技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種在縮減基因組的枯草芽孢桿菌中表達(dá)黑曲霉葡糖苷酶的方法。

背景技術(shù)：

纖維素是全球最豐富的自然資源之一，纖維素的利用對地球的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。利用宿主表達(dá)纖維素酶，是現(xiàn)在的研究熱點之一。

芽孢桿菌是食用安全菌之一，在芽孢桿菌內(nèi)部表達(dá)纖維素酶，不僅在發(fā)酵生產(chǎn)中能降解纖維素，提高發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量，而且芽孢桿菌是益生菌，不需要通過分離手段除去芽孢桿菌。因此，在芽孢桿菌內(nèi)表達(dá)纖維素酶具有重要意義。

芽孢桿菌在特定環(huán)境下，一些基因的表達(dá)對芽孢桿菌不具有任何意義。因此，敲出芽孢桿菌的非必需基因是提高芽孢桿菌代謝效率的最要手段。

一般在芽孢桿菌內(nèi)部表達(dá)纖維素酶是以整合質(zhì)粒的方式實現(xiàn)的，整合質(zhì)粒整合進(jìn)芽孢桿菌基因組，其中的篩選標(biāo)記或整合的過多基因都成為代謝的負(fù)擔(dān)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種在縮減基因組的枯草芽孢桿菌中表達(dá)黑曲霉葡糖苷酶的方法；本發(fā)明的目的還在于一種表達(dá)黑曲霉葡糖苷酶的枯草芽孢桿菌工程菌。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種在縮減基因組的芽孢桿菌中表達(dá)黑曲霉葡糖苷酶的方法，包括如下步驟：將SEQ ID NO.1所示的DNA序列通過限制性內(nèi)切酶SalI和DNA連接酶連接到載體上構(gòu)建同源重組質(zhì)粒；將所構(gòu)建的同源重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌KCTC1028，篩選同源重組成功的菌株。所述的載體優(yōu)選為pUC18載體。

一種表達(dá)黑曲霉葡糖苷酶的枯草芽孢桿菌工程菌，通過上述方法得到。

本發(fā)明在縮減基因組的枯草芽孢桿菌中表達(dá)葡糖苷酶，不但可以避免所縮減的蛋白對葡糖苷酶表達(dá)的干擾，使葡糖苷酶穩(wěn)定表達(dá)，還使枯草芽孢桿菌的生長速率得到提高。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1

一、材料

質(zhì)粒pUC18、枯草芽孢桿菌KCTC1028、E.coli實驗室保存，限制性內(nèi)切酶購買于Takara。SEQ ID NO.1所示的DNA序列1（包含上游同源臂、啟動子、信號肽編碼序列、葡糖苷酶基因、終止子、下游同源臂）由生物公司合成。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，雙蒸水定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH為7.2。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂。

溶液I：50mmol/L Glucose，25mmol/L Tris-HCI，10mmol/L EDTA。低溫保存。

溶液II：配制2% SDS、0.4mol/L NaOH母液，按照1:1的比例混合，最終得到終濃度為0.2mol/L NaOH、1% SDS。溶液II要現(xiàn)用現(xiàn)配。

溶液III：稱取29.4g乙酸鉀與11.5mL冰醋酸混合，加水溶解，定容至100mL，此步驟應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)完成。低溫保存。

破菌緩沖液：將1g SDS、0.121g Tris、0.585g NaCl、0.037g Na₂EDTA·2H₂O、20mL Triton X-100用水溶解，配制成終濃度為100mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA、2%（v/v）Triton X-100、1%（w/v）SDS的溶液，調(diào)節(jié)pH 8.0。

EB溶液（10mg/mL）：1g嗅化乙錠（EB）溶于100mL去離子水中，磁力攪拌器攪拌至溶解，置于鉛箔包裹的棕色瓶中室溫保存。

TE溶液（pH8.0）：50mmol/L Tris-HC1溶液（pH8.0）200mL和0.5mol/L EDTA溶液（pH8.0）2mL，加水定容至1000mL。

二、方法

1、pUC18質(zhì)粒的提取

（1）含有質(zhì)粒pUC18的大腸桿菌斜面，用接種環(huán)單菌落，接入到裝有5mL LB液體培養(yǎng)基（10μg/mL氨芐霉素）的試管中，于37℃、220 rpm培養(yǎng)過夜。

（2）取1.5mL菌液于離心管中，10000rpm離心2min后棄上清液。向含有菌體的離心管中加入100μL溶液I，漩渦震蕩。再加入200μL溶液II（現(xiàn)用現(xiàn)配），輕輕顛倒混勻，并放于冰上靜置4min。

（3）向上述離心管中繼續(xù)加入150μL溶液III，輕輕顛倒混勻，并放置于冰上3min。

（4）13000rpm離心5min，將上清液400μL轉(zhuǎn)移到另一個離心管中。按照體積比1:1的比例加入酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）400μL，漩渦震蕩混勻后于最大轉(zhuǎn)速下離心8min，吸取上清液到另一個干凈的EP離心管中。

（5）加入40μL 3mol/L NaAC溶液和900μL無水乙醇，上下顛倒混勻，-20℃放置15min。

（6）13000rpm離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管中。

（7）加入1mL 70%乙醇，顛倒幾次，經(jīng)過13000r/m離心5min，棄掉上清液，讓離心管中的酒精和水分緩慢揮發(fā)。

（8）加入50μL TE溶解核酸，漩渦震蕩后保存于-20℃冰箱中。

2、pUC18質(zhì)粒和SEQ ID NO.1所示DNA序列1的酶切、連接

（1）pUC18質(zhì)?；駾NA序列1的酶切

pUC18質(zhì)?；駾NA序列1用限制性內(nèi)切酶SalI酶切。酶切體系如下：雙蒸水34μL，酶切緩沖液4μL，限制性內(nèi)切酶SalI 1.5μL，pUC18質(zhì)?；駾NA序列1 0.5μL。37℃水浴酶切12h。

（2）酶切片段的純化

1）電泳

用0.5×TAE緩沖液配制0.7-1%瓊脂糖凝膠，加熱溶解瓊脂糖，待冷卻至約60℃時，混勻后將膠導(dǎo)入制膠模具中，在室溫下凝固變硬。

輕輕的拔去模具上的梳齒，將瓊脂糖凝膠放如己裝有0.5×TAE緩沖液的電泳槽內(nèi)，使緩沖液液面高于凝膠，凝膠加樣孔一端朝向電泳槽的陰極一端。將DNA樣品和上樣緩沖液以5:1的比例進(jìn)行混勻，然后用移液槍加入脂糖凝膠的加樣孔中，最后在樣品旁邊預(yù)留出來的加樣孔中加入DNA Ladder。加樣完畢后，將電泳槽的上蓋蓋好，電壓設(shè)定為160V，時間為35min左右，點擊開始按鍵。

等電泳結(jié)束后，凝膠在EB溶液中染色10-15min，用凝膠成像儀觀察和分析形成的DNA區(qū)帶。

2）切膠回收

使用上海生工的柱式膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。將需要進(jìn)行分離的DNA片段經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳使目的條帶與雜帶分開。照膠的面板上用手套襯于膠的下方，在護(hù)目屏放置好以后開啟紫外燈，操作時雙手戴乳膠手套。然后使用干凈的蓋玻片切下含有目的DNA條帶的瓊脂糖凝膠塊，放入1.5mL離心管中，稱重。每100 mg瓊脂糖加500μL的比例加入適量的Buffer B2，然后將離心管置于50℃水浴加熱10min，混勻直至膠塊完全溶化。將溶化好的液體全部轉(zhuǎn)移到吸附柱，8000rpm離心30 sec，然后倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。向吸附柱中加入500μL的Wash Solution，9000rpm離心30sec，然后倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。將空吸附柱和收集管放入離心機中，以9000rpm轉(zhuǎn)速離心1min以去除殘余的液體。在吸附膜中央加入50μL預(yù)熱的Elution Buffer，室溫靜置2min，9000rpm離心處理1min。所得到的DNA溶液置于-20℃保存。

（3）酶切片段的連接

連接體系為：酶切回收的DNA序列1 8μL，酶切回收的pUC18質(zhì)粒2μL，T4 DNA連接酶4μL，緩沖液2μL，雙蒸水4μL。漩渦震蕩充分混勻，離心，除去氣泡。連接體系放于22℃的金屬浴上過夜連接，連接產(chǎn)物備用。

3、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

（1）利用接種針挑取平板上的DH5α單菌落，接入到含有5mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃過夜培養(yǎng)。按照 1%（體積比）接種量轉(zhuǎn)接到含有50mLB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在37℃條件下培養(yǎng)5h。

（2）將100mL的聚丙烯離心管放于冰上預(yù)冷，將菌液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的聚丙烯離心管中，然后在冰上放置10min，使離心管中的液體降至0℃。

（3）將離心管放于離心機中，并于4℃、4000rpm離心10min。

（4）在無菌條件下，快速倒出培養(yǎng)液，減少菌體的流失。

（5）將50mL已預(yù)冷的0.1mol/L CaC1₂溶液倒入帶有菌體的100mL離心管中，小心重懸細(xì)胞沉淀，將離心管置于冰上20min。

（6）將離心管放于離心機中，并于4℃、4000rpm離心10min。在無菌條件下，快速倒出培養(yǎng)液，減少菌體的流失。將0℃的0.1mol/L CaCI₂和70%甘油溶液加入到離心管中，使甘油終濃度為20%，重新懸浮菌體放置于冰上。

（7）在無菌條件下將感受態(tài)細(xì)胞分裝到已經(jīng)預(yù)冷的離心管中，每支約為200μL，放置于-80℃冰箱保存。

4、大腸桿菌的轉(zhuǎn)化

（1）從-80℃冰箱中取出已制備好的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，放于冰上5-10min使其融化。

（2）將適量的上述連接產(chǎn)物（DNA量小于100ng）加入到冰浴融化的200μL感受態(tài)細(xì)胞中，用手指輕輕彈勻，放于冰上30min。

（3）將混有DNA的感受態(tài)細(xì)胞的離心管放于42℃金屬浴中，進(jìn)行90秒熱擊，然后快速轉(zhuǎn)移到冰上復(fù)蘇3-5min。

（4）將37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基加入到感受態(tài)細(xì)胞中，震蕩混勻后放于37℃搖床中，培養(yǎng)50min。

（5）培養(yǎng)結(jié)束后，將離心管放于離心機中在6000rpm轉(zhuǎn)速下離心1min，棄掉大部分上清，用剩余培養(yǎng)液約100μL將菌體重懸，涂布于含10μg/mL氨芐霉素的LB平板上。

（6）待平板上的菌液被吸干后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)平板過夜。挑取單菌落培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切、測序鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒命名為pUC18-E。

5、枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和pUC18-E質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

從枯草芽孢桿菌KCTC1028斜面上取一環(huán)菌，接入裝有10mL LB液體培養(yǎng)基的25mL試管中，200 r/m、30 ℃培養(yǎng)16 h。吸取500μL菌液，加入5mL LB液體培養(yǎng)基中，200r/m、37℃培養(yǎng)2h。吸取700μL菌液，加入5mL LB液體培養(yǎng)基中，200r/m、37℃培養(yǎng)1.5h。1.5mL培養(yǎng)的菌液5000r/m離心2min，棄去上層液，加入1.5mL 10%葡萄糖溶液，震蕩重懸菌體，5000r/m離心4min，棄去上層液，加入1.5mL 10%葡萄糖溶液，震蕩重懸菌體，得到感受態(tài)細(xì)胞。

將2μL待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pUC18-E與200μL枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞混勻后在37℃靜置1h。然后37℃、200r/m震蕩培養(yǎng)3h，取40μL菌懸液涂布于含10μg/mL氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)18h左右。生長的單菌落培養(yǎng)后提基因組進(jìn)行PCR鑒定，具體如下：

基因組提?。河靡埔簶岊^挑取平板上的單菌落，接入到裝有5mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，于37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取1mL菌液于EP管中，10000rpm離心1min，棄去培養(yǎng)液。加入200μL的破菌緩沖液、0.3g石英砂，漩渦振蕩3min然后加入0.2mL酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）漩渦震蕩1min左右。加入TE緩沖液0.2mL，漩渦振蕩混勻。在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心8min，用移液槍取上清（大約200μL）至一個潔凈的EP管中。向上清液中加入20μL 3M NaAC和900μL無水乙醇，然后置于-20℃靜置30min。將離心管于13000rpm離心5min，棄上清。加入70%乙醇1mL，洗滌沉淀，12000rpm離心8min，棄上清，基因組DNA自然風(fēng)干。

PCR鑒定所用引物：正向引物：AGCTTACTCCAGAGTTATGTATTA，反向引物：GCTATTTCACCTCAACATTAAAGTAG。正反向引物在枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株之間的距離有100kb以上；若正反向引物之間的基因組被敲除置換成葡糖苷酶基因，PCR產(chǎn)物為6kbp左右。

PCR反應(yīng)體系為：10×Buffer 5μL，dNTPs 5μL，正向、反向引物（10pM）各2μL，基因組1μL，DNA聚合酶1μL，ddH₂O補至50μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃ 10min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸8min，30個循環(huán)；72℃延伸20 min。

所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，片段長度在6kb左右的為目標(biāo)轉(zhuǎn)化子，片段長度大于6kb的為非目標(biāo)轉(zhuǎn)化子。所篩選得到的目標(biāo)轉(zhuǎn)化子命名為BS231菌株。

6、BS231菌株葡糖苷酶酶活的測定

將BS231菌株接種于LB斜面37℃培養(yǎng)24h左右，再用接種環(huán)挑取菌落接種至裝有30mL LB液體培養(yǎng)基的50mL三角瓶中，100r/m、37℃培養(yǎng)24h左右。取培養(yǎng)液測定葡糖苷酶酶活，酶活為1.68U/mL。該結(jié)果進(jìn)一步表明，葡糖苷酶基因成功置換了枯燥芽孢桿菌的大片段基因組，使枯燥芽孢桿菌能夠表達(dá)葡糖苷酶。

葡糖苷酶酶活測定方法，參照文獻(xiàn)（張立霞等，纖維素分解菌的篩選及其不同組合對秸稈降解的效果。飼料工業(yè)，2013年22期）。

7、BS231菌株生長速率的測定

取出保藏的菌種枯燥芽孢桿菌出發(fā)菌株或構(gòu)建的基因工程菌株BS231，利用接種針在LB平板固體培養(yǎng)基上劃線，培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，待長出單菌落以后，將平板上的單菌落挑出轉(zhuǎn)接到5mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm培養(yǎng)12h。然后以2%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有50mL LB液體培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，在37℃的搖床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速控制在220rpm，菌體生長8h時，測定菌液的OD₆₀₀。出發(fā)菌株的OD₆₀₀為0.86，BS231菌株的OD₆₀₀為0.91，表明所構(gòu)建的基因工程菌能更快速的生產(chǎn)，同時產(chǎn)生葡糖苷酶。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。