專利名稱：一種細(xì)菌群相同步培養(yǎng)的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)菌群相的同步培養(yǎng)方法和直接藥敏試 驗(yàn)結(jié)果解釋說明和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)界定設(shè)置及試劑盒。
背景技術(shù)：
臨床細(xì)菌培養(yǎng)是醫(yī)院里常用的一種臨床細(xì)菌病原(因)學(xué)檢查方法，即用人工的 辦法提供細(xì)菌生長所必需的營養(yǎng)和環(huán)境，使人體中的臨床致病菌在專門的培養(yǎng)基中繁殖， 然后根據(jù)菌落的形態(tài)，生長特性，對(duì)營養(yǎng)的特殊需求和指示劑的變化等生物學(xué)特點(diǎn)來判斷 細(xì)菌類別，對(duì)細(xì)菌種屬做出鑒定，指導(dǎo)臨床用藥，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。近年來，由于廣泛使用抗生素，逐漸導(dǎo)致耐藥菌株不斷出現(xiàn)。某些嚴(yán)重感染依經(jīng)驗(yàn) 療法使用抗菌藥物不當(dāng)導(dǎo)致致病菌耐藥，延誤治療時(shí)機(jī)，或因盲目追求大劑量治療而造成 藥物中毒。此外，長期濫用抗菌藥物，往往引起菌群失調(diào)癥，給臨床治療帶來嚴(yán)重困難，特別 是廣泛濫用抗菌藥物導(dǎo)致臨床致病菌出現(xiàn)了多層次的變異，如廣泛多重耐藥、種群變異等 及復(fù)數(shù)菌的聯(lián)合致病情形。所以當(dāng)機(jī)體任何一個(gè)部位有感染時(shí)，除了準(zhǔn)確地培養(yǎng)出導(dǎo)致感 染的細(xì)菌以外，還要針對(duì)這個(gè)細(xì)菌做出抗生素敏感實(shí)驗(yàn)，以便準(zhǔn)確地篩選有效的抗生素，提 示所需治療時(shí)日，幫助臨床醫(yī)生選用最佳藥物，還可以進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，了解耐藥菌株的 流行情況，為抗菌藥物的社會(huì)應(yīng)用提供有關(guān)參考信息。當(dāng)前臨床常用的細(xì)菌培養(yǎng)方法，絕大部分是高選擇性需氧菌類培養(yǎng)/或是單一細(xì) 菌培養(yǎng)的方法，如進(jìn)行單一需氧菌類(aerobe)、單一厭氧菌類(anaerobe)、單一細(xì)菌L型類 (bacteria L-form)、其他細(xì)菌類的培養(yǎng)，然后逐一進(jìn)行鑒定后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。臨床醫(yī)學(xué)各科在理論知識(shí)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)上，對(duì)臨床致病菌包括需氧菌類、厭氧菌類、 細(xì)菌L型類等既可單一感染致病，又能混合感染致病的現(xiàn)象，普遍缺乏客觀真實(shí)的認(rèn)識(shí)和 理解。國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)方法仍然是單一病菌為主的培養(yǎng)方法，4類細(xì)菌分別由醫(yī)師申請(qǐng)單獨(dú) 培養(yǎng)。因而，當(dāng)碰到疑難感染病因培養(yǎng)時(shí)，需開具4個(gè)申請(qǐng)單分別獨(dú)立申請(qǐng)。尚無全貌查找 致病菌的概念，是臨床細(xì)菌培養(yǎng)陽性檢出率過低，影響細(xì)菌培養(yǎng)作為感染病臨床達(dá)到“循證 診、治”的重要原因，臨床上出現(xiàn)難診、難治的感染病例，時(shí)時(shí)發(fā)生。目前細(xì)菌培養(yǎng)的缺陷存在以下幾點(diǎn)1、采樣量大以血樣為例，每一次培養(yǎng)需用檢材5-10毫升血液，若同時(shí)做4類細(xì)菌 培養(yǎng)，需抽血20-40毫升，許多病人不愿接受，特別是新生兒感染病的細(xì)菌培養(yǎng)；2、細(xì)菌培養(yǎng)報(bào)告時(shí)間周期長，7天才能出結(jié)果；藥敏報(bào)告需72小時(shí)；3、陽性檢出率低，需氧菌類培養(yǎng)陽性檢出率小于13% ；4、忽略了臨床病菌群相混合感染是臨床致病菌重要的客觀現(xiàn)象，又忽略了臨床致 病菌不斷變異的實(shí)際狀態(tài)。5、采用先培養(yǎng)需氧菌如無生長，再培養(yǎng)厭氧菌，如無生長再培養(yǎng)其他細(xì)菌，耽誤救 治時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有細(xì)菌培養(yǎng)的上述缺陷，依據(jù)細(xì)菌易于混合感染及不斷變異的特性，提供一種用于細(xì)菌群相同步培養(yǎng)的試劑盒。本發(fā)明所述用于細(xì)菌群相同步培養(yǎng)的試劑盒包含需氧菌類培養(yǎng)增殖液、厭氧菌 類培養(yǎng)增殖液、細(xì)菌L型類培養(yǎng)增殖液、細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌類培養(yǎng)增殖液。本發(fā)明所述細(xì)菌群相是指將細(xì)菌分成需氧菌類、厭氧菌類、細(xì)菌L型類、細(xì)胞內(nèi)細(xì) 菌類等四類，同步培養(yǎng)的每一類細(xì)菌即為一類細(xì)菌群相。本發(fā)明所述需氧菌類培養(yǎng)增殖液是指適宜于培養(yǎng)需氧菌類如銅綠假單胞菌、埃希 大腸桿菌、不動(dòng)桿菌、葡萄球菌類等的培養(yǎng)液。本發(fā)明所述厭氧菌類培養(yǎng)增殖液是指適宜于培養(yǎng)厭氧菌類如具核梭桿菌、延展消 化鏈球菌、索形梭菌等的培養(yǎng)液。本發(fā)明所述細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌類培養(yǎng)增殖液是指適宜于培養(yǎng)胞內(nèi)細(xì)菌類如布魯桿菌、傷 寒桿菌、腦膜炎球菌、支原體等的培養(yǎng)液。本發(fā)明所述細(xì)菌L型類培養(yǎng)增殖液是指適宜于培養(yǎng)細(xì)菌L型類如細(xì)菌不穩(wěn)定L型 和細(xì)菌穩(wěn)定L型的培養(yǎng)液。優(yōu)選地，所述需氧菌類培養(yǎng)增殖液的制備方法為新鮮牛肉湯1000毫升加蛋白胨 10-15克、氯化鈉3. 5-5克加熱溶解，調(diào)PH至7. 2-7. 8過濾至澄清，118-121 °C 20-30分鐘滅
菌備用。優(yōu)選地，所述厭氧菌類培養(yǎng)增殖液的制備方法為新鮮牛肉湯1000毫升加蛋白胨 10-17克、酵母浸膏3-5克、葡萄糖5-7克、可溶性淀粉1-2克、氯化鈉4_5克、醋酸鈉2_3 克、鹽酸半胱氨酸0. 5-1. 0克加熱溶解，調(diào)PH至7. 4-7. 8，100-112°C 20-30分鐘滅菌備用。優(yōu)選地，所述細(xì)菌L型類培養(yǎng)增殖液的制備方法為新鮮牛肉湯1000毫升，加入氯 化鈉45-50克、蛋白胨10-15克、加熱溶解，調(diào)PH至7. 2-7. 8，過濾至澄清，118_121 °C壓力下 20-30分鐘滅菌備用。優(yōu)選地，所述細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌類培養(yǎng)增殖液的制備方法為新鮮牛肉湯1000毫升，力口 入蛋白胨10-17克，氯化鈉3. 5-5克，膽鹽0. 5-1. 5克，加熱溶解，調(diào)PH至7. 2-7. 8，過濾至 澄清，118-121°C 20-30分鐘滅菌備用。本發(fā)明還提供一種細(xì)菌群相的同步培養(yǎng)方法，將待檢樣本分別注入需氧菌類培養(yǎng) 增殖液、厭氧菌類培養(yǎng)增殖液、細(xì)菌L型類培養(yǎng)增殖液、細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌類培養(yǎng)增殖液中混勻， 35°C培育6-8小時(shí)。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述同步培養(yǎng)方法的需氧菌類培養(yǎng)增殖液的制備方法為新鮮 牛肉湯1000毫升加蛋白胨10-15克、氯化鈉5-7克加熱溶解，調(diào)PH至7. 2-7. 8過濾至澄清， 118-121 °C 20-30分鐘滅菌備用。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述同步培養(yǎng)方法的厭氧菌類培養(yǎng)增殖液的制備方法為新鮮 牛肉湯1000毫升加蛋白胨10-17克、酵母浸膏1. 5-3克、葡萄糖5_7克、可溶性淀粉1_2克、 氯化鈉3. 5-5克、醋酸鈉2-3克、鹽酸半胱氨酸0. 5-1. 0克加熱溶解，過濾至澄清，調(diào)PH至 7. 2-7. 6，118-112°C滅菌 20-30 分鐘備用。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述同步培養(yǎng)方法的細(xì)菌L型類培養(yǎng)增殖液的制備方法為新 鮮牛肉湯1000毫升，加入氯化鈉45-50克、蛋白胨10-15克、加熱溶解，調(diào)PH至7. 2-7. 8，過濾至澄清，118-121°C滅菌20-30分鐘備用。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述同步培養(yǎng)方法的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌類培養(yǎng)增殖液的制備方法為新鮮牛肉湯1000毫升，加入蛋白胨10-15克，氯化鈉3-5克，膽鹽0. 5-1. 0克，加熱溶解，調(diào) PH至7. 2-7. 8，過濾至澄清，118-121°C下滅菌20-30分鐘備用。所述同步培養(yǎng)方法還包含以下步驟觀測接種了樣品的四種培養(yǎng)增殖液，如有混 濁，在無菌狀態(tài)下取混濁的菌液進(jìn)行細(xì)菌群相的直接藥敏試驗(yàn)。所述細(xì)菌群相直接藥敏試驗(yàn)方法包括擴(kuò)散法。更優(yōu)選地，所述細(xì)菌群相直接藥敏試驗(yàn)步驟為取混濁的菌液轉(zhuǎn)種于對(duì)應(yīng)的藥敏測 試培養(yǎng)基，貼敷抗菌藥敏紙片，在35°C培育16-18小時(shí)。所述細(xì)菌群相直接藥敏試驗(yàn)方法 24小時(shí)藥敏結(jié)果報(bào)告達(dá)到陽性檢出結(jié)的果60%以上。傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)方法是將細(xì)菌分離成純種，進(jìn)行試驗(yàn)，若抑菌環(huán)內(nèi)出現(xiàn)菌落，即要 重新進(jìn)行重新分離成純種，重新進(jìn)行藥敏測試。本發(fā)明所述細(xì)菌群相的直接藥敏試驗(yàn)是由不同的細(xì)菌種、型混合狀態(tài)下，對(duì)不同 的抗生素有不同的抗藥譜所構(gòu)成，其抑菌環(huán)直徑按測量實(shí)際比對(duì)借鑒WHO K-B法的標(biāo)準(zhǔn)報(bào) 告之。當(dāng)全部的細(xì)菌出現(xiàn)非同一的生長/或耐藥狀態(tài)時(shí)，除借鑒使用WHO推薦的K-B法常 規(guī)解釋標(biāo)準(zhǔn)外，有下列任何情況之一，均予以補(bǔ)充解釋說明和技術(shù)界定標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置如下①、當(dāng)復(fù)數(shù)菌類抑菌環(huán)的直徑符合同一敏感(S)，報(bào)告為S此種藥物臨床可 使用7日；當(dāng)此種藥物符合中敏(I)，報(bào)告為I:此種藥物臨床可使用3-4日。②、當(dāng)復(fù)數(shù)菌類抑菌環(huán)直徑達(dá)到S，但抑菌環(huán)內(nèi)仍有少數(shù)細(xì)菌生長/或出現(xiàn)淺淡 抑菌環(huán)狀分層現(xiàn)象，可報(bào)告為SA:此藥臨床可使用5天；當(dāng)抑菌環(huán)內(nèi)有較多菌落生長/或 有多層抑菌環(huán)現(xiàn)象，可報(bào)告為SAA此種藥物結(jié)合臨床狀況可用于觀察治療3天。③、當(dāng)復(fù)數(shù)菌類抑菌環(huán)直徑達(dá)到I，但抑菌環(huán)內(nèi)仍有少數(shù)細(xì)菌生長/或出現(xiàn)淺淡 抑菌環(huán)狀分層現(xiàn)象，可報(bào)告為ΙΔ:結(jié)合臨床實(shí)際狀況，此藥物可用于治療2-3天。當(dāng)抑菌 環(huán)內(nèi)有較多菌落生長/或有多層抑菌環(huán)現(xiàn)象，可報(bào)告為ΠΔΔ結(jié)合臨床實(shí)際狀況，在嚴(yán)密 觀察下，此種藥物可用于臨床觀察治療1-2天。④、當(dāng)某藥物紙片周圍無抑菌環(huán)(R)或不足中敏以上結(jié)果時(shí)，應(yīng)報(bào)告為R臨床 不能用于該病例治療；若藥物紙片周圍出現(xiàn)濃厚菌落，或多層較厚抑菌環(huán)時(shí)(僅在藥物溶 質(zhì)的正常擴(kuò)散區(qū)范圍內(nèi))，此種藥物報(bào)告為Rx(疑似藥物依賴菌狀態(tài))此藥禁用于該例 病人。⑤、當(dāng)全部試驗(yàn)藥物均無抑菌環(huán)出現(xiàn)，考慮選新的藥物品種重新測試，另行報(bào)告。⑥、所述的細(xì)菌群相直接藥敏試驗(yàn)方法，其特征在于，細(xì)菌L型類群相直接藥敏測 試結(jié)果的解釋說明和技術(shù)界定標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置如下當(dāng)細(xì)菌L型類直接藥敏測試平板上可肉眼觀察到抑菌環(huán)，按K-B法常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)測量 判定并報(bào)告結(jié)果；當(dāng)全部的細(xì)菌出現(xiàn)非同一的生長/或耐藥狀態(tài)時(shí)，除借鑒使用WHO推薦的 K-B法常規(guī)解釋標(biāo)準(zhǔn)外，有上述①；②；③；④；⑤任何情況，均按其解釋說明和技術(shù)界定標(biāo) 準(zhǔn)設(shè)置報(bào)告執(zhí)行。⑦、當(dāng)細(xì)菌L型類直接藥敏測試平板上肉眼不能直接觀察到抑菌環(huán)時(shí)，將藥敏試 驗(yàn)平板放置于藥敏測試顯微鏡的平臺(tái)上，用物鏡(IX)、目鏡(5X/10X)觀察測量，按下式 計(jì)算抑菌環(huán)直徑
抑菌環(huán)直徑(mm)= 2L+6. 35 = 2X0. 05XN+6. 35注2L ( 二倍所測物體長度)=2 X 0. 05N ； 0.05-測微尺分劃板上每格相當(dāng)長度(mm)；N-所測物體在測微尺分劃板上所占格數(shù)(長度)各種抗菌藥物敏感測試結(jié)果判定試用標(biāo)準(zhǔn)敏感S(抑菌環(huán)直徑)彡IOmm ；可使用該種藥物治療5-7天；中敏I(抑菌環(huán)直徑)=8. Omm-9. 8mm ；可使用該種藥物治療3_5天。耐藥R(抑菌環(huán)直徑)彡7. 8mm ；該種藥物不宜用于該病例治療。當(dāng)在顯微鏡下測量抑菌環(huán)并照上述公式計(jì)算出抑菌環(huán)直徑，按標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)敏感程度 的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)(或臨床可使用天數(shù))報(bào)告之。⑧、當(dāng)測定結(jié)果符合敏感，應(yīng)報(bào)告為S:此藥物可用于臨床治療5-7天；當(dāng)抑菌環(huán) 直徑數(shù)據(jù)符合敏感，但環(huán)內(nèi)仍有少數(shù)細(xì)菌顆粒生長，此種情況應(yīng)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)界定為S Δ:可使 用該種藥物臨床治療3-5天；當(dāng)抑菌環(huán)內(nèi)有較多細(xì)菌顆粒(抑菌環(huán)外有更多細(xì)菌顆粒)時(shí)， 應(yīng)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)界定為SAA可結(jié)合臨床實(shí)際情況使用該種藥物觀察治療1-3天。⑨、當(dāng)測定結(jié)果符合中敏，應(yīng)技術(shù)界定報(bào)告為I此種藥物可用于臨床治療3-5 天；當(dāng)抑菌環(huán)內(nèi)仍有少數(shù)細(xì)菌顆粒生長，此種情況技術(shù)界定為ΙΔ:可使用該種藥物臨床治 療1-3天；當(dāng)抑菌環(huán)內(nèi)有較多細(xì)菌顆粒(抑菌環(huán)外有更多細(xì)菌顆粒)時(shí)，技術(shù)界定為ΙΔΔ
可結(jié)合臨床實(shí)際情況使用該種藥物臨床觀察治療1-2天。⑩、當(dāng)測定結(jié)果符合耐藥，應(yīng)報(bào)告為R。此藥不適宜該患者使用。當(dāng)測定結(jié)果符 合耐藥，且其藥物紙片周圍出現(xiàn)生長濃厚菌苔時(shí)/或多層抑菌環(huán)時(shí)(僅在藥物溶質(zhì)的正常 擴(kuò)散區(qū)范圍內(nèi)，此種情況疑似藥物依賴菌出現(xiàn)的狀態(tài))，應(yīng)報(bào)告為RX:此藥物禁用于該例 病人。當(dāng)全部試驗(yàn)藥物均無抑菌環(huán)出現(xiàn)，考慮選新的藥物品種重新測試，另行報(bào)告。本發(fā)明所述方法綜合所獲得的全部數(shù)據(jù)，篩選對(duì)4類細(xì)菌都敏感的藥物，并對(duì)臨 床用藥時(shí)日判定出建議報(bào)告，以單品種、足劑量、由靜脈給藥進(jìn)行治療，收到治療的顯著效 果，為臨床醫(yī)師動(dòng)態(tài)循證治療決策提供指導(dǎo)數(shù)據(jù)。本發(fā)明可用于血、骨髓、中段尿、腹水、胸水、生殖系分泌物(男精液、前列腺液；女 陰道炎、子宮內(nèi)膜炎等)、腦脊液、眼耳鼻喉分泌物、其它穿刺液(羊膜液、透析外排液、心包 液、后穹窿、滑膜液等)、膿及術(shù)口、插管、引流分泌物、痰及呼吸道灌洗液或分泌物的細(xì)菌群 相微量同步培養(yǎng)。與常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明所述方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1、僅使用常規(guī)用量1-2%的待檢樣品；2、陽性檢出率高達(dá)彡95%以上，而常規(guī)培養(yǎng)法僅有< 13% ；3、細(xì)菌培養(yǎng)6-8小時(shí)即可判斷結(jié)果，24小時(shí)獲得致病菌細(xì)菌群相藥物敏感數(shù)據(jù)， 常規(guī)法需72小時(shí)或更長；4、對(duì)全貌復(fù)數(shù)菌設(shè)置了需氧菌類、厭氧菌類、細(xì)菌L型類、其它菌類，可反映病菌 群相混合感染及不斷變異的實(shí)際狀態(tài)。5、比較全貌地培養(yǎng)出了感染致病菌群相并篩選出同一敏感的藥物，為臨床醫(yī)師抗 感染循證診斷、治療及動(dòng)態(tài)臨床循證決策提供了新的措施。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明公開了一種細(xì)菌群相同步培養(yǎng)的方法及試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒 本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技 術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述方法及試劑盒已經(jīng)通 過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所 述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明。本發(fā)明所述用于細(xì)菌群相同步培養(yǎng)的試劑盒，包含需氧菌類培養(yǎng)增殖液、厭氧菌 類培養(yǎng)增殖液、細(xì)菌L型類培養(yǎng)增殖液、細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌類培養(yǎng)增殖液。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它培養(yǎng)增殖液包括需氧菌類培養(yǎng)增殖液牛肉膏3克、氯化鈉5克蛋白胨10克蒸餾水1000ml，溶解 調(diào)PH7. 4-7. 6，過濾分裝，經(jīng)121°C滅菌15分鐘即成。厭氧菌類培養(yǎng)增殖液馬肉或牛肉渣適量、肉浸湯適量，將做肉浸湯剩下的肉渣 2-3克裝入試管中，再加入PH7. 6肉浸湯5ml，121°C滅菌30分鐘，備用。細(xì)菌L型類培養(yǎng)增殖液牛肉浸液1000ml、氯化鈉40_50克\蛋白胨20克，溶解 調(diào)PH7. 4-7. 6，分裝至小三角瓶中15ml，經(jīng)121°C滅菌15分鐘即成。細(xì)胞內(nèi)菌類培養(yǎng)增殖液胨或多價(jià)胨5克、碳酸鈣10克、蒸餾水1000ml，膽鹽1克、 硫代硫酸鈉30克，混勻分裝至試管各10ml，113°C滅菌10分鐘備用；臨用前每管加入0. 2ml 碘液，該碘液由碘6克、碘化鉀5克溶于20ml蒸餾水儲(chǔ)于褐色瓶中，混合后接種標(biāo)本。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可選擇其它的適宜于培養(yǎng)需氧菌類、厭氧菌類、細(xì)菌L型類、細(xì) 胞內(nèi)菌類的培養(yǎng)液。以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說明。實(shí)施例1 制備本發(fā)明所述試劑盒(簡稱AlNBC試劑盒)①.A(需氧菌類aerobe group, Α)培養(yǎng)增殖液-新鮮牛肉湯1000毫升加蛋白胨 10-15克、氯化鈉3. 5-5克加熱溶解，調(diào)PH至7. 2-7. 8過濾至澄清，分裝到潔凈可固定、密封 的試劑瓶中，118-121°C壓力下20-30分鐘滅菌，監(jiān)察備用。②.An (厭氧菌類anaerobe group, An)培養(yǎng)增殖液-新鮮牛肉湯1000毫升加蛋 白胨10-17克、酵母浸膏1. 5-3克、葡萄糖5-7克、可溶性淀粉1_2克、氯化鈉3. 5-5克、醋 酸鈉2-3克、鹽酸半胱氨酸0. 5-1克加熱溶解，調(diào)PH至7. 2-7. 6，分裝至潔凈可固定、密封的 試劑瓶中，100-112°C 20-30分鐘滅菌，監(jiān)察備用。③.B (細(xì)菌L型類bacteria L-form group, B)培養(yǎng)增殖液-新鮮牛肉湯1000毫 升，加入氯化鈉45-50克、蛋白胨10-15克、加熱溶解，調(diào)PH至7. 2-7. 8，過濾至澄清，分裝至 潔凈可固定、密封的試劑瓶中，118-121°C 20-30分鐘滅菌，監(jiān)察備用。④.C(細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌類cell bacteria group，C)其它菌增殖培養(yǎng)液(按需要選擇適 宜培養(yǎng)基)。新鮮牛肉湯1000毫升，加入蛋白胨10-17克，氯化鈉3. 5-5克，膽鹽0. 5-1. 5克， 加熱溶解，調(diào)PH至7. 2-7.8，過濾至澄清，分裝至潔凈可固定、密封的試劑瓶中，118-1211 20-30分鐘滅菌，監(jiān)察備用。根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果選擇藥敏測試系統(tǒng)如需氧菌類選擇MHA藥敏測試瓊脂、厭氧 菌藥敏測試血瓊脂、細(xì)菌L型藥敏測試培養(yǎng)基，適宜于其他類細(xì)菌的藥敏測試培養(yǎng)基，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。實(shí)施例2 用本發(fā)明所述方法進(jìn)行臨床樣本的細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)1、以無菌手續(xù)將血液樣本，分別注入實(shí)施例1制備的A. /An. /B. /C.瓶中各2滴， 立即混勻；各瓶穿刺孔上用無菌棉球遮蓋、固定，放入35°C孵箱培育6-8小時(shí)，觀察結(jié)果。 2、如有混濁，以無菌手續(xù)分別取混濁的A/或An/或B/或C3滴菌液，立即分別轉(zhuǎn) 種于對(duì)應(yīng)的A/An/B/C.藥敏測試培養(yǎng)基，按類別貼敷抗菌藥物紙片，如A類宜選阿米卡星、 慶大霉素、青霉素、氨芐青霉素、妥布霉素、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢三嗪、紅霉素、氯霉素、 萬古霉素、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、亞胺配能等抗菌藥物紙片貼敷；如An類/B類/C類另外 選擇抗菌藥物品種；當(dāng)A、An、B、C等全部渾濁生長時(shí)，宜選擇同一藥物品種進(jìn)行敏感測試， 便于同一選藥治療，放入35°C孵箱培育16-18小時(shí)，觀察測量結(jié)果。3、.當(dāng)A/An/B/C的藥敏平板上出現(xiàn)肉眼可觀察到抑菌環(huán)時(shí)，利用K-B法制定的“抑 菌環(huán)直徑”測量并判定報(bào)告。如出現(xiàn)其它現(xiàn)象(如抑菌環(huán)內(nèi)尚有生長的菌落或其它現(xiàn)象)則由袁鴻慈的專項(xiàng)解 釋說明和技術(shù)界定標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置及臨床實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)操作進(jìn)行。本發(fā)明所述細(xì)菌群相的直接藥敏試驗(yàn)是由不同的細(xì)菌種、型混合狀態(tài)下，對(duì)不同 的抗生素有不同的抗藥譜所構(gòu)成，其抑菌環(huán)直徑按測量實(shí)際比對(duì)借鑒WHO K-B法的標(biāo)準(zhǔn)報(bào) 告之。當(dāng)全部的細(xì)菌出現(xiàn)非同一的生長/或耐藥狀態(tài)時(shí)，除借鑒使用WHO推薦的K-B法常 規(guī)解釋標(biāo)準(zhǔn)外，有下列任何情況之一，均予以補(bǔ)充解釋說明和技術(shù)界定標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置如下①、當(dāng)復(fù)數(shù)菌類抑菌環(huán)的直徑符合同一敏感(S)，報(bào)告為S此種藥物臨床可 使用7日；當(dāng)此種藥物符合中敏(I)，報(bào)告為I:此種藥物臨床可使用3-4日。②、當(dāng)復(fù)數(shù)菌類抑菌環(huán)直徑達(dá)到S，但抑菌環(huán)內(nèi)仍有少數(shù)細(xì)菌生長/或出現(xiàn)淺淡 抑菌環(huán)狀分層現(xiàn)象，可報(bào)告為SA:此藥臨床可使用5天；當(dāng)抑菌環(huán)內(nèi)有較多菌落生長/或 有多層抑菌環(huán)現(xiàn)象，可報(bào)告為SAA此種藥物結(jié)合臨床狀況可用于觀察治療3天。③、當(dāng)復(fù)數(shù)菌類抑菌環(huán)直徑達(dá)到I，但抑菌環(huán)內(nèi)仍有少數(shù)細(xì)菌生長/或出現(xiàn)淺淡 抑菌環(huán)狀分層現(xiàn)象，可報(bào)告為ΙΔ:結(jié)合臨床實(shí)際狀況，此藥物可用于治療2-3天。當(dāng)抑菌 環(huán)內(nèi)有較多菌落生長/或有多層抑菌環(huán)現(xiàn)象，可報(bào)告為ΠΔΔ結(jié)合臨床實(shí)際狀況，在嚴(yán)密 觀察下，此種藥物可用于臨床觀察治療1-2天。④、當(dāng)某藥物紙片周圍無抑菌環(huán)(R)或不足中敏以上結(jié)果時(shí)，應(yīng)報(bào)告為R臨床 不能用于該病例治療；若藥物紙片周圍出現(xiàn)濃厚菌落，或多層較厚抑菌環(huán)時(shí)(僅在藥物溶 質(zhì)的正常擴(kuò)散區(qū)范圍內(nèi))，此藥物報(bào)告為Rx(疑似藥物依賴菌狀態(tài))此藥禁用于該例病 人。⑤、當(dāng)全部試驗(yàn)藥物均無抑菌環(huán)出現(xiàn)，考慮選新的藥物品種重新測試，另行報(bào)告。⑥、所述的細(xì)菌群相直接藥敏試驗(yàn)方法，其特征在于，細(xì)菌L型類群相直接藥敏測 試結(jié)果的解釋說明和技術(shù)界定標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置如下當(dāng)細(xì)菌L型類直接藥敏測試平板上可肉眼觀察到抑菌環(huán)，按K-B法常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)測量 判定并報(bào)告結(jié)果；當(dāng)全部的細(xì)菌出現(xiàn)非同一的生長/或耐藥狀態(tài)時(shí)，除借鑒使用WHO推薦的 K-B法常規(guī)解釋標(biāo)準(zhǔn)外，有上述①；②；③；④；⑤任何情況，均按其解釋說明和技術(shù)界定標(biāo) 準(zhǔn)設(shè)置報(bào)告執(zhí)行。⑦、當(dāng)細(xì)菌L型類直接藥敏測試平板上肉眼不能直接觀察到抑菌環(huán)時(shí)，將藥敏試驗(yàn)平板放置于藥敏測試顯微鏡的平臺(tái)上，用(物鏡)1X、目鏡5X/10X觀察測量，按下式計(jì) 算抑菌環(huán)直徑抑菌環(huán)直徑(mm)= 2L+6. 35 = 2X0. 05XN+6. 35注2L ( 二倍所測物體長度)=2 X 0. 05N ；0.05-測微尺分劃板上每格相當(dāng)長度(mm)；
N-所測物體在測微尺分劃板上所占格數(shù)(長度)各種抗菌藥物敏感測試結(jié)果判定試用標(biāo)準(zhǔn)敏感S(抑菌環(huán)直徑)彡IOmm ；可使用該種藥物治療5-7天；中敏I(抑菌環(huán)直徑)=8. Omm-9. 8mm ；可使用該種藥物治療3_5天。耐藥R(抑菌環(huán)直徑)彡7. 8mm ；該種藥物不宜用于該病例治療。當(dāng)在顯微鏡下測量抑菌環(huán)并照上述公式計(jì)算出抑菌環(huán)直徑，按標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)敏感程度 的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)(或臨床可使用天數(shù))報(bào)告之。⑧、當(dāng)測定結(jié)果符合敏感，應(yīng)報(bào)告為S:此藥物可用于臨床治療5-7天；當(dāng)抑菌環(huán) 直徑數(shù)據(jù)符合敏感，但環(huán)內(nèi)仍有少數(shù)細(xì)菌顆粒生長，此種情況應(yīng)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)界定為S Δ:可使 用該種藥物臨床治療3-5天；當(dāng)抑菌環(huán)內(nèi)有較多細(xì)菌顆粒(抑菌環(huán)外有更多細(xì)菌顆粒)時(shí)， 應(yīng)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)界定為SAA可結(jié)合臨床實(shí)際情況使用該種藥物觀察治療1-3天。⑨、當(dāng)測定結(jié)果符合中敏，應(yīng)技術(shù)界定報(bào)告為I此種藥物可用于臨床治療3-5 天；當(dāng)抑菌環(huán)內(nèi)仍有少數(shù)細(xì)菌顆粒生長，此種情況技術(shù)界定為ΙΔ:可使用該種藥物臨床治 療1-3天；當(dāng)抑菌環(huán)內(nèi)有較多細(xì)菌顆粒(抑菌環(huán)外有更多細(xì)菌顆粒)時(shí)，技術(shù)界定為ΙΔΔ
可結(jié)合臨床實(shí)際情況使用該種藥物臨床觀察治療1-2天。⑩、當(dāng)測定結(jié)果符合耐藥，應(yīng)報(bào)告為R。此藥不適宜該患者使用。當(dāng)測定結(jié)果符 合耐藥，且其藥物紙片周圍出現(xiàn)生長濃厚菌苔時(shí)/或多層抑菌環(huán)時(shí)(僅在藥物溶質(zhì)的正常 擴(kuò)散區(qū)范圍內(nèi)，此種情況疑似藥物依賴菌出現(xiàn)的狀態(tài))，應(yīng)報(bào)告為RX:此藥物禁用于該例 病人。當(dāng)全部試驗(yàn)藥物均無抑菌環(huán)出現(xiàn)，考慮選新的藥物品種重新測試，另行報(bào)告。本發(fā)明所述細(xì)菌L型類群相，包括細(xì)菌穩(wěn)定L型和細(xì)菌不穩(wěn)定L型。當(dāng)全部試驗(yàn)藥物均無抑菌環(huán)出現(xiàn)，考慮選新的藥物品種重新測試，另行報(bào)告。藥敏結(jié)果報(bào)告及時(shí)間依據(jù)上述藥敏測量數(shù)據(jù)，單品種、足劑量、由靜脈給藥治療 的要求，第24小時(shí)向臨床報(bào)告之，按直接藥敏試驗(yàn)的數(shù)據(jù)選中的敏感藥物實(shí)行治療。實(shí)施例3 本發(fā)明所述方法進(jìn)行未名熱病例臨床樣本的細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)未名熱病例男，1歲7個(gè)月，發(fā)熱38-40°C，經(jīng)系統(tǒng)治療未緩解，轉(zhuǎn)入某兒童醫(yī)院住 院，行血液常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)，培養(yǎng)出銅綠假單胞菌，經(jīng)藥敏測試，對(duì)先鋒5號(hào)敏感，臨床經(jīng)靜脈 輸注用藥31天，無緩解，體溫仍波動(dòng)于38-39°C之間。用本發(fā)明所述方法和試劑盒進(jìn)行血液培養(yǎng)，采頸靜脈血0. 5毫升，以無菌手續(xù)注 入A. An. B. C.各2滴立即混勻，放置35°C孵箱培育6_8小時(shí)，觀察A. An. B.三瓶均有渾濁，結(jié) 果顯示，該未名熱病人應(yīng)為復(fù)數(shù)菌混合感染(需、厭氧菌、細(xì)菌L型混合感染)，即轉(zhuǎn)種于各 相對(duì)應(yīng)的藥敏培養(yǎng)基，分別貼敷藥敏紙片，放置35°C孵箱培育16-18小時(shí)，觀察測量結(jié)果， 如表1 表1、直接藥敏試驗(yàn)測試結(jié)果 注A-需氧菌類；An-厭氧菌類；B-細(xì)菌L型類；S-敏感；I-中度敏感；R-耐藥；CZ-先鋒5號(hào)；C-氯霉素；AN-阿米卡星；TM-妥布霉素；SXT-復(fù)方新諾明；E-紅霉 素；CFP-頭孢哌酮；PIP-氧哌嗪青霉素；CFX-頭孢氨芐；CB-羧芐青霉素；CIP-環(huán)丙沙星； OFL氧氟沙星；P-青霉素；NOR-諾氟沙星；VA-萬古霉素。選用阿米卡星(AN)按患兒體重計(jì)算用藥，第一次由靜脈給藥，1小時(shí)后體溫即下 降至37. 2°C，繼續(xù)用藥六天，體溫完全恢復(fù)正常。出院后隨訪3個(gè)月未復(fù)發(fā)。經(jīng)細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)分離細(xì)菌至純種及細(xì)菌L型回復(fù)成細(xì)菌型并分離至純種，鑒定 為如表2 表2細(xì)菌種群分純分類鑒定結(jié)果 注N-未培養(yǎng)BLU-細(xì)菌不穩(wěn)定L型BLS-細(xì)菌穩(wěn)定L型未名熱/不明原因發(fā)熱(FUO)是細(xì)菌感染為重要的病因，經(jīng)過多年的研究和臨床 實(shí)踐，基本上做到了在不使用解熱鎮(zhèn)痛劑和任何免疫抑制劑參與下，抗感染治療7-12天體 溫恢復(fù)至正常，并經(jīng)隨訪無復(fù)發(fā)的。實(shí)施例4 本發(fā)明所述方法進(jìn)行銀屑病病例臨床樣本的細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)銀屑病(Psoriasis)西醫(yī)曾稱牛皮癬，中醫(yī)稱白庀，是一種病因不清，誘因繁雜， 癥狀具有紅斑、丘疹、鱗屑等慢性、炎癥性、反復(fù)發(fā)作的皮膚病，同一病理過程，臨床不同階 段出現(xiàn)不同表現(xiàn)，臨床分為尋常、膿皰、紅皮病、關(guān)節(jié)病等四型。銀屑病被認(rèn)為是病菌誘發(fā)， 天然免疫功能失調(diào)而長期形成的疾病過程。選擇1992年12月至2000年6月明確診斷為銀屑病的病例，治療全程均經(jīng)血流細(xì) 菌群相同步培養(yǎng)并選敏感藥物治療的病例26例，其中男性12例、女性14例；年齡最大72 歲、最小6歲，平均32. 21歲；患病時(shí)間最長60年、最短4個(gè)月，平均14. 80年；治療時(shí)間最 長 260d、最短 48d，平均 104. 12d。診斷標(biāo)準(zhǔn)入院體檢皮損覆銀白色鱗屑、薄膜現(xiàn)象、出血點(diǎn)(Auspitz’ s征)等癥齊全；或薄膜和出血點(diǎn)現(xiàn)象缺如，皮損僅有銀白色鱗屑，過去曾被診斷為銀屑病，并長期按 銀屑病治療者。治愈標(biāo)準(zhǔn)(1)治愈皮損全部愈合，原皮損部位僅遺留較正常皮膚色澤淺淡的“色素減退 斑”或皮損部位因涂擦外用藥物遺留“色素沉著斑”；(2)好轉(zhuǎn)愈合面積彡95%中止治療；(3)未愈愈合面積彡5%中止治療。以無菌手續(xù)采靜脈血0.5ml同步進(jìn)行需氧菌類(Aerobe group, Α)、厭氧菌類 (anaerobe group, An)、細(xì)菌 L 型類(bacteria L-form group, L)、細(xì)胞內(nèi)菌類(cell bacteria group,C)增殖培養(yǎng)，然后分別按細(xì)菌類群相直接進(jìn)行藥敏測試。培養(yǎng)周期每7_12
天培養(yǎng)一次。依據(jù)藥敏測試結(jié)果，選敏感的抗菌藥物單品種、足劑量由靜脈給藥，住院治療，三 個(gè)月為一個(gè)療程。銀屑病26例，全身性皮損25例，其中特重6例，嚴(yán)重8例，中等6例，較輕6例；結(jié) 果痊愈17例，好轉(zhuǎn)8例，未愈1例。(見表3)好轉(zhuǎn)的病例大多因治療中不能準(zhǔn)確休息或過 分撓抓，遷延治療周期，影響愈合效果，中止治療。表3治療結(jié)果 用細(xì)菌群相同步培養(yǎng)方法和直接藥敏測試技術(shù)，對(duì)患者靜脈血進(jìn)行培養(yǎng)和藥敏測 試，選敏感藥單品種、足劑量由靜脈給藥，3個(gè)月為一個(gè)療程。細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果26例銀屑病患者培養(yǎng)出蠟樣芽孢桿菌、玫瑰微球菌各1株；從細(xì) 菌L型回復(fù)成細(xì)菌型鑒定出蠟樣芽孢桿菌、卡他布蘭漢氏菌、埃希氏大腸桿菌各1株，其 余(357例次)為細(xì)菌穩(wěn)定L型。痊愈17例(65. 38% )，好轉(zhuǎn)8例(30. 77% )，未愈1例 (3. 85% )。從循證醫(yī)學(xué)(Evidenci-based medicine, EBM)出發(fā)，本文26例患者的血流培養(yǎng)結(jié) 果全部同步培養(yǎng)出需氧菌或厭氧菌或缺壁細(xì)菌、胞內(nèi)細(xì)菌等，每例次均作了復(fù)數(shù)菌的直接 藥物敏感試驗(yàn)，選敏感藥物單品種、足劑量由靜脈給藥，收到了比較顯著的治療效果，按期 治愈了 17例(65. 39%)，好轉(zhuǎn)8例(30. 77% )，該學(xué)術(shù)思路和臨床治療措施設(shè)計(jì)及臨床實(shí) 踐過程，符合EBM客觀的實(shí)際要求。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在遵循、不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤 飾也應(yīng)視為在本發(fā)明基礎(chǔ)之上的改進(jìn)與潤飾，屬本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種用于細(xì)菌群相同步培養(yǎng)的試劑盒，包含需氧菌類培養(yǎng)增殖液、厭氧菌類培養(yǎng)增殖液、細(xì)菌L型類培養(yǎng)增殖液、細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌類培養(yǎng)增殖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述需氧菌類培養(yǎng)增殖液的制備方法 為新鮮牛肉湯1000毫升加蛋白胨10-15克、氯化鈉5-7克加熱溶解，調(diào)PH至7. 2-7. 8過 濾至澄清，118-121°C滅菌20-30分鐘備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述厭氧菌類培養(yǎng)增殖液的制備方法 為新鮮牛肉湯1000毫升加蛋白胨10-17克、酵母浸膏1. 5-3克、葡萄糖5-7克、可溶性淀 粉1-2克、氯化鈉3. 5-5克、醋酸鈉2-3克、鹽酸半胱氨酸0. 5-1. 0克加熱溶解，過濾至澄清， 調(diào) PH 至 7. 2-7. 6，118-112°C 滅菌 20-30 分鐘備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述細(xì)菌L型類培養(yǎng)增殖液的制備方 法為新鮮牛肉湯1000毫升，加入氯化鈉45-50克、蛋白胨10-15克、加熱溶解，調(diào)PH至 7. 2-7. 8，過濾至澄清，118-121°C滅菌20-30分鐘備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌類培養(yǎng)增殖液的制備 方法為新鮮牛肉湯1000毫升，加入蛋白胨10-15克，氯化鈉3-5克，膽鹽0. 5-1. 0克，加熱 溶解，調(diào)PH至7. 2-7. 8，過濾至澄清，118-121°C下滅菌20-30分鐘備用。
6.一種細(xì)菌群相的同步培養(yǎng)方法，其特征在于，將樣本分別接種于需氧菌類培養(yǎng)增殖 液、厭氧菌類培養(yǎng)增殖液、細(xì)菌L型類培養(yǎng)增殖液、細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌類培養(yǎng)增殖液中混勻，35°C 培育6-8小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的同步培養(yǎng)方法，其特征在于，還包含以下步驟觀測接種了樣 品的四種培養(yǎng)增殖液，如有混濁，在無菌狀態(tài)下取混濁的菌液進(jìn)行細(xì)菌群相的直接藥敏試 驗(yàn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的同步培養(yǎng)方法，其特征在于，所述細(xì)菌群相的直接藥敏試驗(yàn) 方法包括擴(kuò)散法。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的同步培養(yǎng)方法，其特征在于，所述細(xì)菌群相的直接藥敏試 驗(yàn)步驟為取混濁的菌液轉(zhuǎn)種于對(duì)應(yīng)的藥敏測試培養(yǎng)基，貼敷抗菌藥物紙片，于35°C培育 16-18小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體公開了一種細(xì)菌群相同步培養(yǎng)的方法及試劑盒。本發(fā)明所述試劑盒，包含需氧菌類培養(yǎng)增殖液、厭氧菌類培養(yǎng)增殖液、細(xì)菌L型類培養(yǎng)增殖液和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌類培養(yǎng)增殖液。本發(fā)明所述方法及試劑盒進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)所需樣品量僅為常規(guī)用量的1-2％，陽性檢出率高達(dá)95％以上，細(xì)菌培養(yǎng)6-8小時(shí)即可判斷結(jié)果，24小時(shí)獲得致病菌細(xì)菌群相藥物敏感數(shù)據(jù)，與循證醫(yī)學(xué)的循證診治的基本原則相吻合，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/08GK101857893SQ201010154578
公開日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者袁鴻慈 申請(qǐng)人:上海塞孚生物科技有限公司