專利名稱：一種菌根食用菌菌種的分離培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌的技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種用于生產(chǎn)菌根食用菌子實體為目的 的菌種的分離和培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
目前菌根菌的大多數(shù)可食用子實體都是著名的食用菌，其價格極其昂貴。如松 □蘑(Tricholoma matsutake)、黑孢塊菌(Tubermelanosporum Vitt.)、意大禾丨J 白塊菌 (Tuber magnatum)、松乳 (Lactarius deliciosus)、紅汁乳 (L. hatsudake)、美味牛 月干lif (Boletus edulis)lif (Amatanita caesarea) > φ^pi^M (Tuber sinense K. Tao et Liu)、印度塊菌(Tuber indicum Cooke etMassee)、雞油菌(Cantharellus cibarius Fr.) > zF Ei lif (The 1 ephoraganbajun Zang) > Χ 1 1 |if (Clavulinopsis miyabeana(Ito. )Ito.)、褐環(huán)乳牛肝菌(Suillus luteus (L. :Fr.) Gray)、厚環(huán)乳牛肝 菌(Suillus greviller(KL.) sing.)> 變綠紅 (Russulavirescens(schaeff.)Fr.) > 澄蓋鵝膏(Amanita caesarea (Scop :Fr. ) Pers. ex schw.)、玉蕈離裙傘(Lyophyllum shimeji (kawam.)Hongo)、煙色離裙傘(Lyophyllum fumosum(Pers. :Fr.) Orton)等，還有 灰花紋鵝膏(Amanita fuliginea Hongo)、亞稀裙11 (Russula subnigricans Hongo)等 極具經(jīng)濟價值的毒菌。但是對其菌種的分離培養(yǎng)一直是一個難題，因其獨具的特性，在現(xiàn)有的技術(shù)條件 下，不能象廣泛栽培的腐生食用菌(如香菇、木耳等)那樣進行分離培養(yǎng)，培養(yǎng)基在其中扮 演了十分重要的角色。目前在外生菌根菌分離和培養(yǎng)的過程中，主要使用的是MMN培養(yǎng)基， 此培養(yǎng)基在培養(yǎng)一些林業(yè)上常用的比較容易培養(yǎng)的菌根菌時，比較適用，但還是有很多經(jīng) 濟價值較高的菌根食用菌在這個培養(yǎng)基上較難以生長，或生長很慢；另外一個培養(yǎng)基就是 腐生菌及其它一些微生物培養(yǎng)中經(jīng)常用到的PDA培養(yǎng)基，但大多數(shù)菌根菌在此培養(yǎng)基上難 以生長；后來人們又將這兩種培養(yǎng)基按一定比例配制，用于菌根菌的培養(yǎng)，使許多菌根菌的 分離與培養(yǎng)的成活率和生長速度得到提高，但菌絲較在MMN上要老化快得多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于菌根食用菌菌種分離和培養(yǎng)的培養(yǎng)基及方法，它 可豐富現(xiàn)有外生菌根菌菌種分離培養(yǎng)的培養(yǎng)基和方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種外生菌根菌菌種分離和培養(yǎng)方法， 其特征在于所述的菌根菌菌種的分離和培養(yǎng)方法包括如下步驟a、將菌根菌的孢子或子 實體組織放入瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌絲體，培養(yǎng)室的溫度為15-25°C，根據(jù)菌絲的生長速度培 養(yǎng)25-35天，直到菌絲體長滿培養(yǎng)基表70-80%，放入1_15°C的冰箱中保存?zhèn)溆?；b、將以上 培養(yǎng)好的菌絲體轉(zhuǎn)入瓊脂培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)⒕z體接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件 為150 180r/min，溫度為20_28°C，濕度65%，培養(yǎng)7_14天，直到培養(yǎng)基顏色透明，并略帶 淡黃色時為止；c、將上述液體培養(yǎng)的菌絲體經(jīng)勻質(zhì)器勻質(zhì)并再次接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到菌絲體的菌絲球直徑達到0. 2-1. 5cm為止；d、將以上培養(yǎng)好的菌絲體放在合適的培養(yǎng) 條件下培養(yǎng)出菇，其出菇培養(yǎng)條件為溫度為20-28°C、光照100-600LUX的培養(yǎng)室內(nèi)靜置培養(yǎng)。我們對菌根菌生長條件的分析，在培養(yǎng)基中加入一些天然的物質(zhì)，用于菌根菌的 培養(yǎng)，使其分離成活率及轉(zhuǎn)管成活率得到大的提高，并成功培育出子實體。使用時，本發(fā)明 的方法經(jīng)多種菌根食用菌菌種的分離和幾個牛肝菌菌種的培養(yǎng)實驗表明，是一種操作簡單 有效，效率高的方法，很適宜于在外生菌根菌菌種的分離、生理生化及子實體出菇試驗研 究過程中推廣應(yīng)用，具有較高的應(yīng)用價值，其分離成活率由用現(xiàn)有技術(shù)的20-30%提高到 90% -100%以上，部分菌根菌還可形成子實體。


圖1為分離培養(yǎng)的美味牛肝菌菌絲體效果2為本發(fā)明培育出的美味牛肝菌子實體效果圖
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的描述。本發(fā)明一種外生菌根菌菌種的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于所述的外生菌根菌 菌種的分離和培養(yǎng)方法包括如下步驟a、將菌根菌的孢子或子實體組織放入瓊脂培養(yǎng)基中 培養(yǎng)菌絲體，其中瓊脂培養(yǎng)基組成如下=MgSo4 · 7Η20，0· 13 0. 2g ；KH2Po4,0. 4 0. 65g ； Cacl2,0. 03 0. 07g ；酒石酸銨，0. 51 1. Og ；維生素B1,80 200 μ g ；Fecl3 ·6Η20，0· 012 0. 036g ；葡萄糖，10 30g ；杉木根煮汁，300 380mL ；馬鈴薯煮汁，200 450mL ；瓊脂 條，15 20g ；補蒸餾水至lOOOmL，pH5. 1 5. 8 ；b、將以上培養(yǎng)好的菌絲轉(zhuǎn)入瓊脂培養(yǎng)基 中培養(yǎng)或?qū)⒕z體接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中液體培養(yǎng)基組成如下檸檬酸，0. 5 2g ； KH2PO4,0. 5 2g ；MgSO4 · 7Η20，0· 5 2g ；CaCl2, 30 80mg ；FeCl3 · 6H20, 30 80mg ；礦物 質(zhì)混合液，5 15mL ；維生素混合液，5 15mL，蒸餾水，IOOOmL ；pH 5 6。其中礦物質(zhì)混 合液組成ZnSO4 · 7H20, 300mg ；NiSO4 · 6H20, 200mg ；CuSO4 · 5H20, IOOmg ；MnS04 · 5H20, 50mg ； CoS04 WH2OJOmg ；蒸餾水，IOOOmL ；維生素混合液組成維生素Bl，300mg ；煙酸，5mg ；葉酸， 3mg ；生物素，5mg ；鹽酸吡哆醇，0. 5mg ；硫酸腺嘌呤，3mg ；氯化膽堿，3mg ；蒸餾水IOOOmL ；C、 將上述培養(yǎng)的菌絲體經(jīng)勻質(zhì)器勻質(zhì)并再次接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到菌絲體的菌絲球 直徑達到0. 2-1. 5cm為止；d、將以上培養(yǎng)好的菌絲體放在培養(yǎng)室培養(yǎng)出菇，a步驟中，將 菌根菌的孢子或子實體組織放在瓊脂培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)室中培養(yǎng)，直到長出菌絲球直徑 達到0. 2-1. 5cm的菌絲體，培養(yǎng)室的溫度為15-25°C，菌絲的生長速度為25-35天，然后放 入1-15°C的冰箱中保存?zhèn)溆?。b步驟中，具體為將配制好的瓊脂培養(yǎng)基20 50mL、液體培 養(yǎng)基約IOOmL分別裝入容量為250mL的三角瓶中，用一層透氣性封瓶膜，外加2層報紙封 口，并用橡皮筋扎緊，1 X IO5Pa滅菌30min，將前述培養(yǎng)好的菌根菌菌絲體用手術(shù)刀切割成 5mmX 5mm的菌絲塊，將2個接種塊分別接入裝有以上瓊脂培養(yǎng)基的三角瓶中，接種好菌種 的瓊脂培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室中培養(yǎng)；每個液體培養(yǎng)基三角瓶中接入10個接種塊，接種好菌種 的液體培養(yǎng)基放入到往返式搖床上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為150 180r/min，溫度為20-28°C濕度 65%，培養(yǎng)7-14天。c步驟中，將菌絲體勻質(zhì)并接入與b步驟中相同的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為為溫度20-28°C、濕度65%，轉(zhuǎn)速150-180轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)7_21天，直到菌絲球 直徑達到0. 2-1. 5cm左右為止。d步驟中，將培養(yǎng)好的菌絲球放在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)出 菇，其出菇培養(yǎng)條件為溫度為20-28°C、光照100-600LUX的培養(yǎng)室內(nèi)靜置培養(yǎng)。本發(fā)明者在試驗調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)，在松杉針闊混交林中，牛肝菌分布較多，固在牛 肝菌菌絲的分離與培養(yǎng)過程中，加入了杉木根系的煮液，設(shè)計了 PCA瓊脂培養(yǎng)基，牛肝菌在 PCA瓊脂培養(yǎng)基上獲得了很高的分離成活率，而且能形成比其它培養(yǎng)基多得多的原基，并能 部分形成子實體。還針對菌根菌類不能分解纖維素等多糖，但是能利用淀粉的營養(yǎng)特點，設(shè) 計培養(yǎng)基時，加入一定量的馬鈴薯汁，取得較好的效果。我們根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)發(fā)明設(shè)計了這樣 一種菌種分離和培養(yǎng)的方法。實施例1美味牛肝菌的分離和培養(yǎng)方法具體操作步驟如下a、將美味牛肝菌的孢子或子實體組織放入瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng) 菌絲體(見圖1)，瓊脂培養(yǎng)基組成如下=MgSo4 · 7Η20，0· 2g ；KH2Po4,0. 6g ；Cacl2,0. 05g ；酒 石酸銨，0. 8g ；維生素B1,150 μ g ；Fecl3 · 6H20，0. 02g ；葡萄糖，20g ；杉木根煮汁，300mL ；馬 鈴薯煮汁，300mL ；瓊脂條，20g ；補蒸餾水至lOOOmL，pH5. 5 ；培養(yǎng)室的溫度為23°C，培養(yǎng)35 天，菌絲體長滿培養(yǎng)基表面80%時，放入5°C的冰箱中保存?zhèn)溆?；b、將以上培養(yǎng)好的菌絲 體轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基組成如下檸檬酸，Ig ；KH2PO4, Ig ；MgSO4 · 7H20, Ig ； CaCl2, 50mg ；FeCl3 · 6H20, 50mg ；礦物質(zhì)混合液，IOmL ；維生素混合液，10mL，蒸餾水，IOOOmL ； PH 5.5 ;c、將上述液體培養(yǎng)的菌絲體經(jīng)勻質(zhì)器勻質(zhì)并再次接入上述液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直 到菌絲體的菌絲球直徑達到0. 8cm左右為止；d、將以上培養(yǎng)好的菌絲體放在合適的培養(yǎng)條 件下培養(yǎng)出菇，其合適的出菇培養(yǎng)條件為溫度為25°C、光照400LUX的培養(yǎng)室內(nèi)靜置培養(yǎng)。結(jié)果1 :7天后在接種塊上有大量的原基發(fā)生，15天-30天間在一個三角瓶內(nèi)有子 實體形成(見圖幻，子實體周圍分泌有大量的褐色色素，其中一個子實體有12mm高，后經(jīng)過 繼續(xù)培養(yǎng)，25天時在此三角瓶中又有一個子實體形成，長入培養(yǎng)基中，發(fā)育成畸形。子實體 發(fā)育首先粘膠狀，軟質(zhì)，細針管狀，透明，后轉(zhuǎn)成乳白色原基，周圍有白色水珠，進而分泌褐 色素，條件不滿足時則停止發(fā)育，轉(zhuǎn)成黃色，并硬化，條件合適時發(fā)育成子實體，子實體菌蓋 灰白色，菌柄黃白色，基部膨大，基部周圍色素較濃。結(jié)果2 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)靜置培養(yǎng)7天時，在培養(yǎng)基的表面有白色菌絲長出，15 天后，發(fā)現(xiàn)有原基形成，頂部膨大狀。母株YNB200現(xiàn)保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心上海食用菌保藏分中心。
權(quán)利要求
1.一種菌根食用菌菌種的分離培養(yǎng)方法，其特征在于所述的菌根食用菌菌種的分離 培養(yǎng)方法包括如下步驟a、將目的菌根菌的孢子或子實體組織放入瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌絲 體；b、將以上培養(yǎng)好的菌絲轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中培養(yǎng)或?qū)傊z體接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；C、 將上述液體培養(yǎng)的菌絲體經(jīng)勻質(zhì)器勻質(zhì)并再次接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到菌絲體的菌絲 球直徑達到0. 2-1. 5cm為止；d、將以上培養(yǎng)好的菌絲體放在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)出菇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種菌根食用菌菌種的分離培養(yǎng)方法，其特征在于所述 步驟a中的瓊脂培養(yǎng)基組成如下=MgSo4 · 7Η20，0· 13 0. 2g ；KH2Po4,0. 4 0. 65g ；Cacl2, 0. 03 0. 07g ；酒石酸銨，0. 1 1. Og ；維生素 B1,80 200 μ g ；Fecl3 · 6Η20，0· 012 0. 036g ；葡萄糖，10 30g ；杉木根煮汁，300 380mL ；馬鈴薯汁，200 450mL ；瓊脂條， 15 20g ；補蒸溜水至 IOOOmL, ρΗ5· 1 5. 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種菌根食用菌菌種的分離培養(yǎng)方法，其特征在于b步驟和 d步驟中，將培養(yǎng)好的瓊脂培養(yǎng)基上的菌絲體和菌絲球放在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)出菇，其 出菇培養(yǎng)條件為溫度為20-28°C、光照100-600LUX。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種菌根食用菌菌種的分離培養(yǎng)方法，其特征在于所述的 杉木根煮汁為17克鮮根加水IOOOmL煮沸1小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種菌根食用菌菌種的分離與培養(yǎng)方法，其特征為所述的菌根食用菌菌種的分離培養(yǎng)方法包括如下步驟a、將菌根菌的孢子或子實體組織放入瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌絲體；b、將以上培養(yǎng)好的菌絲轉(zhuǎn)入瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)或?qū)傊z體接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；c、將上述液體培養(yǎng)的菌絲體經(jīng)勻質(zhì)器勻質(zhì)并再次接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到菌絲體的菌絲球直徑達到0.2-1.5cm為止；d、將以上培養(yǎng)好的菌絲體放在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)出菇。本發(fā)明的方法經(jīng)多種菌根食用菌菌種的分離培養(yǎng)實驗表明，是一種操作簡單有效，效率高的方法，是一個很好的培養(yǎng)基，很適宜于在大量外生菌根菌菌種的分離培養(yǎng)中推廣應(yīng)用，具有顯著的經(jīng)濟效益。
文檔編號A01G1/04GK102106234SQ200910247490
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日
發(fā)明者付紹春, 尚曉冬, 張美彥, 譚琦 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院