一種模型擬合和基因改造提高蛋白表達(dá)效率的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種模型擬合和基因改造提高蛋白表達(dá)效率的方 法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代基因工程和生物工程理論和技術(shù)的高速發(fā)展，無(wú)論是基礎(chǔ)研宄領(lǐng)域，還 是生物醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)保和食品等應(yīng)用領(lǐng)域，利用異源表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)更高水平的目的重組蛋 白都已成為研宄熱點(diǎn)和重點(diǎn)。相對(duì)于原始基因在自身宿主的表達(dá)，利用異源宿主表達(dá)重組 蛋白具有許多優(yōu)點(diǎn)：首先，異源表達(dá)可能顯著提高目的蛋白的表達(dá)量；其次，異源表達(dá)中通 常所選的宿主具有相對(duì)透徹的研宄背景，以及成熟的發(fā)酵和分離純化工藝，有利于提高生 產(chǎn)效率、節(jié)約成本；另外，異源表達(dá)中通常所選的宿主具有生物安全性，在食品和醫(yī)藥方面， 有利于避免使用病原宿主而引發(fā)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。目前，與異源重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)相關(guān)的技術(shù) 尚未十分完善，以至于相關(guān)的產(chǎn)品的生產(chǎn)效率或良品率低下且價(jià)格昂貴，例如一些要治療 相關(guān)癥狀所必須用到的蛋白質(zhì)類(lèi)藥物，往往會(huì)出現(xiàn)"供不應(yīng)求"的局面和其他質(zhì)量問(wèn)題?？?見(jiàn)，改善和提高重組蛋白的表達(dá)效率具有舉足輕重的意義：首先，重組蛋白表達(dá)效率的提 高，將會(huì)大大縮短應(yīng)用重組蛋白的相關(guān)研宄的周期，從而提高課題研宄的效率；再者，重組 蛋白表達(dá)效率的提高會(huì)很大程度地縮短某些蛋白質(zhì)類(lèi)藥物或其他產(chǎn)品的生產(chǎn)周期，減少了 大量的人力物力的投入，大大降低藥物或其他蛋白質(zhì)藥物的成本；第三，重組蛋白表達(dá)效率 的提高和改善可以擴(kuò)展蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的生產(chǎn)規(guī)模，提高藥物的質(zhì)量，降低患者的治療費(fèi)用 和增強(qiáng)疾病治療的時(shí)效性。
[0003] 重組蛋白的表達(dá)，就是利用重組DNA或重組RNA的技術(shù)使目的基因在宿主體內(nèi)經(jīng) 過(guò)轉(zhuǎn)錄（逆轉(zhuǎn)錄）和翻譯合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)（多肽鏈），為此，現(xiàn)今不少的研宄表明，人們可 以在此過(guò)程中基于不同的原理以不同的手段和技術(shù)來(lái)改善和提高重組蛋白的表達(dá)效率，例 如：首先，在基因?qū)用嫔?，有研宄表明，并非所有的目的基因都能在宿主?nèi)得到高效的表達(dá)， 而目的基因本身的堿基序列也會(huì)影響到其表達(dá)效率，如對(duì)密碼子的偏愛(ài)性、對(duì)密碼子對(duì)的 偏愛(ài)性、GC含量等等，因而人們可以根據(jù)這些特點(diǎn)來(lái)對(duì)目的基因進(jìn)行修改和設(shè)計(jì)，對(duì)密碼子 對(duì)進(jìn)行優(yōu)化，做到目的基因?qū)γ艽a子和密碼子對(duì)的協(xié)調(diào)化，從而達(dá)到提高重組蛋白表達(dá)效 率的目的；再者，在目的基因轉(zhuǎn)錄層面上，某些DNA雙鏈上就會(huì)出現(xiàn)"發(fā)夾"結(jié)構(gòu)，而"發(fā)夾" 結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的位置會(huì)不同程度地影響到目的基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)"發(fā)夾"結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在靠近編碼區(qū)前 的SD序列（Shine-Dalgarno序列）的前面，它能使部分與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的酶與單鏈DNA充分結(jié) 合，從而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄的效率。當(dāng)"發(fā)夾"結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在靠近SD序列的后面或者在編碼區(qū)上，它 會(huì)減緩與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的酶在單鏈DNA上的移動(dòng)速率，從而降低了轉(zhuǎn)錄的效率，兩種結(jié)果截然 不同?？梢?jiàn)，人們可以根據(jù)情況來(lái)改變某些DNA中"發(fā)夾"結(jié)構(gòu)的位置或者增減相應(yīng)的"發(fā) 夾"結(jié)構(gòu)，從而提高目的基因的轉(zhuǎn)錄效率，來(lái)達(dá)到改善和提高重組蛋白的表達(dá)效率的目的； 最后，在翻譯的層面上，有研宄表明翻譯也受多個(gè)因素的影響：一方面，宿主體內(nèi)的翻譯條 件在很大程度上影響著目的基因的翻譯，如游離氨基酸的豐富度、酶活性等，因此人們可以 通過(guò)有目的地改造宿主或者選用更好的宿主來(lái)提供一個(gè)更好的翻譯條件，從而改善和提高 重組蛋白的表達(dá)效率；另一方面，目的基因翻譯的最終產(chǎn)物，即目的蛋白質(zhì)（多肽鏈），它們 的水溶性或者是否能及時(shí)被排出宿主體外也在一定程度上影響了翻譯的效率，這是因?yàn)樗?溶性差和不及時(shí)被排出宿主體外這兩個(gè)因素會(huì)使目的基因的表達(dá)很快達(dá)到一個(gè)飽和狀態(tài)， 從而抑制了表達(dá)，大大降低了表達(dá)的持續(xù)性和效率。因此，人們可以通過(guò)對(duì)目的基因進(jìn)行修 飾設(shè)計(jì)，如引入融合標(biāo)簽，另外也可以通過(guò)使目的基因與分子伴侶或折疊酶共表達(dá)、替換氨 基酸和改變培養(yǎng)基成分等途徑，來(lái)增強(qiáng)翻譯產(chǎn)物的水溶性，使其更快被排出宿主體外，從而 增強(qiáng)表達(dá)的持續(xù)性，改善提高了重組蛋白的表達(dá)效率。
[0004] 本發(fā)明是利用模型擬合技術(shù)來(lái)模擬目的基因的mRNA的空間結(jié)構(gòu)，以此作為定點(diǎn) 突變優(yōu)化的依據(jù)，繼而通過(guò)最終的篩選來(lái)確定最佳的目的基因突變改造方案，從而達(dá)到預(yù) 期的以提高蛋白質(zhì)翻譯時(shí)的效率來(lái)改善重組蛋白表達(dá)效率的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明是利用模型擬合技術(shù)來(lái)模擬目的基因的mRNA的空間結(jié)構(gòu)，以此作為定點(diǎn) 突變的優(yōu)化依據(jù)，來(lái)提高蛋白質(zhì)翻譯的速度，改善重組蛋白表達(dá)效率的方法。
[0006] 本發(fā)明采用軟件M-fold進(jìn)行mRNA空間二級(jí)結(jié)構(gòu)的擬合，利用分子生物學(xué)原理，通 過(guò)定點(diǎn)突變移除起始密碼子之后的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且實(shí)驗(yàn)篩選出重組蛋白高效表達(dá)的菌株， 大大改善了重組蛋白的表達(dá)效率。
[0007] 本發(fā)明的模型擬合、定點(diǎn)突變和實(shí)驗(yàn)篩選改善重組蛋白表達(dá)效率的具體技術(shù)方案 如下：
[0008] (l)M-fold程序模擬目的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，當(dāng)緊接著起始密碼子后面（特別是編 碼2-7位蛋白質(zhì)殘基，即4-21位核苷酸序列）有二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)或堿基的胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤 (GC)含量較高時(shí)，蛋白質(zhì)翻譯的效率將大大下降，表達(dá)困難。模型蛋白E. coli的核糖體蛋 白Lll的mRNA用于M-fold的二級(jí)結(jié)構(gòu)擬合，發(fā)現(xiàn)其二級(jí)結(jié)構(gòu)確實(shí)在起始密碼子之后有一 個(gè)莖環(huán)。因此，富含腺嘌呤和胸腺嘧啶（AT)的密碼子被嘗試用在M-fold模擬程序中，之前 的 GlySerSer 序列突變?yōu)?LeuLeulIe (序列 TTATTAATT，LLI)或 TyrTyrTyr (序列 TATTATTAT， YYY)或完全刪除（dGdSdS)，經(jīng)過(guò)程序擬合，發(fā)現(xiàn)將移除莖環(huán)，在緊接著蛋白質(zhì)起始密碼子 后進(jìn)行這樣的突變，一般不會(huì)影響蛋白的生物功能，但同時(shí)將大大改善翻譯的起始速度，提 高重組蛋白的表達(dá)效率。
[0009] (2)定點(diǎn)突變
[0010] 蛋白質(zhì)的質(zhì)粒準(zhǔn)備
[0011] BL21(DE3)pLysS Lll單菌落被接種到有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C水浴經(jīng)過(guò) 兩夜搖晃孵育。離心收獲細(xì)胞后，儲(chǔ)存在_80°C條件下。細(xì)胞用溶菌酶（Sigma-Aldrich)破 膜，純化質(zhì)粒，真空干燥后保存于DEPC水中。濃度通過(guò)A 26tl測(cè)定，其序列由DNA測(cè)序來(lái)證實(shí)。
[0012] 定點(diǎn)突變的引物設(shè)計(jì)
[0013] Stratagene QuikChange定點(diǎn)突變?cè)噭┖杏糜跇?gòu)建多個(gè)突變菌株。引物設(shè)計(jì)根 據(jù)以下原則：1.兩個(gè)誘變引物在相反的質(zhì)粒鏈上必須包含所需的突變和退火相同的順序； 2.引物長(zhǎng)度應(yīng)當(dāng)在25到45個(gè)堿基之間，融解溫度（Tm)多78°C ;3.所需的突變（刪除或 者插入）應(yīng)該在引物中間，并且兩邊都有10到15個(gè)序列正確的堿基；4.引物的胞嘧啶和 鳥(niǎo)嘌呤（GC)含量至少要40%，并且終止于一個(gè)或者多個(gè)C或G堿基。
[0014] 定點(diǎn)突變
[0015] XLl-Blue超級(jí)感受態(tài)菌株被用來(lái)大量復(fù)制、突變和保存Lll質(zhì)粒。通過(guò)PCR擴(kuò)增 和測(cè)序證明，實(shí)驗(yàn)成功實(shí)現(xiàn)了預(yù)想的三種突變，對(duì)Lll的質(zhì)粒進(jìn)行了改造，定點(diǎn)突變成功移 除了莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0016] ⑶實(shí)驗(yàn)篩選
[0017] 將Lll質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLysS超級(jí)感受態(tài)菌株菌株后，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并 定時(shí)在550nm檢測(cè)吸光度。約兩小時(shí)后，加入ImM IPTG去誘導(dǎo)過(guò)量表達(dá)，并測(cè)定吸光度。經(jīng) 過(guò)SDS-PAGE分離的Lll條帶的經(jīng)過(guò)分析測(cè)定，篩選出能提供最高產(chǎn)量的Lll突變體。
[0018] (4) LI 1的生物學(xué)活性驗(yàn)證
[0019] 本發(fā)明通過(guò)生物試驗(yàn)，將Lll重新組裝到大腸桿菌的核糖體中，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)合成 的速度完全未受Lll突變的影響，驗(yàn)證了多種突變體的生物功能基本和野生型相同，無(wú)明 顯差異。
[0020] 有益效果：
[0021] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：利用M-fold程序模擬目的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，降低緊接著起始 密碼子后面（特別是編碼2-7位蛋白質(zhì)殘基，即4-21位核苷酸序列）的堿基的胞嘧啶和鳥(niǎo) 嘌呤（GC)含量，并移除二級(jí)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)定點(diǎn)突變和篩選過(guò)量表達(dá)后的突變體，大大 提高了重組蛋白的表達(dá)效率。此外，突變后的重組蛋白在生物功能上與野生型相當(dāng)。本發(fā) 明的改善重組蛋白表達(dá)效率的方法，在起始密碼子后略改造目的基因，一般不改變基因和 蛋白的生物功能，有較高的通用性和可行性，將同樣適用于其他重組蛋白的大量表達(dá)和工 業(yè)生產(chǎn)等。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1.在M-fold軟件中擬合的核糖體蛋白Lll野生型Lll-WT的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。 起始密碼子ATG用紅色方框突出顯示。
[0023] 圖2.在M-fold軟件中擬合的核糖體蛋白Lll定點(diǎn)突變的Lll-YYY突變體的mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)。起始密碼子ATG用紅色方框突出顯示。
[0024] 圖3.