本發(fā)明屬于分子生物學技術及耐藥細菌監(jiān)測領域，涉及一種新發(fā)現(xiàn)的與肺炎克雷伯氏菌耐藥性密切相關的整合子。
背景技術：
醫(yī)療水平的進步，種類繁多的抗生素日益被開發(fā)出來并投放市場。大量應用于臨床及獸醫(yī)方面，甚至在畜牧業(yè)中，也常使用其促進生長，正是這些抗生素的廣泛應用，尤其是不合理地使用，造成細菌的耐藥以至多重耐藥問題日益嚴重，耐藥機制日趨復雜。人們預料可能由于基因突變會導致耐單種抗生素的菌株的出現(xiàn)，但在同一菌株中同時出現(xiàn)對多種抗生素的耐藥性，很難用基因突變進行解釋。研究證明，遺傳物質(zhì)在菌種內(nèi)以及菌種間的水平傳播，是細菌獲得新的耐藥性的重要途徑。耐藥性快速廣泛地傳播以及在不同菌種間出現(xiàn)非常相似的耐藥方式，說明了上述機制的重要性。近來的研究表明整合子在耐藥基因的水平傳播以及多重耐藥菌株的出現(xiàn)中起重要作用。
整合子(integron)是一個能通過自身編碼的整合酶識別、捕獲、整合或剪切細胞外游離基因或基因片段，并使之轉化為功能性基因的重組表達系統(tǒng)。被其捕獲和整合的細胞外游離基因或基因片段多為編碼耐藥性蛋白如β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)、氨基糖苷類鈍化酶、林可霉素類鈍化酶、氯霉素乙酰轉移酶、大環(huán)內(nèi)酯類鈍化酶、氨基糖甙乙酰轉移酶(AAC)、氨基糖甙磷酸轉移酶(ANT)核苷轉移酶(APH)等的耐藥基因。
整合子在某些情況下通過捕獲有利的基因盒，如耐藥性基因盒，而獲得生存優(yōu)勢，但也有可能捕獲某些對宿主產(chǎn)生毒性的基因盒而造成不利的影響，或者過度捕獲基因盒而對宿主菌的繁殖造成一定負擔。因此，細菌的整合子在捕獲外來基因盒的過程中，推測其一定有一套完整而又精細的調(diào)節(jié)機制，但這一機制還仍未明了。對上述有關調(diào)節(jié)機制的研究，將有利于揭示細菌的耐藥性，尤其是細菌的多重耐藥性。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種含有耐藥基因盒的整合子，將其命名為In1290，其序列如SEQ ID NO.1所示。該整合子含有aadA16基因盒、dfrA27基因盒、arr-3基因盒、catB3基因盒和aacA4基因盒。上述整合子表達多種耐藥基因，從而導致含有該整合子的菌種對多種抗生素藥物具有抗性。這些抗生素包括：氨基糖苷類抗生素、磺胺類抗生素、氯霉素類抗生素、大觀霉素類抗生素以及利福平類抗生素。
常見的氨基糖苷類抗生素包括：鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星。
常見的磺胺類抗生素包括：磺胺異惡唑(SIZ)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺甲惡唑(SMZ)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、柳氮磺吡啶(SASP)、磺胺米隆(SML)、磺胺嘧啶銀、磺胺醋酰(SA)、以及復方新諾明(甲氧芐啶+磺胺甲惡唑)。
常見的氯霉素類抗生素包括：氯霉素、琥珀酸氯霉素。
常見的大觀霉素類抗生素包括：大觀霉素、觀霉素、奇霉素。
常見的利福平類抗生素包括：利福平、利福噴汀。
本發(fā)明的整合子是通過以下方法獲得的：
(1)在臺州市立醫(yī)院感染科病人血液培養(yǎng)陽性的標本中分離出1株對阿米卡星、慶大霉素耐藥的細菌；
(2)然后將分離的單克隆菌株按操作程序用VITEK 2和藥敏平板瓊脂擴散方法(補充藥敏紙片)進行細菌鑒定及藥敏試驗，經(jīng)鑒定此菌株為肺炎克雷伯氏菌，將其命名為KP5325。同時，試驗證實此菌株對多種抗生素有顯著抗性；
(3)將KP5325菌株培養(yǎng)擴增，提取所述耐藥菌株的質(zhì)粒；
(4)將步驟(3)提取純化后的質(zhì)粒使用BamHI酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離得到一段長度為5,238bp的DNA片段，將該DNA片段以常規(guī)方法與pMD19-T載體連接，然后熱激轉化法轉入感受態(tài)細胞E.coli TOP10中，以藍白斑實驗挑選陽性轉化子，測序；
(5)利用ContigExpress Program軟件進行序列拼接，分析其結構，鑒定出序列如SEQ ID NO.1所示的序列。
本發(fā)明提供了一種含有該整合子的菌株。該菌株命名為KP5325。KP5325菌株的質(zhì)粒中含有整合子In1290，其序列如SEQ ID NO.1所示。
本發(fā)明還提供了一種含有整合子In1290序列的重組質(zhì)粒。所述質(zhì)粒包含整合子In1290序列。在本發(fā)明的具體的實施方案中，所述重組質(zhì)粒由整合子In1290序列和pET32a載體重組而成，整合子插入位點在pET32a載體上BamHI酶切位點處。所述重組質(zhì)粒使用的空載體可以使用任何常見的質(zhì)粒載體代替。所述重組質(zhì)粒的方法也為本領域技術人員熟知的常規(guī)方法。
本發(fā)明也提供了一種含有整合子In1290的接合菌株。為了研究整合子的耐藥性，本發(fā)明利用細菌質(zhì)粒轉導實驗來檢測鑒定整合子In1290的功能，將KP5325菌株與E.coli J53 AzR(對疊氮化鈉耐藥)菌株共培養(yǎng)，通過含疊氮化鈉(300mg/L)和阿米卡星(0.06mg/L)平板篩選接合子，將接合子做藥敏試驗，受體菌擁有供體菌的抗性。其中，所用阿米卡星可用下列藥物代替：妥布霉素、卡拉霉素、慶大霉素、復方新諾明、氯霉素、利福平。
本發(fā)明還提供了一種含有整合子In1290的重組菌株。為進一步證實上述接合菌株的抗性來源于KP5325菌株中的整合子，本發(fā)明將該整合子In1290克隆入pET32a載體中，整合子插入位點在pET32a載體上BamHI酶切位點處。并將其轉化入野生型E.coli JM109中，通過含有阿米卡星的平板選陽性克隆(含有pET32a-整合子的細菌)。將陽性克隆做藥敏試驗，結果顯示KP5325菌株中的整合子In1290可以使重組E.coli JM109菌株對以下藥物耐藥：阿米卡星、妥布霉素、卡拉霉素、慶大霉素、復方新諾明、氯霉素、利福平、大觀霉素。
本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：
(1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了序列為SEQ ID NO.1的包括多種耐藥基因盒的整合子In1290，該整合子的核苷酸序列在現(xiàn)有技術中未見報道。
(2)本發(fā)明整合子序列的發(fā)現(xiàn)，為臨床用藥提供了一定的指導作用。有利于臨床上減少某些抗菌藥物的使用，降低該類耐藥基因盒水平轉移的選擇壓力，防止耐藥細菌的爆發(fā)性流行。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的整合子In1290的結構示意圖。
具體的實施方式
下面結合具體的實施例進一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的實施例僅用于解釋本發(fā)明，并不意味著限制本發(fā)明的保護范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所描述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實施例1整合子In1290的鑒定
1、KP5325菌株的分離和鑒定
1.1材料
細菌藥敏卡：法國bio Merieux的AST-GN13。AST-GN13藥敏種類有：阿米卡星、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢替坦、頭孢他定、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、厄他培南、慶大霉素、亞胺培南、左氧氟沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、SMZ。
補充藥敏紙片(藥敏平板瓊脂擴散實驗)：紙片來源于英國Oxoid公司，有復方新諾明(30μg)、氯霉素(30μg)和利福平(5μg)。
1.2方法
儀器鑒定：將臺州市立醫(yī)院感染科病人血液培養(yǎng)陽性的菌株轉種到血平板上分離培養(yǎng)(在35℃含5％CO2孵育箱中培養(yǎng)16-18h)，然后將分離的純細菌按操作程序在VITEK 2上機作細菌鑒定與藥敏試驗。
補充藥敏試驗：將0.5麥氏單位的菌液涂抹在MH平板上，按操作程序貼上復方新諾明、氯霉素和利福平紙片，在35℃含5％CO2孵育箱中培養(yǎng)16-18h后，按CLSI 2015標準鑒定藥敏結果。
1.3結果
1.3.1儀器鑒定結果
中等大小的革蘭氏陰性桿菌，KIA產(chǎn)酸/產(chǎn)酸，葡萄糖與乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，氧化酶陰性，VP陽性，吲哚陰性，枸櫞酸鹽陽性，動力陰性，不產(chǎn)H2S，符合肺炎克雷伯菌的特性，經(jīng)VITEK 2微生物分析儀鑒定為肺炎克雷伯氏菌，鑒定概率為99％，將其命名為KP5325。
1.3.2藥敏實驗結果
藥敏實驗結果表明，KP5325菌株對于以下藥物產(chǎn)生抗性：阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、復方新諾明、SMZ、氯霉素、利福平。
2、整合子In1290的分離和鑒定
2.1方法
2.1.1KP5325菌株的質(zhì)粒提取
采用TaKaRa的質(zhì)粒少量提取試劑盒，按照說明書操作步驟提取細菌質(zhì)粒DNA，作為PCR模板，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
2.1.2整合子的獲取
(1)將清潔干燥并經(jīng)滅菌的0.5mL eppendorf管編號，用微量移液槍分別加入KP5325質(zhì)粒DNA 1μg和10×限制性內(nèi)切酶反應緩沖液2μL(Fermentas)，再加入重蒸水使總體積為19μL，將管內(nèi)溶液混勻后加入1μL BamHI酶液(Fermentas)，用微量離心機甩一下，使溶液集中在管底。
(2)混勻反應體系后，將eppendorf管置于適當?shù)闹С治锷?插在泡沫塑料板上)，37℃水浴保溫2-3h，使酶切反應完全。
(3)每管加入2μL 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混勻，以停止反應。
(4)將酶切后的產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳進行分離。
2.1.3整合子的鑒定
(1)將經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離得到的長度為5,238bp的DNA片段回收。
(2)使用常規(guī)方法，將步驟(1)回收的DNA片段與pMD19-T載體連接，然后熱激轉化法轉入感受態(tài)細胞E.coli TOP10中，以藍白斑實驗挑選陽性轉化子，測序。
2.2結果
測序結果進行分析和拼接后顯示，長度為5,238bp的DNA片段屬于I類整合子，該整合子包括I型整合子的基本結構和多個基因盒，序列如SEQ ID NO.1所示，結構示意圖如圖1所示。
實施例2質(zhì)粒轉導實驗研究整合子In1290的功能
1、方法
(1)供體菌為KP5325菌株，受體菌為E.coli J53 AzR(對疊氮化鈉耐藥)。將供體菌、受體菌分別接種于LB平板上，35℃過夜培養(yǎng)。挑取單個菌落分別接種于4mL的LB肉湯中，37℃220r/min搖菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期。各取0.5mL供、受體菌于4mL的LB肉湯中，37℃靜止過夜培養(yǎng)。接合子以胰大豆瓊脂(TSA)平皿篩選，平板中含疊氮化鈉(300mg/L)和阿米沙星(0.06mg/L)。置35℃孵育18-24h。提取耐藥菌株的質(zhì)粒(步驟同實施例1)，以PCR法進行整合子In1290序列的檢測。
擴增整合子In1290序列的引物如表1所示：
表1引物序列
PCR的反應體系(50μL)：Mg2+2.5mmol/L，引物30pmol/L，dNTP 0.2mmol/L，2.5U Tap酶及2μL DNA模板。
擴增條件：
94℃預變性3min，然后94℃變性1min，52-58℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后72℃延長至10min。
將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。將擴增產(chǎn)物的長度為5,238bp的DNA模板所在的菌株稱為整合子In1290接合轉移成功的陽性菌株。
(2)將陽性菌株進行藥敏實驗，步驟同實施例1。
1.2結果
藥敏實驗結果顯示，整合子In1290序列表達陽性菌株的藥敏反應同KP5325菌株相同，代表整合子In1290序列接合轉移成功，且該整合子導致了接合細菌產(chǎn)生了下列藥物的抗性：阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、SMZ、復方新諾明、氯霉素、利福平。
實施例3基因重組實驗研究整合子In1290的功能
1、方法
(1)將實施例2中的PCR產(chǎn)物(核苷酸序列為SEQ ID NO.1)與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物加入100μL E.coli JM109的感受態(tài)中轉化，在含有IPTG、x-gal、Amp的平板上培養(yǎng)，將IPTG、x-gal、Amp抗性菌株提取質(zhì)粒測序(步驟同實施例1)，檢測整合子In1290是否插入基因組中。然后將整合子In1290序列克隆到pET32a載體中，整合子的插入位點在pET32a載體上BamHI酶切位點處，按照常規(guī)方法制備，得到含整合子In1290序列的pET32a重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉化到感受態(tài)E.coli JM109細胞中。
(2)對構建成功的克隆菌進行耐藥性檢測
采用法國bioMerieux的VITEK 2細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)和藥敏平板瓊脂擴散方法(補充藥敏紙片)對重組菌E.coli JM109(pET32a-整合子In1290)進行耐藥性檢測。
2、結果
藥敏實驗結果顯示，重組菌E.coli JM109(pET32a-整合子In1290)的藥敏反應同KP5325菌株相同，代表整合子In1290序列已經(jīng)成功整合到E.coli JM109的基因組中，且該整合子導致了重組菌E.coli JM109產(chǎn)生了下列藥物的抗性：阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、SMZ、復方新諾明、氯霉素、利福平。
上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內(nèi)。