加入樣品孔中； c5、接通電源進(jìn)行電泳，電壓5V/cm ； c6、當(dāng)加樣緩沖液中的溴酚藍(lán)遷移至足夠分離DNA片段時，停止電泳；將整個膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，并照像記錄。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于檢測百合無癥病毒的引物、試劑盒及檢測方法，本發(fā)明所述引物的序列為LSV Primer-1:5'-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3'，LSV Primer-2:5'-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3'。本發(fā)明所述的試劑盒及檢測方法中包含上述引物L(fēng)SV Primer-1和LSV Primer-2。利用該引物及檢測方法檢測百合無癥病毒準(zhǔn)確性高，特異性強(qiáng)、靈敏性高。
文檔編號C12N15/11GK103243175SQ20131016281
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月6日
發(fā)明者陳定虎, 陳祖華, 王宏 申請人:陳定虎