本發(fā)明屬于基因工程技術領域，涉及優(yōu)化信號肽以提高重組腦膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表達的方法。

背景技術：

腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis，Nm)是一種致病性革蘭氏陰性菌，主要引起兒童細菌性腦脊髓膜炎和敗血癥，是嚴重威脅人類健康的病原體，致病性腦膜炎球菌主要有A、B、C、Y、W135五個血清群，其中A、C、Y、W135群以莢膜多糖為抗原研制出了有效的疫苗來預防相應血清型腦膜炎奈瑟菌所引發(fā)的腦膜炎，但是由于B型腦膜炎球菌莢膜多糖和人神經(jīng)細胞的粘附分子同源，免疫原性很低，不適合用于疫苗的制備，因此，B群腦膜炎奈瑟菌的非莢膜多糖抗原疫苗研制也就成為了關注的重點。

目前有一些候選抗原如外膜囊泡、外膜蛋白比較受到關注，其中外膜脂蛋白2086(LP2086)又稱H因子結合蛋白(Factor H-binding Protein,fHBP)，是一個分子量為28KD的保守蛋白，表達于所有腦膜炎奈瑟菌表面且能夠產(chǎn)生殺菌抗體而成為了最有希望的抗原。H因子(fH)是補體替代途徑的關鍵調節(jié)子，它在因子I介導的C3b裂解為滅活片段iC3b過程中發(fā)揮輔助因子作用，也促進替代途徑c3轉化酶C3bBb的衰變。fH通過和fHBP結合可下調補體的激活性以逃避補體介導的殺傷作用。通過fH與細菌表面結合這個重要機制，病原體在未經(jīng)免疫的人血清或血液中存活并逃避先天性宿主防御。在疫苗中加入fHBP成分也許可以收到雙重的功效，它不僅可以誘發(fā)殺菌的抗體，還可以通過阻斷fH結合到細菌表面來提高細菌對宿主殺傷作用的敏感性。Novartis公司以fHBP、NadA和PorA免疫原組成的4CmenB疫苗于2013年11月被歐盟批準用于2個月以上的人群使用，Pfizer公司由兩種fHBP變體型組成的B群腦膜炎疫苗于2014年10月通過美國FDA批準用于10至25歲人群。但由于腦膜炎球菌僅表達微量的fHBP蛋白，通過在大腸桿菌中以重組蛋白的形式表達fHBP能夠在一定程度上增加其表達量，然而重組蛋白形式的fHBP的表達量依然較低，不能獲得足夠的蛋白滿足后續(xù)研發(fā)需求，所以提高其表達效率以滿足研究和生產(chǎn)的需要的關鍵。

技術實現(xiàn)要素：

鑒于目前技術存在的上述不足，本發(fā)明提供提高重組腦膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表達的方法，本發(fā)明通過分別更換了P4外膜蛋白(Haemophilus influenza P4protein，P4)信號肽、脂蛋白-28(lipoprotein-28，LP)信號肽和主要外膜脂蛋白信號肽(major outer membrane lipoprotein，MLP)的重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP，表達量較帶原始信號肽的B群腦膜炎奈瑟菌fHBP相比分別提高了2.68+0.32、1.94+0.17和2.91+0.25倍，較好解決了fHBP蛋白表達量低的問題，為重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP蛋白的工藝研發(fā)及疫苗應用奠定了基礎。

此外，令人驚訝地，我們發(fā)現(xiàn)了用主要外膜脂蛋白信號肽替換原始信號肽比目前可用的最佳的外源信號肽P4外膜蛋白信號肽取得了更好的效果。

本發(fā)明的采用如下技術方案：

優(yōu)化信號肽提高重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表達的方法，包括以下步驟：

帶不同外源信號肽fHBP表達質粒的構建；

基于不同外源信號肽對fHBP蛋白表達的影響。

作為本發(fā)明的優(yōu)選技術方案，所述質粒構建的步驟包括：

提取29315株B群腦膜炎球菌基因組，以其為模板，采用引物w468、w469PCR擴增fHBP目的基因；

通過NdeI/EcoRI核酸內切酶對目的基因及pET-30a質粒進行雙酶切，并連接獲得帶自身信號肽的pET30-rBfHBP質粒，測序驗證目的基因正確性；

以pET30-rBfHBP質粒為模板，采用引物w482、w488擴增出的目的基因，再次以引物w483、w488進行PCR擴增獲得5’端帶有P4信號肽序列的fHBP目的基因。

作為本發(fā)明的優(yōu)選技術方案，所述質粒構建的步驟還包括：

以pET30-rBfHBP質粒為模板，分別采用引物w484、w488及w485、w488經(jīng)過兩次PCR，獲得5’端帶有LP信號肽的fHBP目的基因；

以pET30-rBfHBP質粒為模板，采用w486、w488及w487、w488經(jīng)過兩次PCR擴增，獲得帶有MLP信號肽序列的fHBP目的基因；

將上述帶不同信號肽的fHBP目的基因片段與pET-30a質粒采用NdeI/BamHI進行雙酶切，并連接分別獲得帶P4、LP、MLP信號肽的fHBP原核表達質粒pET30a-P4SP-rBfHBP、pET30a-LPSP-rBfHBP、pET30a-MLPSP-rBfHBP，并測序驗證其正確性。

作為本發(fā)明的優(yōu)選技術方案，所述確定fHBP蛋白誘導表達條件的步驟包括：

將帶自身信號肽的pET30-rBfHBP表達質粒轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，通過IPTG誘導表達來確定fHBP蛋白表達條件。確定表達條件為水平搖床中，以37℃，180rpm，細菌對數(shù)生長期OD600＝0.6時加入終濃度為0.1mM的IPTG誘導2h。

將帶P4、LP、MLP三種外源信號肽的pET30a-P4SP-rBfHBP、pET30a-LPSP-rBfHBP、pET30a-MLPSP-rBfHBP表達質粒分別轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑取單克隆，以上述條件進行誘導表達篩選表達工程菌株，；

將表達不同外源信號肽的fHBP工程菌株分別各挑取三個克隆，利用相同條件再次進行誘導，SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達水平。

本發(fā)明的優(yōu)化信號肽提高重組腦膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表達的方法具有以下優(yōu)點：1、在相同條件下，更換了P4外膜蛋白信號肽、脂蛋白-28信號肽和主要外膜脂蛋白信號肽的重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP表達量較帶原始信號肽的B群腦膜炎奈瑟菌fHBP相比分別提高了2.68+0.32、1.94+0.17和2.68+0.32倍；2、提供了能夠提高fHBP蛋白表達量的信號肽，為提高B群腦膜炎奈瑟菌fHBP表達的研究及應用提供了一種新的思路。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為帶不同信號肽的fHBP蛋白誘導表達結果本發(fā)明中帶不同信號肽fHBP蛋白的表達質粒轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，在OD600＝0.6時加入0.1mM終濃度的IPTG分別誘導2h的蛋白表達情況，泳道1：蛋白marker；泳道2、3：無IPTG及加入IPTG誘導后帶自身信號肽fHBP蛋白表達情況；泳道4、5：無IPTG及加入IPTG誘導后帶P4信號肽fHBP蛋白表達情況；泳道6、7：無IPTG及加入IPTG誘導后帶LP信號肽fHBP蛋白表達情況；泳道8、9：無IPTG及加入IPTG誘導后帶MLP信號肽fHBP蛋白表達情況。

圖2為不同克隆的帶不同信號肽fHBP蛋白表達結果本發(fā)明中將表達帶外源信號肽工程菌株，分別挑取三個不同的克隆在OD600＝0.6時加入0.1mM終濃度的IPTG分別誘導2h蛋白表達情況，泳道1：帶自身信號肽fHBP蛋白表達情況；泳道2-4：不同克隆的帶P4信號肽fHBP蛋白表達結果；泳道5-7：不同克隆的帶LP信號肽fHBP蛋白表達結果；泳道8-10：不同克隆的帶MLP信號肽fHBP蛋白表達結果。

圖3為帶不同信號肽fHBP蛋白的相對表達量比較本發(fā)明中帶不同外源信號肽的fHBP蛋白相對帶自身信號肽fHBP蛋白表達量大小比較的圖譜，其中帶自身信號肽的fHBP蛋白相對表達量為1.00，帶P4信號肽的fHBP蛋白相對表達量為2.68+0.32,帶LP信號肽的fHBP蛋白相對表達量為1.94+0.17,帶MLP信號肽的fHBP蛋白相對表達量為2.91+0.25。

具體實施方式

下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

在本發(fā)明中，圖1和圖2為相同誘導條件下，帶不同信號肽的fHBP表達量比較,圖3為帶不同信號肽的fHBP相對表達量。具體情況參照以下實施例。

本發(fā)明提供的不同信號肽對重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表達的方法，包括以下步驟，

步驟S1：質粒構建，其中包括步驟S1a：采用Axygen試劑盒提取29315株B群腦膜炎球菌(購自中國醫(yī)學細菌保藏管理中心)基因組，以B群腦膜炎球菌基因組為模板，采用引物w468、w469(表2)PCR擴增fHBP目的基因；步驟S1b：通過NdeI/EcoRI對目的基因及pET-30a進行雙酶切，連接獲得帶自身信號肽的pET30-rBfHBP質粒并測序驗證目的基因正確性；步驟S1c：以pET30-rBfHBP質粒為模板，采用引物w482、w488擴增出的目的基因，再次以引物w483、w488進行PCR擴增獲得5’端帶有P4信號肽序列的fHBP目的基因；

步驟S1d：以pET30-rBfHBP質粒為模板，分別采用引物w484、w488及w485、w488經(jīng)過兩次PCR獲得5’端帶有LP信號肽的fHBP目的基因，以pET30-rBfHBP質粒為模板，采用w486、w488及w487、w488經(jīng)過兩次PCR擴增獲得帶有MLP信號肽序列的fHBP目的基因；將帶不同信號肽的fHBP目的基因片段與pET-30a采用NdeI/BamHI進行雙酶切，連接獲得帶P4、LP、MLP信號肽的fHBP原核表達質粒pET30a-P4SP-rBfHBP、pET30a-LPSP-rBfHBP、pET30a-MLPSP-rBfHBP，并測序驗證其正確性。

進一步為，將pET30a-rBfHBP、pET30a-P4SP-rBfHBP、pET30a-LPSP-rBfHBP、pET30a-MLPSP-rBfHBP四個表達載體轉化至BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細胞進行重組蛋白的表達。

表1不同信號肽堿基序列

步驟S2：確定fHBP蛋白誘導表達條件：其中包括步驟S2a：將帶自身信號肽的fHBP蛋白基因序列連接到載體pET-30a，其質粒轉化進入BL21(DE3)感受態(tài)細胞進行表達來確定fHBP蛋白誘導表達條件。大腸桿菌在誘導前實時檢測其OD值，分別取OD600值為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0的時間點加入1mM終濃度的IPTG進行誘導4h，SDS-PAGE電泳比較不同OD值時誘導蛋白的表達情況，確定最優(yōu)誘導OD值。根據(jù)最優(yōu)誘導OD值，調整IPTG濃度，按照終濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0進行誘導4h，SDS-PAGE電泳比較不同濃度IPTG對目的蛋白表達量的影響，確定最佳IPTG濃度。再根據(jù)最佳誘導OD值和IPTG濃度，分別誘導2h、4h、6h、8h，SDS-PAGE電泳比較不同誘導時間對目的蛋白表達量的影響，確定最適誘導時間

表2構建質粒引物序列

通過對帶自身信號肽的fHBP蛋白進行表達條件的優(yōu)化，在37℃，180rpm條件下獲得最佳誘導條件為在細菌對數(shù)生長期(OD600＝0.6)加入終濃度為0.1mM的IPTG誘導2h獲得最高表達量。但即使在最佳誘導條件下，帶自身信號肽的fHBP蛋白表達量依然不是很高，成為后續(xù)蛋白純化及疫苗研發(fā)實驗的瓶頸。

步驟S4：基于不同外源信號肽對fHBP蛋白表達的影響，其中包括步驟S4a：將帶P4、LP、MLP三種外源信號肽的fHBP蛋白表達質粒轉化后，分別挑取克隆，鑒定無誤后，進行誘導表達；步驟S4b：將三種帶外源信號肽質粒轉化的BL21感受體細胞，分別挑取三個不同的克隆，利用相同條件再次進行誘導，SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達水平。

具體為，將帶P4、LP、MLP三種外源信號肽的fHBP蛋白表達質粒轉化如BL21(DE3)后，分別挑取克隆，鑒定無誤后，進行誘導表達。37℃、180rpm于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600＝0.6，加入0.1mM終濃度的IPTG繼續(xù)37℃、180rpm誘導2h，SDS-PAGE電泳鑒定蛋白表達水平。使用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)對目的蛋白進行相對定量，將帶自身信號肽的fHBP的相對表達量定為1.00，則帶P4信號肽fHBP的相對表達量為2.03，帶LP信號肽fHBP的相對表達量為1.48，帶MLP信號肽fHBP的相對表達量為2.06(圖1)。這些結果表明，本實驗的三種外源信號肽替換原信號肽都能夠不同程度地增加fHBP蛋白的表達量，且增加蛋白表達量水平由高到低依次為：MLP信號肽、P4信號肽、LP信號肽。

由于P4信號肽與MLP信號肽對fHBP蛋白表達增加水平相差較小，為了進一步比較這兩種信號肽的效果同時進一步驗證結果的可靠性，三種帶外源信號肽質粒轉化的BL21(DE3)大腸桿菌分別挑取三個不同的克隆，利用相同條件再次進行誘導，SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達水平(圖2)。使用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)進行相對定量，將帶自身信號肽的fHBP相對表達量定為1.00，則帶P4信號肽三個克隆的fHBP相對表達量分別為2.59、2.72、2.36，帶LP信號肽的三個克隆的fHBP相對表達量為1.77、2.09、1.95，帶MLP信號肽的三個克隆的fHBP相對表達量為2.75、3.16、2.82(圖3)。結果表明MLP信號肽增加fHBP蛋白表達程度最高。

在本發(fā)明中，fHBP蛋白作為腦膜炎球菌疫苗的重要抗原而備受關注，但是fHBP蛋白表達于腦膜炎球菌膜表面，由于空間位置有限，表達具有飽和性，因此限制了抗原的產(chǎn)量，難以純化獲得足夠量的蛋白作為疫苗抗原。因此在大腸桿菌中表達重組蛋白成了一個可行的策略，重組蛋白表達量的高低直接關系到后續(xù)疫苗的研發(fā)乃至最終的經(jīng)濟效益及社會效益。在大腸桿菌表達的重組蛋白產(chǎn)量較腦膜炎球菌自身表達的蛋白有了極大的提高，但是相比其他重組蛋白，fHBP重組蛋白的表達量還是很低，給后續(xù)的純化帶來一定難度，因此需要通過其他策略來增加其表達量。改造信號肽是一種有效增加重組蛋白表達量的方式，采用外源信號肽替換fHBP自身信號肽，在重組蛋白表達過程中引導蛋白加工分泌，從而獲得具有生物活性的重組蛋白。輝瑞公司通過將B群腦膜炎球菌fHBP蛋白自身信號肽替換為流感嗜血桿菌P4信號肽后，fHBP蛋白表達量有所提高。為了將fHBP蛋白自身信號肽替換為外源信號肽，一般將外源信號肽堿基序列添加在正向引物的5’端，但是本實驗中需要添加的信號肽堿基序列長約60bp，若直接將其添加至引物5’端給引物的合成及PCR帶來一定難度，因此采用了兩輪PCR擴增，每輪PCR擴增使正向引物帶上部分信號肽序列，最終獲得帶完整外源信號肽的fHBP基因。將B群fHBP蛋白自身信號肽替換為大腸桿菌主要膜蛋白(MLP)信號肽及脂蛋白(LP-28)信號肽后，與fHBP自身信號肽進行比較，均增加了蛋白的表達量，同時替換為MLP信號肽后fHBP的表達量比替換為P4信號肽表達量還略高(表3)，這表明MLP很可能是另一個能夠增加fHBP表達量且能運用于研發(fā)的信號肽。

表3不同信號肽氨基酸序列及其對fHBP蛋白表達的影響

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本領域技術的技術人員在本發(fā)明公開的技術范圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。因此，本發(fā)明的保護范圍應以所述權利要求的保護范圍為準。