整合子In1085的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)及耐藥細(xì)菌監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，涉及一種新發(fā)現(xiàn)的與大腸埃希 菌耐藥性密切相關(guān)的整合子。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸桿菌是醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床上最常見(jiàn)的病原菌之一，給人類的健康和畜牧業(yè)的發(fā) 展造成了嚴(yán)重的損害?？咕幵诳刂拼竽c桿菌感染方面發(fā)揮了重要作用，但隨著抗菌藥物 的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥株尤其是多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)，大腸桿菌的耐藥問(wèn)題已 成為影響人類健康和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。
[0003] 整合子（integron)是一個(gè)能通過(guò)自身編碼的整合酶識(shí)別、捕獲、整合或剪切細(xì)胞 外游離基因或基因片段，并使之轉(zhuǎn)化為功能性基因的重組表達(dá)系統(tǒng)。整合子依據(jù)整合酶序 列的不同可分成多種不同的類型。I類整合子至今發(fā)現(xiàn)在革蘭陰性菌中廣泛分布、檢出率最 多。I類整合子的基本結(jié)構(gòu)由3部分組成，兩端是高度保守序列，分別稱作5 '保守端（5 ' -CS) 和3'保守端（3, -CS)，5' -CS長(zhǎng)約I. 4kb，3' -CS長(zhǎng)約2kb，5' -CS和3' -CS之間的區(qū)域稱 作可變區(qū)，可變區(qū)由一個(gè)或多個(gè)基因盒組成，基因盒一般含抗菌藥物耐藥基因。整合子是一 種可移動(dòng)的基因元件，位于細(xì)菌的質(zhì)粒或染色體上，可攜帶多個(gè)抗菌藥物耐藥基因，并能引 起耐藥基因的高效、快速轉(zhuǎn)移，造成同種或不同菌種之間的擴(kuò)散，從而表達(dá)對(duì)不同抗生素的 多重耐藥性。
[0004] 臨床抗菌藥物大量應(yīng)用是細(xì)菌整合子分子進(jìn)化和捕獲更多耐藥基因的重要原因， 故應(yīng)加強(qiáng)抗菌藥物的合理應(yīng)用，以減少整合子發(fā)生、減少分子進(jìn)化的外部誘導(dǎo)環(huán)境，延緩多 藥耐藥菌株的發(fā)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種含有耐藥基因盒的整合子，將其命名為Inl085,其序列如SEQ ID NO. 1所示。該整合子含有aacA4基因盒、WaoxiwS因盒、catB3基因盒、arr-3基因盒 和dfrA27基因盒。上述整合子表達(dá)多種耐藥基因，從而導(dǎo)致含有該整合子的菌種對(duì)多種抗 生素藥物具有耐藥性。這些抗生素包括：氨基糖苷類抗生素、β內(nèi)酰胺類抗生素、磺胺類抗 生素、氯霉素類抗生素以及利福平類抗生素。
[0006] 常見(jiàn)的氨基糖苷類抗生素包括：鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡 星。
[0007] 常見(jiàn)的β內(nèi)酰胺類抗生素包括：青霉素、頭孢菌素、碳青霉烯類，以及新發(fā)展的頭 霉素類、硫霉素類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類等其他非典型β-內(nèi)酰胺類抗生素。
[0008] 常見(jiàn)的磺胺類抗生素包括：磺胺異惡唑（SIZ)、磺胺二甲嘧啶（SM2)、磺胺嘧啶 (SD)、磺胺甲惡唑（SMZ)、磺胺間甲氧嘧啶（SMM)、柳氮磺吡啶（SASP)、磺胺米?。⊿ML)、磺胺 嘧啶銀、磺胺醋酰（SA)、以及復(fù)方新諾明（甲氧芐啶+磺胺甲惡唑）。
[0009] 常見(jiàn)的氯霉素類抗生素包括：氯霉素、琥珀酸氯霉素。
[0010] 常見(jiàn)的利福平類抗生素包括：利福平、利福噴汀。
[0011] 本發(fā)明的整合子是通過(guò)以下方法獲得的：
[0012] (1)在臺(tái)州市立醫(yī)院泌尿外科病人尿液培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本中分離出1株對(duì)頭孢曲 松、阿米卡星、復(fù)方新諾明耐藥的細(xì)菌。
[0013] (2)然后將分離的單克隆菌株按操作程序用VITEK 2和藥敏平板瓊脂擴(kuò)散方法 (補(bǔ)充藥敏紙片）進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)，經(jīng)鑒定此菌株為大腸埃希氏菌菌，將其命名為 Eco336。同時(shí)，試驗(yàn)證實(shí)此菌株對(duì)多種抗生素有顯著耐藥性。
[0014] (3)將EC0336菌株培養(yǎng)擴(kuò)增，提取所述耐藥菌株的質(zhì)粒。
[0015] (4)將步驟（3)提取純化后的質(zhì)粒使用BamHI酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離得到一段 長(zhǎng)度為5, 668bp的DNA片段，將該DNA片段以常規(guī)方法與pMD19-T載體連接，然后熱激轉(zhuǎn)化 法轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E. coli T0P10中，以藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，測(cè)序。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種含有整合子Inl085序列的重組質(zhì)粒。所述質(zhì)粒包含整合子 Inl085序列。在本發(fā)明的具體的實(shí)施方案中，所述重組質(zhì)粒由整合子Inl085序列和pET32a 載體重組而成，整合子插入位點(diǎn)在pET32a載體上BamHI酶切位點(diǎn)處。所述重組質(zhì)粒使用的 空載體可以使用任何常見(jiàn)的質(zhì)粒載體代替。所述重組質(zhì)粒的方法也為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的常規(guī)方法。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種含有整合子Inl085的接合菌株。為了研宄整合子的耐藥性， 本發(fā)明利用細(xì)菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)鑒定整合子Inl085的功能，將Ec 〇336菌株與E. coli J53 Azk(對(duì)疊氮化鈉耐藥）菌株共培養(yǎng)，通過(guò)含疊氮化鈉（300mg/L)和阿米卡星（0. 06mg/ L)平板篩選接合子，將接合子做藥敏試驗(yàn)，受體菌擁有供體菌的耐藥性。其中，所用阿米卡 星可用下列藥物代替：氨曲南、妥布霉素、丁胺卡拉、慶大霉素、頭孢替坦、頭孢唑林、頭孢吡 肟、頭孢他啶、頭孢曲松、亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦（舒普深）、復(fù) 方新諾明。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種含有整合子Inl085的重組菌株。為進(jìn)一步證實(shí)上述接合 菌株的抗性來(lái)源于Ec 〇336菌株中的整合子，本發(fā)明將該整合子Inl085克隆入pET32a載 體中，整合子插入位點(diǎn)在pET32a載體上BamHI酶切位點(diǎn)處。并將其轉(zhuǎn)化入野生型E. coli JM109中，通過(guò)含有Amp的平板選陽(yáng)性克?。ê衟ET32a-整合子的細(xì)菌）。將陽(yáng)性克隆做 藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示Eco336菌株中的整合子Inl085可以使重組E. coli JM109菌株對(duì)以下 藥物耐藥：氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、丁胺卡拉、慶大霉素、頭孢替坦、頭孢唑林、頭孢吡 肟、頭孢他啶、頭孢曲松、亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦（舒普深）、復(fù) 方新諾明、氯霉素。
[0019] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0020] (1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了序列為SEQ ID NO. 1的包括多種耐藥基因盒的整合子 Inl085,該整合子的核苷酸序列在現(xiàn)有技術(shù)中未見(jiàn)報(bào)道。
[0021] (2)本發(fā)明整合子序列的發(fā)現(xiàn)，為臨床用藥提供了一定的指導(dǎo)作用。有利于臨床上 減少某些抗菌藥物的使用，降低該類耐藥基因盒水平轉(zhuǎn)移的選擇壓力，防止耐藥細(xì)菌的爆 發(fā)性流行。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為本發(fā)明的整合子Inl085的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0023] 具體的實(shí)施方式
[0024] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明， 并不意味著限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0025] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如sambrook等人， 分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所描 述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0026] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0027] 實(shí)施例1整合子Inl085的鑒定
[0028] l、Eco336菌株的分離和鑒定
[0029] I. 1 材料
[0030] 細(xì)菌藥敏卡：法國(guó)bioMerieux的AST-GN13。AST-GN13藥敏種類有：阿米卡星、氨 芐西林、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢替坦、頭孢他定、頭孢曲松、 環(huán)丙沙星、厄他培