專利名稱：一種利用rna恒溫?cái)U(kuò)增的淋病奈瑟菌核酸檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用磁珠-RNA富集技術(shù)提取純化 靶標(biāo)RNA及恒溫核酸同步放大檢測技術(shù)(SAT)對(duì)淋病奈瑟菌(NG)進(jìn)行檢測的試劑盒。
背景技術(shù)：
淋病奈瑟菌(We/Mm'a Go"ct7^om， NG)是一種在人體內(nèi)長期生存并又廣泛傳播的病原 體，呈圓形、卵圓形或腎形，大小一致，無鞭毛、無莢膜、不存在芽孢，在膿液中成對(duì)排 列于膿細(xì)胞(多核白細(xì)胞)的胞漿內(nèi)或其外圍(少數(shù)分布在細(xì)胞外)，故名淋病雙球菌， 鄰近面扁平或略凹陷，大小為0.6umX0.8um (0.5umX0.7um)。淋球菌感染引起的臨 床表現(xiàn)取決于感染的程度，機(jī)體的敏感性，細(xì)菌的毒力，感染部位及感染時(shí)間的長短。同 時(shí)和身體的健康狀況。淋球菌感染其潛伏期短、傳染性強(qiáng)，最常見的是有癥狀的泌尿生殖 系統(tǒng)的感染，如尿道炎、宮頸炎、附睪炎、前列腺炎、輸卵管炎等，如不及時(shí)治療，淋球 菌可侵犯眼睛、咽部、皮膚、直腸、盆腔等部位，甚至可經(jīng)血液傳播到全身其他部位，形 成淋菌性關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎、腦膜炎、敗血癥等。另一方面，有5% 20%的男性和60%的女 性病人呈現(xiàn)出無癥狀感染。因而，淋球菌的實(shí)驗(yàn)室檢測對(duì)淋病的臨床輔助診斷具有重要作 用。目前淋病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有細(xì)胞生物學(xué)檢測方法(如培養(yǎng)法，涂片檢查)；免疫學(xué) 檢測方法(如直接免疫熒光、固相酶免測定)和分子生物學(xué)方法(如PCR、 TMA)。
細(xì)胞生物學(xué)檢測方法包括涂片檢查和培養(yǎng)法。雙球菌涂片對(duì)有大量膿性分泌物的單純 淋菌性前尿道炎患者，此法陽性率在90%左右，由于女性宮頸分泌物中雜菌多，敏感性和 特異性較差，陽性率僅為50-60%且有假陽性，因此世界衛(wèi)生組織推薦用培養(yǎng)法檢査女病人。 淋球菌培養(yǎng)是診斷的重要佐證，培養(yǎng)法對(duì)癥狀很輕或無癥狀的男性、女性病人都是較敏感 的方法，特異性為100%，只要培養(yǎng)陽性就可確診。在基因診斷問世以前，培養(yǎng)是世界衛(wèi) 生組織推薦的篩選淋病的唯一方法。培養(yǎng)陽性率男性80% 95%，女性80 90%。培養(yǎng)法 的陽性率大于涂片法，后者對(duì)女性淋病尤其是無癥狀帶菌者檢出率較低，容易漏診。由于 約50%的女性淋病患者都沒有明顯癥狀，因此女性淋病的實(shí)驗(yàn)室檢查主要依靠培養(yǎng)法。與 男性淋病患者有過性接觸的女性，應(yīng)每周做1次宮頸分泌物涂片和培養(yǎng)，連續(xù)3次，都是 陰性者才能排除。
免疫學(xué)方法包括固相酶免疫試驗(yàn)(EIA)和直接免疫熒光試驗(yàn)。固相酶免疫試驗(yàn)(EIA) 可用來檢測臨床標(biāo)本中的淋球菌抗原，在流行率很高的地區(qū)而又不能作培養(yǎng)或標(biāo)本需長時(shí) 間遠(yuǎn)送時(shí)使用，可以在婦女人群中用來診斷淋球菌感染。直接免疫熒光試驗(yàn)通過檢測淋球菌外膜蛋白I的單克隆抗體作直接免疫熒光試驗(yàn)。但目前在男女二性標(biāo)本的敏感不高，特異 性差，加之實(shí)驗(yàn)人員的判斷水平，故該實(shí)驗(yàn)尚不能推薦用來診斷淋球菌感染。
分子生物學(xué)方法主要包括PCR法、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA法)，此類方法對(duì)于診斷泌 尿生殖道淋病奈瑟菌感染敏感性和特異性均達(dá)90X 100X。PCR屬于一種核酸體外擴(kuò)增技 術(shù)，用寡核苷酸指導(dǎo)的DNA合成的重復(fù)循環(huán)來實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸序列的擴(kuò)增。PCR技術(shù)不但能 檢測尿道或?qū)m頸拭子標(biāo)本，而且可以采用尿標(biāo)本進(jìn)行檢測。但尿中可能存在擴(kuò)增的抑制物， 從而影響PCR的敏感性。除了尿中的抑制物會(huì)影響PCR的敏感性，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果外， PCR的另外一個(gè)缺點(diǎn)是容易造成假陽性污染，并且對(duì)用藥后康復(fù)的病人檢測結(jié)果仍出現(xiàn)陽 性結(jié)果。目前國內(nèi)市場上的核酸檢測試劑盒主要是PCR-熒光檢測試劑盒。TMA法 (Transcription-mediatedAmplification,轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)最新發(fā)展的擴(kuò)增試驗(yàn)是 Gen-Probe公司的擴(kuò)增NG的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增試驗(yàn)(TMA)，擴(kuò)增并檢測NG的rRNA。 TMA的 一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是每個(gè)感染細(xì)胞中有大量的rRNA，而且操作步驟簡便，只是一個(gè)恒溫過程，不需 要變換溫度的擴(kuò)增儀。檢測方法是終點(diǎn)熒光檢測，容易導(dǎo)致環(huán)境污染，在污染控制上稍顯 不足。國內(nèi)尚無采用該法進(jìn)行檢測的報(bào)道。
本公司已申請(qǐng)了專利核酸恒溫同步放大檢測方法(Simultaneous Amplification and Testing, SAT)(申請(qǐng)?zhí)?00810111479.0)以及利用磁珠-RNA富集技術(shù)提取純化靶標(biāo)RNA 的方法(申請(qǐng)?zhí)?00810111478.6);在此兩項(xiàng)技術(shù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明淋病奈瑟菌(NG)核 酸檢測試劑盒采用的是SAT技術(shù)，核酸擴(kuò)增使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA多聚酶來同 時(shí)實(shí)現(xiàn)，反轉(zhuǎn)錄酶用于產(chǎn)生靶標(biāo)核酸(RNA)的一個(gè)DNA拷貝，T7RNA多聚酶從DNA 拷貝上產(chǎn)生多個(gè)RNA拷貝，帶有熒光標(biāo)記的優(yōu)化探針和擴(kuò)增后產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合， 從而產(chǎn)生熒光，該熒光信號(hào)可由檢測儀器捕獲。該試劑盒能夠檢測拭子和尿樣中的NG rRNA，具有特異性高、靈敏度高和污染低(擴(kuò)增產(chǎn)物RNA在自然環(huán)境下易于降解)的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)特異性、靈敏性不高，實(shí)驗(yàn)污染不易控制 的缺點(diǎn)，提供一種利用磁珠-RNA富集技術(shù)提取純化靶標(biāo)RNA及恒溫核酸同步放大檢測技 術(shù)(SAT)對(duì)淋病奈瑟菌(NG)進(jìn)行檢測的試劑盒。
本發(fā)明所提供的淋病奈瑟菌檢測的試劑盒，包括下列組成 (1)尿樣保存液為裂解和保存尿液或生殖道拭子洗滌液標(biāo)本中淋病奈瑟菌(NG)RNA的表面活性劑和HEPES緩沖液；
(2) 核酸提取液為oligodT包被的磁珠和特異性結(jié)合靶標(biāo)核酸(NGRNA)的一段 RNA序列；
(3) 洗滌液為含SDS、 NaCl和乙醇的溶液；
(4) NG反應(yīng)液為dNTPs和NTPs等擴(kuò)增所需組份；
(5) NG檢測液為恒溫?cái)U(kuò)增時(shí)必需的引物和熒光探針，序列選自NG16srRNA基因 的保守區(qū)；
(6) SAT酶液為恒溫?cái)U(kuò)增時(shí)必需的多酶組分體系，含的T7 RNA聚合酶、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶及穩(wěn)定劑；
(7) NG陽性對(duì)照；為含NG16srRNA基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；
(8) NG陰性對(duì)照為不含任何核酸的尿樣保存液及生理鹽水。 尿樣保存液主要有效成分是硫酸銨和去垢劑，高濃度去垢劑的存在能夠使RNase迅速失活，有效保存RNA。另外，尿樣保存液中高濃度鹽離子及去垢劑的存在，通過蛋白質(zhì)變 性使菌體細(xì)胞破裂，靶標(biāo)RNA得到了釋放，樣本放在該保存液中，延長了樣本的保存時(shí) 間，RNA從細(xì)胞中釋放出來。
核酸提取液是利用了磁珠分離法進(jìn)行核酸提取，其主要成分為磁性顆粒和捕獲探針。 在核酸提取過程中，細(xì)菌裂解釋放出的核酸與核酸提取液中的磁性顆粒特異結(jié)合，在不需 要傳統(tǒng)的離心操作的情況下，通過清洗磁性顆粒而獲得純凈的細(xì)菌靶標(biāo)核酸(RNA)。病 原體rRNA的提取通過特異性吸附原理來實(shí)現(xiàn)。
核酸提取液中含有的標(biāo)本提取捕獲探針，包含有以下一種或幾種序列序列見序列表 SEQ.ID.N01-5。
SAT酶液中所含的T7RNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，其穩(wěn)定性直接決定了擴(kuò)增反 應(yīng)的擴(kuò)增效率和試劑盒的使用有效期。該SAT酶液中加有穩(wěn)定劑，經(jīng)長期穩(wěn)定性試驗(yàn)，穩(wěn) 定性可達(dá)10個(gè)月，保證了試劑盒有效期達(dá)6個(gè)月。
NG檢測液中NG熒光探針為分子信標(biāo)，是一類高特異性、高敏感性的分子探針，由 兩端分別共價(jià)標(biāo)記有熒光染料和淬滅劑的單鏈核酸分子組成，呈發(fā)夾型或莖環(huán)結(jié)構(gòu)，分子 信標(biāo)的環(huán)部分和靶標(biāo)互補(bǔ)，兩頭由于互補(bǔ)而成為莖，分子信標(biāo)探針與線性的TaqMan探針 相比，因其發(fā)夾結(jié)構(gòu)的打開需要一定的力，因而特異性要好于線性探針。NG檢測液中NG 引物，依照SAT擴(kuò)增的原理設(shè)計(jì)了 5'端帶有T7啟動(dòng)子序列尾巴的下游引物和特異的上 游引物，下游引物特異序列與靶標(biāo)完全互補(bǔ)，上游引物與靶標(biāo)完全一致，保證了本試劑盒可準(zhǔn)確進(jìn)行NG檢測的SAT反應(yīng)。
NG檢測液中的引物包含有以下一對(duì)或幾對(duì)序列 NGT7:序列見序列表SEQ.ID.NO6-10; NGnT7:序列見序列表SEQ.ID.N011-15。 NG檢測液中的探針包含有以下一種或幾種序列 NG probe:序列見序列表SEQ.ID.NO 16-20。
由于SAT擴(kuò)增易受多種因素影響而使擴(kuò)增失敗，使試劑盒使用人員判斷失誤得出錯(cuò)誤 的結(jié)論，本發(fā)明的試劑盒中的NG陽性對(duì)照和NG陰性對(duì)照，均含有本試劑盒己述及的尿 樣保存液及生理鹽水，其中NG陽性對(duì)照還含有NGRNA，是淋病奈瑟菌16srRNA體外轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物的稀釋物，定值約為107COpies/ml。使用本試劑盒時(shí)，每次應(yīng)同時(shí)做平行對(duì)照的質(zhì)量 控制，且結(jié)果應(yīng)同時(shí)滿足陽性對(duì)照dt《35，陰性對(duì)照dt無數(shù)值或?yàn)?0，否則此次實(shí)驗(yàn)視 為無效。(dt表示樣本曲線與閾值線交點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù)，與一般實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的 ct值類似。)
NG陽性對(duì)照中的體外轉(zhuǎn)錄的NG RNA，可以通過多種方法制備所得，其中一種制備 方法如下
(1) 用化學(xué)合成法合成NG16srRNA基因的耙標(biāo)片段，長度約卯0bp;
(2) 將片段克隆到pGEMb-T載體中，構(gòu)建NG陽性對(duì)照質(zhì)粒；
(3) NG陽性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a中，命名為pGEMb-T-NG菌株，貯存 于-70。C;
(4) 純化去除DNA，并定量、鑒定RNA。
NG陽性對(duì)照含有長約900bp的NG 16s rRNA基因序列，序列見序列表SEQ.ID.N021 。 本發(fā)明的檢測試劑盒檢測NG RNA的分析靈敏度為1(^copies/反應(yīng)(淋病奈瑟菌1個(gè) 菌內(nèi)約含2.0Xl()S個(gè)rRNA)，該靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前國內(nèi)上市的同類產(chǎn)品，故本發(fā)明的檢 測試劑盒特異性高、靈敏度高，且擴(kuò)增產(chǎn)物RNA在自然環(huán)境下易于降解而污染低。本發(fā) 明試劑盒可用于尿液標(biāo)本的檢測，這種非侵入性采樣方式受到病人的歡迎。


圖l.實(shí)施例4本發(fā)明試劑盒檢測病人拭子標(biāo)本的擴(kuò)增圖； 圖2.實(shí)施例5本發(fā)明試劑盒檢測病人尿液標(biāo)本的擴(kuò)增圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限 定的范圍。實(shí)施例1 NG核酸RNA的提取核酸提取具體步驟為在樣品處理管(1.5 ml離心管)中加入100lU核酸提取液，加入400ul尿樣或者拭 子洗液，每加一個(gè)樣本換一個(gè)吸頭，渦旋混勻；6(TC保溫5分鐘；室溫放置10分鐘；將樣品處理管置于磁珠分離裝置上，靜置5分鐘(如果在磁珠吸附過程中有個(gè)別磁珠 難以吸附至管壁則應(yīng)適當(dāng)延長吸附時(shí)間)；待磁珠吸附于管壁后，保持樣品處理管于磁珠分離裝置上，吸棄液體，保留磁珠；用洗滌液(洗滌液如果有白色絮狀沉淀物，用之前應(yīng)先42'C加熱，直至澄清)洗滌 兩次，每次加入lml洗滌液后取下樣品處理管震蕩30秒后置磁珠分離裝置上，靜置5分 鐘；保持樣品處理管于磁珠分離裝置上，吸棄液體，保留磁珠；將樣品處理管移離磁珠分離裝置，管中的磁珠-核酸復(fù)合物備用(此步應(yīng)清晰可見磁珠)；向每個(gè)樣品處理管中加入40 ix 1擴(kuò)增檢測液(40 !i 1 NG反應(yīng)液+2.5 ^ 1 NG檢測液) 洗滌磁珠。實(shí)施例2 SAT核酸擴(kuò)增檢測從震蕩混勻后的上述擴(kuò)增檢測液中取30ul擴(kuò)增檢測液(包含磁珠)至潔凈微量反應(yīng) 管，6(TC保溫10分鐘，42'C保溫5分鐘；同時(shí)將SAT酶液也預(yù)熱到42'C;向微量反應(yīng)管中加入10ul已預(yù)熱的酶液(加樣tip頭不要接觸微量反應(yīng)管，如有接觸 請(qǐng)務(wù)必更換tip頭)，加酶后蓋上管蓋1200rpm震蕩15秒鐘混勻；將微量反應(yīng)管快速轉(zhuǎn)至合適的恒溫?zé)晒鈾z測儀器，42°C反應(yīng)40分鐘，設(shè)定每l分鐘 檢測一次熒光，共檢測40次；反應(yīng)結(jié)束后，直接將微量反應(yīng)管取出浸泡于10% 84消毒液中，取微量反應(yīng)管應(yīng)小心 操作，嚴(yán)禁打開反應(yīng)管(防止污染反應(yīng)區(qū))！實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用10%84消毒液清潔工作區(qū)及用 具，最后用清水擦拭干凈。參考值1. 閾值設(shè)定以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。2. dt《35的樣本為陽性；3. 35<也<40的樣本建議重新檢領(lǐng)||，檢測結(jié)果dt〈40的樣本為陽性；4. dt無數(shù)值或?yàn)?0的樣本為陰性。注dt表示樣本曲線與閾值線交點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù)(與一般實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的ct值類似)質(zhì)量控制每次檢測均設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，且結(jié)果應(yīng)同時(shí)滿足陽性對(duì)照dt《35，陰性對(duì)照dt無數(shù)值或?yàn)?0，否則此次實(shí)驗(yàn)視為無效。實(shí)施例3 NG試劑盒各組份的配制和組裝 試劑盒分為2 3(TC儲(chǔ)存的A盒(標(biāo)本處理單元)和-15 -35。C儲(chǔ)存的B盒(核酸擴(kuò)增 檢測單元)。A盒(標(biāo)本處理單元)組成為 尿樣保存液O.IM硫酸銨；0.15MHEPES; 核酸提取液0.15uM捕獲探針和磁性顆粒250mg/L; 洗滌液 0.1%SDS。B盒(核酸擴(kuò)增檢測單元)組成為NG反應(yīng)液4mM dNTPs和16mM NTPs;SAT酶液M-MLV2000U; T7 RNA聚合酶500 U;NG檢測液主要含3.5uMNG特異引物、2.7uM特異熒光探針；NG陽性對(duì)照主要含107copies/mlNGRNA;NG陰性對(duì)照不含任何核酸，用于檢驗(yàn)操作過程及試劑的有效性。實(shí)施例4 應(yīng)用模式之臨床樣本尿液的檢測 本檢測模式為本發(fā)明的最佳體現(xiàn)試劑的制備同實(shí)施例3，試劑的生產(chǎn)在GMP車間進(jìn) 行，淋病奈瑟菌尿液臨床樣本為上海皮膚病性病醫(yī)院提供的臨床實(shí)驗(yàn)樣品，編號(hào)為NG尿 液標(biāo)本1 8，另設(shè)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照各一個(gè)。標(biāo)本的核酸提取同實(shí)施例1， SAT擴(kuò)增檢 測及判定同實(shí)施例2，所使用的熒光PCR儀為Bio-RadiQ5。結(jié)果見附圖1，與金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng) 法檢測結(jié)果完全相同。實(shí)施例5 應(yīng)用模式之臨床樣本拭子的檢測本檢測模式為本發(fā)明的另一個(gè)應(yīng)用試劑的制備同實(shí)施例3，試劑的生產(chǎn)在GMP車間 進(jìn)行，淋病奈瑟菌拭子臨床樣本為上海皮膚病性病醫(yī)院提供的臨床實(shí)驗(yàn)樣品，編號(hào)為NG 拭子標(biāo)本1 8 (與尿液標(biāo)本編號(hào)為一一對(duì)應(yīng))，另設(shè)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照各一個(gè)。標(biāo)本的 核酸提取同實(shí)施例l， SAT擴(kuò)增檢測及判定同實(shí)施例2，所使用的熒光PCR儀為Bio-Rad iQ5。結(jié)果見附圖2，與金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法檢測結(jié)果完全相同，與實(shí)施例4結(jié)果也完全一致。根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員無須過多實(shí)驗(yàn)即可對(duì)本發(fā)明所要求保 護(hù)的淋病奈瑟菌(NG)核酸檢測試劑盒(RNA恒溫?cái)U(kuò)增)進(jìn)行實(shí)施，并達(dá)到預(yù)期效果。本發(fā) 明公開的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但并不是構(gòu)成對(duì)本發(fā)明限制。本領(lǐng)域的熟練 技術(shù)人員用顯而易見的相似替代物或改造，或用某些在化學(xué)上或生物上結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的制 劑替代在此描述的制劑，或?qū)Ρ景l(fā)明相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行變動(dòng)，但不超出本發(fā)明的精神、范圍和 思想，均落入本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。核苷酸序列表SEQUENCE LISTING<110>上海仁度生物科技有限公司<120> —種利用RNA恒溫?cái)U(kuò)增的淋病奈瑟菌核酸檢測試劑盒<130><160> 21<170> Patentln version 3.5<210> 1<211> 52<212> DNA<213> Artificial Sequence <220><223>標(biāo)本提取捕獲探針<400> 1cgatatgtta ctcacccgtt cg3333aa33 a33aa33333 3333333333 33 52<210> 2<211> 52<212> DNA<213> Artificial Sequence <220><223>標(biāo)本提取捕獲探針tgcggt3tta gctgatcttt cga33333aa a333a33333 333333333a as 52<210> 3<211> 55<212> DNA<213> Artificial Sequence <220><223>標(biāo)本提取捕獲探針<400> 3aatccacatc 3tccaccgct tgtgcaaa33 33aaaaaaa3 3a33aa333a 33333 55<210> 4<2"> 53<212> DNA<213> Artificial Sequence <220><223>標(biāo)本提取捕獲探針<400> 4ggt33ggttc ttcgcgttgc 3tc3333333 3333a33333 3333333333 333 53<210> 5<211> 60<212> DNA<220><223>標(biāo)本提取捕獲探針 <400> 5gcggtc33tt tC3cgcgtt3 gctacgct3C a3a333a3a3 3aaa33a333 a33333a3a3 60<210> 6<211> 52<212> DNA<213> Artificial Sequence <220><223> NGT7引物序列<400> 6aatttaatac g3ctcact3t 3ggg3g3c3c atcctgctta agtaaccgtc tg 52<210> 7<211> 53<212> DNA<213> Artificial Sequence <220><223> NGT7引物序列<400> 73attta3tac gactcsct3t agggagaatc ctgctta3gt 3accgtctgc gcc 53<210> 8 <211> 4813<212> DNA<213> Artificial Sequence <220><223> NGT7引物序列<400> 8aatttaatac gactcactat agggagactc gcaccctacg tattaccg 48<210> 9<211> 52<212> DNA<213> Artificial Sequence <220><223> NGT7引物序列<400> 9aatttaatac gactcactat agggagaatt accgcggctg ctggcacgta gt 52<210> 10<211> 53<212> DNA<213> Artificial Sequence <220><223> NGT7引物序列<400> 10aatttaatac gactcadat 3ggg3g3gcc cagtaattcc gatt33cgct cgc 53<210> 11<211> 19<212> DNA<213> Artificial Sequence <220><223> NG nT7引物序列<400> 11gactcctacg ggaggcagc19<210> 12<211> 23<212> DNA<213> Artificial Sequence <220><223> NG nT7引物序列<400> 12ctgatccagc catgccgcgt gtc 23<210> 13<2"> 27<212> DNA<213> Artificial Sequence <220><223> NG nT7引物序列<400> 13ggsc33tggg cgc33gcctg 3tcc3gc 27<210> 14<211> 22<212> DNA<213> Artificial Sequence <220><223> NG nT7引物序列<400> 14gcgtgtctg3 3g33ggcctt cg 22<210> 15 <211> 20 <212> DNA<213> Artificial Sequence <220><223> NGnT7引物序列 <400> 15cgccac3ctg ggactgsgac20<210> 16 <211> 29 <212> DNA<213> Artificial Seq uence <220><223> NG檢測探針 <400> 16cgagcaggct gttgcc33ta tcgggctcg 29<210> 17<211> 28<212> DNA<213> Artificial Seq uence <220><223> NG檢測探針<400> 17cgsgcgttgt 333ggacttt tgtgctcg 28<210> 18<211> 26<212> DNA<213> Artificial Sequence <220><223> NG檢測探針<400> 18cgagcctgtt gcc33tatcg ggctcg 26<210 19<211> 28<212> DNA<213> Artificial Sequence <220<223> NG檢測探針<40O 19cgagcgcscc ggcta3ct3c gtggctcg 28<210> 20<211> 28<212> DNA<213;> Artificial Sequence <220><223> NG檢測探針<400> 20cgsgcgatgs cggt3cctgs 3g3gctcg 28<210> 21<211> 908<212> DNA<213> 淋病奈瑟菌16s rRNA基因序列(Neisseria Gonorrhoea )<400> 21ttgcgctatc cgsgcggccg 3tatctg3tt 3gctggttgg cggggt333g gcccacc33g 180gcgacgatca gtagcgggtc tgagaggatg atccgccaca ctgggactga gacacggccc 2403gactcctac ggg3ggc3gc 3gtgggg33t tttgg3C33t gggcgcasgc ctg3tccsgc 300catgccgcgt gtctg3agaa ggccttcggg ttgtaaagga cttttgtcag gg3ag33aag 360gctgttgcca 3tatcggcgg ccgatgacgg tacctgaaga ataagcaccg gctaactacg 420tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc gagcgttaat cggaattact gggcgtaaag 480cgggcgcaga cggttactta agcaggatgt gaaatccccg ggctcaaccc gggaactgcg 540ttctgaactg ggtgactcga gtgtgtcaga gggaggtgga attccacgtg tagcagtgaa 6003tgcgt3g3g 3tgtggaggs 3taccgatgg cg3aggcagc ctcctggg3t 33csctg3cg 660ttcatgtccg a3agcgtggg tagcaa3c3g gattagatac cctggt3gtc C3cgcccta3 720acgatgteaa ttagctgttg ggcaacttga ttgcttggta gcgtagctaa cgcgtgaaat 780tgaccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg gggacccgca 840caagcggtgg atgatgtgga ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tggttttgac 900 atgtgcgg
權(quán)利要求
1.一種利用RNA恒溫?cái)U(kuò)增的淋病奈瑟菌核酸檢測試劑盒，其特征在于包括下列組成(1)尿樣保存液為裂解和保存尿液或生殖道拭子洗滌液標(biāo)本中淋病奈瑟菌(NG)RNA的表面活性劑和HEPES緩沖液；(2)核酸提取液為oligodT包被的磁珠和特異性結(jié)合靶標(biāo)核酸的一段RNA序列；(3)洗滌液為含SDS、NaCl和乙醇的溶液；(4)NG反應(yīng)液為dNTPs和NTPs等擴(kuò)增所需組份；(5)NG檢測液為恒溫?cái)U(kuò)增時(shí)必需的引物和熒光探針，序列選自NG 16s rRNA基因的保守區(qū)；(6)SAT酶液為恒溫?cái)U(kuò)增時(shí)必需的多酶組分體系，含T7 RNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶及穩(wěn)定劑；(7)NG陽性對(duì)照；為含NG16s rRNA基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；(8)NG陰性對(duì)照為不含任何核酸的尿樣保存液及生理鹽水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的淋病奈瑟菌核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的尿樣保存液含 有硫酸銨和去垢劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的淋病奈瑟菌核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的核酸提取液是利用磁珠分離法進(jìn)行核酸提取，含有磁性顆粒和捕獲探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的淋病奈瑟菌核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的捕獲探針包含有以下一種或幾種序列序列見序列表SEQ.ID.N01-5。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的淋病奈瑟菌核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的NG檢測液中 NG熒光探針為分子信標(biāo)，由兩端分別共價(jià)標(biāo)記有熒光染料和淬滅劑的單鏈核酸分子組成， 呈發(fā)夾型或莖環(huán)結(jié)構(gòu)，分子信標(biāo)的環(huán)部分和靶標(biāo)互補(bǔ)，兩頭由于互補(bǔ)而成為莖。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的淋病奈瑟菌核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的NG檢測液中 的探針包含有以下一種或幾種序列NG probe:序列見序列表SEQ.ID.NO16-20。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的淋病奈瑟菌核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的NG檢測液中 NG引物為5'端帶有T7啟動(dòng)子序列尾巴的下游引物和特異的上游引物，下游引物特異序 列與靶標(biāo)完全互補(bǔ)，上游引物序列與靶標(biāo)完全一致。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的淋病奈瑟菌核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的NG檢測液中 的弓I物包含有以下 一對(duì)或幾對(duì)序列NGT7:序列見序列表SEQ.ID.NO6-10; NGnT7:序列見序列表SEQ.ID.N011-15。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的淋病奈瑟菌核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的NG陽性對(duì)照 中體外轉(zhuǎn)錄的NGRNA，制備方法包括下列步驟(1) 用基因合成法獲得NG16srRNA基因的靶標(biāo)片段，長度約900bp;(2) 將片段克隆到pGEMb-T載體中，構(gòu)建NG陽性對(duì)照質(zhì)粒；(3) NG陽性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a中，命名為pGEMb-T-NG菌株，貯存 于-7(TC;(4) 純化去除DNA，并定量、鑒定RNA。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的淋病奈瑟菌核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的NG陽 性對(duì)照含有長900bp的NG 16s rRNA基因序列，序列見序列表SEQ.ID.N021 。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用磁珠-RNA富集技術(shù)提取純化靶標(biāo)RNA及恒溫核酸同步放大檢測技術(shù)(SAT)對(duì)淋病奈瑟菌(NG)進(jìn)行檢測的試劑盒，包含尿樣保存液、核酸提取液、洗滌液、NG反應(yīng)液、NG檢測液、SAT酶液、NG陽性對(duì)照、NG陰性對(duì)照。本發(fā)明的檢測試劑盒特異性高、靈敏度高，且擴(kuò)增產(chǎn)物RNA在自然環(huán)境下易于降解而污染低。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101591707SQ200910048829
公開日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2009年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日
發(fā)明者于明輝, 居金良, 張常娥, 亮 方, 敏 王 申請(qǐng)人:上海仁度生物科技有限公司