本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于CRISPR/Cas9技術(shù)的單子葉植物基因敲除載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)是來(lái)自鏈球菌屬的一種獲得性免疫系統(tǒng)，能夠抵御外源基因的入侵。經(jīng)過(guò)人工修飾，這種系統(tǒng)在動(dòng)植物中得到了廣泛應(yīng)用。它主要由CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)和特異的Cas9蛋白組成。CRISPR是一成簇的規(guī)律間隔的短回文DNA重復(fù)序列，它由一系列短的高度保守的正向重復(fù)序列和長(zhǎng)度相似的序列間隔排列組成。Cas9蛋白是一種由1409個(gè)氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白，含有兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域RuvC-like和HNH。CRISPR/Cas9系統(tǒng)于2013年被Seung等人(Seung Woo Cho et al.,2013)首次成功運(yùn)用于真核細(xì)胞的基因組編輯。基于CRISPR/Cas9的基因組編輯體系包括2部分：sgRNA及酶Cas9。這種系統(tǒng)能夠特異的識(shí)別毗鄰PAM(NGG)基序的靶序列，并在其上游3nt處進(jìn)行切割，同時(shí)RuvC-like結(jié)構(gòu)域在PAM區(qū)上游3～8nt處進(jìn)行切割，形成DSB(double strains break),隨后機(jī)體通過(guò)自身的修復(fù)機(jī)制如同源重組、非同源重組來(lái)修復(fù)損傷的DNA,進(jìn)而產(chǎn)生Indel(包括缺失和插入)的現(xiàn)象。

目前應(yīng)用于植物上的CRISPR/Cas9載體構(gòu)建體系并不多，有基于基因槍轉(zhuǎn)化的載體構(gòu)建體系和基于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的載體構(gòu)建體系。在目前普遍使用的植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方面，基于CRISPR/Cas9技術(shù)的植物基因敲除載體體系構(gòu)建過(guò)程比較繁瑣，需要多步才能將各個(gè)部分整合到雙元載體上。已報(bào)道的CRISPR/Cas9體系，有的體系是借助限制性內(nèi)切酶BbsI先把sgRNA插入pATU6-26SK/pOsU6SK載體,再通過(guò)限制性內(nèi)切酶KpnI和SalI酶切得到AtU6-sgRNA片段或通過(guò)KpnI和HindIII雙酶切獲得OsU6-sgRNA片段，同時(shí)將酶切過(guò)的SalI-Cas9-EcoRI或HindIII-Cas9-EcoRI片段與已用KpnI和EcoRI酶切的線性化的質(zhì)粒pCAMBIA1300連接構(gòu)建雙元載體，這種系統(tǒng)在構(gòu)建過(guò)程中比較復(fù)雜而且周期長(zhǎng)(ZY Feng,JK Zhu et al.,2013)；另外有利用合成的方法直接合成啟動(dòng)子和sgRNA單元，再構(gòu)建到雙元載體上，這種體系成本高，周期長(zhǎng)(Wenzhi Jiang et al.,2013)。而在基因槍轉(zhuǎn)化方面中，已報(bào)道的體系都是將pU6-gRNA或pU3-gRNA載體與Cas9載體共同包裹在金粉中打入植物組織中，這種費(fèi)用比較高。以上這些體系，要完成一個(gè)植物基因CRISPR/Cas9敲除載體的構(gòu)建，要么成本高昂，要么過(guò)程繁瑣，且不能滿足高通量植物基因CRISPR/Cas9敲除載體構(gòu)建的需求。

還有一種體系是將啟動(dòng)子、sgRNA scaffold和Cas9片段整合到一個(gè)雙元載體，并選用BsaI作為插入位點(diǎn)，但是這種體系的缺陷在于，在兩個(gè)BsaI之間存在SpR(spectinomycin resistance gene壯觀霉素抗性基因)片段，在構(gòu)建過(guò)程中需要Bsa I酶切回收線性化載體，再連接target site(HL Xing,L Dong et al.,2014)。

而本發(fā)明是將水稻OsU3啟動(dòng)子及sgRNA元件與35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的hSpCas9元件直接整合在已經(jīng)突變掉兩個(gè)BspQ I識(shí)別位點(diǎn)的雙元載體pCAMBIA1300DM上，并在sgRAN scaffold元件中選用BspQ I作為靶序列的插入位點(diǎn)，且兩個(gè)BspQ I只間隔7bp堿基，只需要通過(guò)酶切純化獲取線性化載體，再一步連接的方法插入target oligos，實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便、快速和高效的構(gòu)建CRISPR/Cas9基因敲除載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)的單子葉植物基因敲除載體pCambin1300DM-OsU3-Cas9，其具有以下特征：

(1)骨架載體為雙元載體pCAMBIA1300DM，所述雙元載體pCAMBIA1300DM是pCAMBIA1300中原有的2個(gè)BspQI酶切位點(diǎn)gaaGAgc和gcTcttc分別被突變成gaaCTgc和gcActtc的載體；

(2)在所述雙元載體pCAMBIA1300DM上，同時(shí)連入了sgRNA元件和Cas9元件；

(3)所述sgRNA元件由sgRNA啟動(dòng)子、sgRNA-scaffold和靶點(diǎn)插入酶切位點(diǎn)組成；

(4)所述sgRNA啟動(dòng)子為OsU3啟動(dòng)子；

(5)所述靶點(diǎn)插入酶切位點(diǎn)為BspQ I，酶切位點(diǎn)信息為：

BspQ I:GGCAGAAGAGCAACACAAGCTCTTCA(SEQ ID NO：1)(6)所述Cas9元件為2x35S-Cas9-ter，其中2x35S為串聯(lián)的2個(gè)35S啟動(dòng)子，ter為終止子(terminator)，Cas9為編碼基因Cas9的全長(zhǎng)CDS序列并且兩端加有核定位的信號(hào)NLS(Nuclear localization signal)，N端加有Flag標(biāo)簽。

本發(fā)明是將sgRNA結(jié)構(gòu)單元與Cas9基因共同整合到骨架載體pCAMBIA1300DM上的敲除載體pCAMBIA1300DM-OsU3-Cas9，同時(shí)sgRNA結(jié)構(gòu)單元中有BspQI的插入位點(diǎn)，其序列如下：

BspQ I:GGCAGAAGAGCAACACAAGCTCTTCA(SEQ ID NO：1)

本發(fā)明使用的啟動(dòng)子是OsU3啟動(dòng)子，在植物中啟動(dòng)sgRNA scaffold結(jié)構(gòu)的啟動(dòng)子屬于Pol III promoters，包括U3和U6的啟動(dòng)子，而OsU3是單子葉植物中啟動(dòng)效率較高的啟動(dòng)子；同時(shí)選用的限制性酶的插入位點(diǎn)也是一類特征的酶—Type IIs限制性內(nèi)切酶，可選用的酶有AarI、BspQI、BbsI/Bpil、BsmBI/Esp3I、BfuAI/BveI和BsaI/Eco31I，而在本發(fā)明中選用BspQI的插入位點(diǎn)。

本發(fā)明使用pCAMBIA1300DM(原pCAMBIA1300的載體序列上有2處BspQ I酶切位點(diǎn)，為能使BspQ I作為靶位點(diǎn)插入使用的酶切位點(diǎn)，對(duì)傳統(tǒng)的pCAMBIA1300上原有的2處BspQ I酶切位點(diǎn)做了突變，使其成為本身沒(méi)有BspQ I酶切位點(diǎn)的雙元載體，命名為pCAMBIA1300DM)作為骨架載體，將2x35s-Cas9-ter(2x35s：2個(gè)串聯(lián)在一起的35s啟動(dòng)子；Cas9:密碼子優(yōu)化的Cas9酶的CDS序列；ter:終止子序列)及sgRNA元件(使用水稻的OsU3啟動(dòng)子啟動(dòng))連入骨架載體；同時(shí)將BspQ I的酶切位點(diǎn)連入sgRNA元件的靶位點(diǎn)插入處(sgRNA啟動(dòng)子與sgRNA scaffold之間)，構(gòu)建出適用于單子葉植物基因的敲除載體pCAMBIA1300DM-OsU3(BspQ I)-Cas9。

2x35s-Cas9-ter的序列(SEQ ID NO：2)：

CGGTATCGATAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTGATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACCTCGACCTCAACACAACATATACAAAACAAACGAATCTCAAGCAATCAAGCATTCTACTTCTATTGCAGCAATTTAAATCATTTCTTTTAAAGCAAAAGCAATTTTCTGAAAATTTTCACCATTTACGAACGATACTCGAGATGGACTATAAGGACCACGACGGAGACTACAAGGATCATGATATTGATTACAAAGACGATGACGATAAGATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGAAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGTAAGGATCCTGATTGATCGATAGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGG

sgRNAscaffold的序列(SEQ ID NO：3)：

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTT

本發(fā)明基于CRISPR/Cas9技術(shù)的植物基因敲除載體能夠應(yīng)用于植物靶基因的敲除，同時(shí)也能夠以試劑盒的形式應(yīng)用于植物基因編輯。

本發(fā)明的有益效果在于：

1、由BspQ I插入位點(diǎn)組成的sgRNA-OsU3結(jié)構(gòu)序列與2x35s-hSpCas9-ter序列共同構(gòu)建的CRISPR/Cas9植物敲除的雙元載體pCAMBIA1300DM-OsU3(BspQ I)-Cas9，能夠通過(guò)一步酶切連接的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)高效、快速構(gòu)建單子葉植物基因敲除載體的目的。

2、本發(fā)明提供的CRISPR/Cas9敲除載體pCAMBIA1300DM-OsU3(BspQ I)-Cas9，具有打靶效率高、脫靶效率低的特點(diǎn)，本發(fā)明載體的打靶效率高于10％，優(yōu)選達(dá)到60％，特別適合應(yīng)用于植物靶基因的敲除或者以試劑盒的形式運(yùn)用到植物基因編輯中。

附圖說(shuō)明

圖1為單子葉基因敲除載體結(jié)構(gòu)圖—pCAMBIA1300DM-OsU3(BspQ I)-Cas9。

圖2為載體pCAMBIA1300DM的結(jié)構(gòu)圖。

圖3為Gn1a基因的測(cè)序結(jié)果與峰圖。

圖4為OsDEP1基因的測(cè)序結(jié)果與峰圖。

具體實(shí)施方案：

一.單子葉基因敲除載體構(gòu)建：

1.將pOsU3-gRNA載體(中科院遺傳與發(fā)育研究所高彩霞實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng))用Aar I酶切成線性化載體，并經(jīng)CIP(堿性磷酸酶)反應(yīng)后純化。

2.將合成的含有BspQ I的酶切位點(diǎn)的oligos序列進(jìn)行退火磷酸化反應(yīng)。

BspQ I-oligo1:GGCAGAAGAGCAACACAAGCTCTTCA(SEQ ID NO：5)

BspQ I-oligo2:AAACTGAAGAGCTTGTGTTGCTCTTCT(SEQ ID NO：6)

3.將退火磷酸化后的BspQ I插入序列與pOsU3-gRNA線性化載體進(jìn)行T4連接，將BspQ I插入序列連入載體中。挑選陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒(Aar I酶切不開(kāi)的質(zhì)粒)送測(cè)序，所測(cè)得正確的OsU3-sgRNA序列的載體標(biāo)記為pOsU3-gRNA-B，其中OsU3(BspQ I)-sgRNAscaffold結(jié)構(gòu)序列(畫(huà)下劃線的為BspQ I的識(shí)別序列)為(SEQ ID NO：4)：

AAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTTAAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAACACTGGGTACGTCGGAAACCACGTGATGTGAAGAAGTAAGATAAACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGATTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCAGAAGAGCAACACAAGCTCTTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCCACATAATCTCTAGAGGATC.

4.設(shè)計(jì)含有AscI酶切序列的AscI-OsU3-F/R引物并從pOsU3-gRNA-B載體上擴(kuò)增OsU3-sgRNAscaffold片段，

AscI-OsU3-F：5’-TTGGCGCGCCAGGAATCTTTAAACATACGAAC(SEQID NO：7)；

AscI-OsU3-R：5’-TTGGCGCCGATCCTCTAGAGATTATGTGG(SEQ ID NO：8)。

PCR反應(yīng)條件為95℃，30s；65℃，30s；72℃，40s；35cycles。

5.膠回收OsU3-sgRNA scaffold的片段，連入T載體PMD19-T進(jìn)行T/A克隆，并挑取陽(yáng)性克隆送測(cè)序，獲得含有OsU3-sgRNA scaffold結(jié)構(gòu)的PMD19-T載體。

6.酶切獲得AscI-OsU3-sgRNAscaffold片段：直接用AscI限制性內(nèi)切酶從pMD19-T質(zhì)粒上酶切獲得AscI-OsU3-sgRNAscaffold片段。并與已用AscI酶切線性化的pCAMBIA1300DM進(jìn)行T4連接，構(gòu)建pCAMBIA1300DM-OsU3質(zhì)粒，構(gòu)建成功后將質(zhì)粒送去測(cè)序(測(cè)序引物OsU3-F:CCCAAGCTTAGGAATCTTTAAACATACGAAC(SEQ ID NO：9))。

7.從2X35s-hSpCas9質(zhì)粒(中科院上海生命科學(xué)研究院朱健康實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng))上用EcoRI和SalI酶酶切得到2x35s-hSpCas9-ter片段，并進(jìn)行膠回收。同時(shí)用EcoRI和SalI酶切pCAMBIA1300DM-OsU3(BspQ I位點(diǎn))質(zhì)粒，獲得線性化質(zhì)粒。

6.將2x35s-hSpCas9-ter片段連入pCAMBIA1300DM-OsU3線性化質(zhì)粒中，經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑克隆、酶切檢測(cè)和測(cè)序，獲得正確的pCAMBIA1300DM-OsU3-Cas9質(zhì)粒。

實(shí)施例：

一、水稻基因Gn1a敲除載體的構(gòu)建

1.根據(jù)水稻基因Gn1a序列和sgRNA設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)特意的靶序列，序列如下：

Gn1a-oligo1:GGCAGCAGTACCTGCCTTACTA(SEQ ID NO：10)

Gn1a-oligo2:AAACTAGTAAGGCAGGTACTGC(SEQ ID NO：11)

2.將設(shè)計(jì)的targetoligos按如下條件進(jìn)行退火磷酸化過(guò)程：

在PCR管中配制反應(yīng)體系：

在PCR儀上按以下程序完成反應(yīng)過(guò)程：

①37℃30min

②95℃ 5min

③60個(gè)循環(huán)：

95℃—1.3℃/cycle 45s

④4℃保存

3.用BspQ I酶酶切pCAMBIA1300DM-OsU3-Cas9質(zhì)粒，獲取線性化載體，并用CIP酶去做磷酸化處理，以免自連。

4.將退火磷酸化產(chǎn)物稀釋100倍，取2μl與線性化載體進(jìn)行T4連接：

在PCR管中配制連接體系：

16℃連接0.5～1h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中并篩選陽(yáng)性克隆2～4個(gè)送去測(cè)序。成功插入靶位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果為：

AGTTGTGCAGATGATCCGTGGCAGCAGTACCTGCCTTACTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTT(SEQ ID NO：12)

表明水稻基因Gn1a的CRIPSR/Cas9敲除載體構(gòu)建成功。

5.將其敲除載體轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌中，并完成整個(gè)組培過(guò)程，獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性幼苗，并做檢測(cè)驗(yàn)證。

6.目的片段PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果表明在53株轉(zhuǎn)基因水稻中有26株出現(xiàn)突變現(xiàn)象，這表明Gn1a基因的打靶效率為49％，見(jiàn)附圖3。

二、水稻DEP1基因的CRISPR/Cas9敲除載體的構(gòu)建

1.根據(jù)水稻OsDEP1基因序列和sgRNA設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)特意性的靶序列，序列如下：

OsDEP1-oligo1:GGCAGCTGCGGTTGCAACGGCTG(SEQ ID NO：13)

OsDEP1-oligo2:AAACCAGCCGTTGCAACCGCAGC(SEQ ID NO：14)

2.其他步驟與OsPDS基因的載體構(gòu)建過(guò)程一樣。

3.OsDEP1轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的檢測(cè)：利用OsDEP1-F/R引物

OsDEP1-F:5’-GCTGCTCATGCTGTAAACCT-3’(SEQ ID NO：15)

OsDEP1-R:5’-CGTGGGCATCGACAACCCTC-3’(SEQ ID NO：16)

進(jìn)行目的片段PCR擴(kuò)增，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，PCR反應(yīng)條件為95℃，30s；55℃，30s；72℃，40s；35cycles。

4.分析測(cè)序結(jié)果:48株轉(zhuǎn)基因水稻中有19株發(fā)生了不同程度的突變，缺失最多的堿基數(shù)達(dá)30bp，突變頻率為39％，見(jiàn)附圖4。

從這些實(shí)施例可知，本發(fā)明所構(gòu)建的單子葉敲除載體pCAMBIA1300DM(BspQ I)-OsU3-Cas9具有簡(jiǎn)便、快速、高效的優(yōu)點(diǎn)，特別是具有較高的打靶效率和極低的脫靶率。

所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：以上任何實(shí)施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開(kāi)的范圍(包括權(quán)利要求)被限于這些例子；在本發(fā)明的思路下，以上實(shí)施例或者不同實(shí)施例中的技術(shù)特征之間也可以進(jìn)行組合，步驟可以以任意順序?qū)崿F(xiàn)，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡(jiǎn)明它們沒(méi)有在細(xì)節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。