專利名稱:85kgDa奈瑟球菌的抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及來自細(xì)菌腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)和淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)的抗原。
背景技術(shù):
腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是不能動的、對人有致病性的革蘭氏陰性雙球菌。其聚集于咽部,導(dǎo)致腦膜炎,并且偶爾會在不引起腦膜炎的情況下導(dǎo)致敗血病。該菌與淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)非常接近,雖然腦膜炎奈瑟球菌與淋病奈瑟球菌間的一個明顯差異是在所有致病性腦膜炎奈瑟球菌中存在多糖莢膜。
腦膜炎奈瑟球菌會導(dǎo)致地方性和流行性疾病。在美國其發(fā)病率每年每100,000人為0.6-1人,而且爆發(fā)時發(fā)病率會更高[Lieberman等人,(1996)JAMA275(19)1499-1503;Schuchat等人(1997)N Engl J Med337(14)970-976]。在發(fā)展中國家,地方性發(fā)病率更高,在地方性發(fā)病率每年每100,000人可達(dá)500個病例。死亡率特別高,在美國為10-20%,在發(fā)展中國家則更高。在引進(jìn)針對流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的偶聯(lián)疫苗以后,腦膜炎奈瑟球菌是造成美國各年齡層細(xì)菌性腦膜炎主要的原因[Schuchat等人(1997),同上]。
根據(jù)該菌的莢膜多糖,已經(jīng)鑒定出12種腦膜炎奈瑟球菌的血清群。目前使用的腦膜炎球菌疫苗是由血清群A、C、Y和W135組成的四價多糖疫苗。在針對流感嗜血菌疫苗的成功之后,已開發(fā)了針對血清群A和C的偶聯(lián)疫苗。
然而腦膜炎球菌B仍是一個問題。這種血清群導(dǎo)致約占美國、歐洲和南美腦膜炎總數(shù)的50%。不能采用多糖方法,因為menB莢膜多糖是一種α(2-8)-相連的N-乙酰神經(jīng)氨酸的聚合物,它也存在于哺乳動物組織中。這就導(dǎo)致了對抗原的耐免,事實上如果引發(fā)應(yīng)答,該應(yīng)答將會是防自身的,因此是不良的。為了避免引發(fā)自體免疫和引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答,將莢膜多糖進(jìn)行例如化學(xué)修飾,用N-丙?;娲鶱-乙?;桓淖兤涮禺愋钥乖訹Romero &Outschoorn(1994)Clin Microbiol Rev 7(4)559-575]。
另一種menB疫苗方法是采用外膜蛋白(OMP)的混合物,其僅含有OMP或富含在膜孔蛋白中的OMP,或除去4型OMP(據(jù)信其引發(fā)封阻殺菌活性的抗體)。這些疫苗的性質(zhì)還未確定,而且僅對同源菌株有效。為了克服抗原性變異,已經(jīng)構(gòu)建了含有高達(dá)9種不同膜孔蛋白的多價疫苗(例如,Poolman JT(1992)Infect.Agents Dis.413-28]。用于外膜疫苗的其它蛋白是opa和opc蛋白,但是這些方法均不能克服抗原性變異[例如Ala′Aldeen和Borriello(1996)Vaccine14(1)49-53]。然而挪威國家公共衛(wèi)生研究所的疫苗是安全的,在兒童和成年人中可引起菌株-特異性免疫,并能有效預(yù)防青少年疾病。
但對這些疫苗的定性都不夠,而且至今未探明它們效果和保護(hù)作用的分子基礎(chǔ)。本發(fā)明的目的是確定疫苗的抗原性成分從而對它們定性,以便生產(chǎn)界定更清楚的疫苗(如非細(xì)胞亞基疫苗),并能擴(kuò)大引發(fā)的免疫所針對的奈瑟球菌的范圍。
發(fā)明公開蛋白質(zhì)本發(fā)明提供了包含一個或多個選自以下氨基酸序列的蛋白質(zhì)SEQ I D1、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5、SEQ ID 7、SEQ ID 8、SEQ ID 9、SEQ ID 11、SEQ ID 12和SEQ ID 13。
本發(fā)明還提供了具有與SEQ ID 1、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5、SEQID 7、SEQ ID 8、SEQ ID 9、SEQ ID 11、SEQ ID 12或SEQ ID NOID 13有序列相同性的序列的蛋白質(zhì)。根據(jù)具體的序列,序列相同性的程度宜大于50%(例如60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高)。這些同源的序列包括突變體和等位基因變體。通常,兩種蛋白質(zhì)間50%或以上的相同被視為功能相當(dāng)?shù)闹甘?。兩個序列之間的相同性宜用Smith-Waterman同源性搜尋算法確定,如在MPSRCH程序(Oxford Molecular)中,采用參數(shù)“缺口罰分(gap penalty)”為12,“缺口延伸罰分(gap extension penalty)”為1進(jìn)行缺口仿射搜索。
本發(fā)明還提供了含有SEQ ID 1、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5、SEQ ID 7、SEQ ID 8、SEQ ID 9、SEQ ID 11、SEQ ID 12或SEQ ID 13的片段的蛋白質(zhì)。該片段必須含有該序列的至少n個連續(xù)氨基酸,而且根據(jù)具體的序列,n為7或以上(如8、10、12、14、16、18、20或更大)。該片段宜含有該序列的表位。
當(dāng)然,本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用多種方法制備(例如,重組表達(dá)、從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化、化學(xué)合成等),并可以是各種形式(例如天然的、融合的等)。它們宜制成基本上純凈的形式(即基本上不含其它奈瑟球菌或宿主細(xì)胞蛋白)。
抗體另一方面,本發(fā)明提供了結(jié)合這些蛋白質(zhì)的抗體。這些抗體可以是多克隆的或是單克隆的,并可用任何適合的方法制備。
核酸另一方面,本發(fā)明提供了包含SEQ ID 2、SEQ ID 6或SEQ ID 10的核酸。另外,本發(fā)明提供了含有與SEQ ID 2、SEQ ID 6或SEQ ID 10有序列相同性的序列的核酸。根據(jù)具體的SEQ ID,序列相同性的程度宜大于50%(例如60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高)。兩個序列之間的相同性宜用Smith-Waterman同源性搜尋算法確定,如在MPSRCH程序(Oxford Molecular)中,采用參數(shù)“缺口罰分(gap penalty)”為12,“缺口延伸罰分(gap extension penalty)”為1進(jìn)行缺口仿射搜索。
此外,本發(fā)明還提供了可雜交于SEQ ID 2、SEQ ID 6或SEQ ID 10(較佳地在“高度嚴(yán)謹(jǐn)”條件下(如65℃,0.1×SSC,0.5%SDS溶液中)雜交)的核酸。
還提供了含有SEQ ID 2、SEQ ID 6或SEQ ID 10的片段的核酸。這些核酸含有SEQ ID 2、SEQ ID 6或SEQ ID 10的至少n個連續(xù)核苷酸,而且根據(jù)具體的序列,n為10或更大(如12、14、15、18、20、25、30、35、40或更大)。
另一方面,本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段的核酸。
還應(yīng)理解,本發(fā)明提供了一類核酸,所述核酸含有與上述序列互補(bǔ)的序列(例如用于反義或探測目的)。
當(dāng)然,本發(fā)明的核酸可以用多種方法制備(例如,化學(xué)合成、從基因組或cDNA文庫、或從生物體本身制得等),并可以是各種形式(例如單鏈、雙鏈、載體、探針等)。
此外,術(shù)語“核酸”包括DNA和RNA,以及它們的類似物,如含有修飾骨架的那些類似物,還包括肽核酸(PNA)等。
另一方面,本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的核苷酸序列的載體(如表達(dá)載體)以及用這些載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
組合物另一方面,本發(fā)明提供了含有本發(fā)明蛋白質(zhì)、抗體和/或核酸的組合物。這些組合物適合作為例如疫苗、診斷試劑或免疫原性組合物。
本發(fā)明的組合物還可含有選自以下一種或多種的免疫原性成分●WO99/57280公開的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段;●WO99/36544公開的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段;●WO99/24578公開的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段;●Tettelin等人[Seience(2000)2871809-1815;NMB0001到NMB2160]公開的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段;●WO97/28273公開的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段;●WO96/29412公開的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段;●WO95/03413公開的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段;●WO99/31132公開的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段;●抗腦膜炎奈瑟球菌血清群A的保護(hù)性抗原;●抗腦膜炎奈瑟球菌血清群C的保護(hù)性抗原;●抗腦膜炎奈瑟球菌血清群Y的保護(hù)性抗原;●抗腦膜炎奈瑟球菌血清群W的保護(hù)性抗原;●抗流感嗜血菌的保護(hù)性抗原;●抗肺炎球菌的保護(hù)性抗原;●抗白喉的保護(hù)性抗原;●抗破傷風(fēng)的保護(hù)性抗原;●抗百日咳的保護(hù)性抗原;●抗幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)的保護(hù)性抗原;●抗脊髓灰質(zhì)炎的保護(hù)性抗原;和/或●抗乙型肝炎病毒的保護(hù)性抗原。
本發(fā)明的組合物宜含有選自以下的一種或多種免疫原性成分●含有選自以下的氨基酸序列的蛋白質(zhì)如WO99/24578所述的SEQ ID 2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,78,80,82,84,86,88,90,92,94,96,98,100,102,104,106,108,110,112,114,116,118,120,122,124,126,128,130,132,134,136,138,140,142,144,146,148,150,152,154,156,158,
160,162,164,166,168,170,172,174,176,178,180,182,184,186,188,190,192,194,196,198,200,202,204,206,208,210,212,214,216,218,220,222,224,226,228,230,232,234,236,238,240,242,244,246,248,250,252,254,256,258,260,262,264,266,268,270,272,274,276,278,280,282,284,286,288,290,292,294,296,298,300,302,304,306,308,310,312,314,316,318,320,322,324,326,328,330,332,334,336,338,340,342,344,346,348,350,352,354,356,358,360,362,364,366,368,370,372,374,376,378,380,382,384,386,388,390,392,394,396,398,400,402,404,406,408,410,412,414,416,418,420,422,424,426,428,430,432,434,436,438,440,442,444,446,448,450,452,454,456,458,460,462,464,466,468,470,472,474,476,478,480,482,484,486,488,490,492,494,496,498,500,502,504,506,508,510,512,514,516,518,520,522,524,526,528,530,532,534,536,538,540,542,544,546,548,550,552,554,556,558,560,562,564,566,568,570,572,574,576,578,580,582,584,586,588,590,592,594,596,598,600,602,604,606,608,610,612,614,616,618,620,622,624,626,628,630,632,634,636,638,640,642,644,646,648,650,652,654,656,658,660,662,664,666,668,670,672,674,676,678,680,682,684,686,688,690,692,694,696,698,700,702,704,706,708,710,712,714,716,718,720,722,724,726,728,730,732,734,736,738,740,742,744,746,748,750,752,754,756,758,760,762,764,766,768,770,772,774,776,778,780,782,784,786,788,790,792,794,796,798,800,802,804,806,808,810,812,814,816,818,820,822,824,826,828,830,832,834,836,838,840,842,844,846,848,850,852,854,856,858,860,862,864,866,868,870,872,874,876,878,880,882,884,886,888,890,和892(或含有一種或多種這些SEQ ID的免疫原性片段的蛋白質(zhì),或含有與這些SEQ ID之一有序列相同性(宜高于50%,如60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高)的序列的蛋白質(zhì));●含有選自以下氨基酸序列的蛋白質(zhì)如WO99/36544所述的SEQ ID 2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,78,80,82,84,86,88,和90(或含有一種或多種這些SEQ ID的免疫原性片段的蛋白質(zhì),或含有與這些SEQID之一有序列相同性(宜高于50%,如60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高)的序列的蛋白質(zhì));●由Tettelin等人[Science(2000)2871809-1815]所公開的NMB0001到NMB2160的2160個基因中任一個基因所編碼的蛋白質(zhì)(或含有這2160個基因中的一個或多個的免疫原性片段的蛋白質(zhì),或含有與這2160個基因中的一個序列相同(宜高于50%,如60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高)的序列的蛋白質(zhì));●含有選自以下氨基酸序列的蛋白質(zhì)如WO99/57280所述的2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,78,80,82,84,86,88,90,92,94,96,98,100,102,104,106,108,110,112,114,116,118,120,122,124,126,128,130,132,134,136,138,140,142,144,146,148,150,152,154,156,158,160,162,164,166,168,170,172,174,176,178,180,182,184,186,188,190,192,194,196,198,200,202,204,206,208,210,212,214,216,218,220,222,224,226,228,230,232,234,236,238,240,242,244,246,248,250,252,254,256,258,260,262,264,266,268,270,272,274,276,278,280,282,284,286,288,290,292,294,296,298,300,302,304,306,308,310,312,314,316,318,320,322,324,326,328,330,332,334,336,338,340,342,344,346,348,350,352,354,356,358,360,362,364,366,368,370,372,374,376,378,380,382,384,386,388,390,392,394,396,398,400,402,404,406,408,410,412,414,416,418,420,422,424,426,428,430,432,434,436,438,440,442,444,446,448,450,452,454,456,458,460,462,464,466,468,470,472,474,476,478,480,482,484,486,488,490,492,494,496,498,500,502,504,506,508,510,512,514,516,518,520,522,524,526,528,530,532,534,536,538,540,542,544,546,548,550,552,554,556,558,560,562,564,566,568,570,572,574,576,578,580,582,584,586,588,590,592,594,596,598,600,602,604,606,608,610,612,614,616,618,620,622,624,626,628,630,632,634,636,638,640,642,644,646,648,650,652,654,656,658,660,662,664,666,668,670,672,674,
676,678,680,682,684,686,688,690,692,694,696,698,700,702,704,706,708,710,712,714,716,718,720,722,724,726,728,730,732,734,736,738,740,742,744,746,748,750,752,754,756,758,760,762,764,766,768,770,772,774,776,778,780,782,784,786,788,790,792,794,796,798,800,802,804,806,808,810,812,814,816,818,820,822,824,826,828,830,832,834,836,838,840,842,844,846,848,850,852,854,856,858,860,862,864,866,868,870,872,874,876,878,880,882,884,886,888,890,892,894,896,898,900,902,904,906,908,910,912,914,916,918,920,922,924,926,928,930,932,934,936,938,940,942,944,946,948,950,952,954,956,958,960,962,964,966,968,970,972,974,976,978,980,982,984,986,988,990,992,994,996,998,1000,1002,1004,1006,1008,1010,1012,1014,1016,1018,1020,1022,1024,1026,1028,1030,1032,1034,1036,1038,1040,1042,1044,1046,1048,1050,1052,1054,1056,1058,1060,1062,1064,1066,1068,1070,1072,1074,1076,1078,1080,1082,1084,1086,1088,1090,1092,1094,1096,1098,1100,1102,1104,1106,1108,1110,1112,1114,1116,1118,1120,1122,1124,1126,1128,1130,1132,1134,1136,1138,1140,1142,1144,1146,1148,1150,1152,1154,1156,1158,1160,1162,1164,1166,1168,1170,1172,1174,1176,1178,1180,1182,1184,1186,1188,1190,1192,1194,1196,1198,1200,1202,1204,1206,1208,1210,1212,1214,1216,1218,1220,1222,1224,1226,1228,1230,1232,1234,1236,1238,1240,1242,1244,1246,1248,1250,1252,1254,1256,1258,1260,1262,1264,1266,1268,1270,1272,1274,1276,1278,1280,1282,1284,1286,1288,1290,1292,1294,1296,1298,1300,1302,1304,1306,1308,1310,1312,1314,1316,1318,1320,1322,1324,1326,1328,1330,1332,1334,1336,1338,1340,1342,1344,1346,1348,1350,1352,1354,1356,1358,1360,1362,1364,1366,1368,1370,1372,1374,1376,1378,1380,1382,1384,1386,1388,1390,1392,1394,1396,1398,1400,1402,1404,1406,1408,1410,1412,1414,1416,1418,1420,1422,1424,1426,1428,1430,1432,1434,1436,1438,1440,1442,1444,1446,1448,1450,1452,1454,1456,1458,1460,1462,1464,1466,1468,1470,1472,1474,1476,1478,1480,1482,1484,1486,1488,
1490,1492,1494,1496,1498,1500,1502,1504,1506,1508,1510,1512,1514,1516,1518,1520,1522,1524,1526,1528,1530,1532,1534,1536,1538,1540,1542,1544,1546,1548,1550,1552,1554,1556,1558,1560,1562,1564,1566,1568,1570,1572,1574,1576,1578,1580,1582,1584,1586,1588,1590,1592,1594,1596,1598,1600,1602,1604,1606,1608,1610,1612,1614,1616,1618,1620,1622,1624,1626,1628,1630,1632,1634,1636,1638,1640,1642,1644,1646,1648,1650,1652,1654,1656,1658,1660,1662,1664,1666,1668,1670,1672,1674,1676,1678,1680,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1706,1708,1710,1712,1714,1716,1718,1720,1722,1724,1726,1728,1730,1732,1734,1736,1738,1740,1742,1744,1746,1748,1750,1752,1754,1756,1758,1760,1762,1764,1766,1768,1770,1772,1774,1776,1778,1780,1782,1784,1786,1788,1790,1792,1794,1796,1798,1800,1802,1804,1806,1808,1810,1812,1814,1816,1818,1820,1822,1824,1826,1828,1830,1832,1834,1836,1838,1840,1842,1844,1846,1848,1850,1852,1854,1856,1858,1860,1862,1864,1866,1868,1870,1872,1874,1876,1878,1880,1882,1884,1886,1888,1890,1892,1894,1896,1898,1900,1902,1904,1906,1908,1910,1912,1914,1916,1918,1920,1922,1924,1926,1928,1930,1932,1934,1936,1938,1940,1942,1944,1946,1948,1950,1952,1954,1956,1958,1960,1962,1964,1966,1968,1970,1972,1974,1976,1978,1980,1982,1984,1986,1988,1990,1992,1994,1996,1998,2000,2002,2004,2006,2008,2010,2012,2014,2016,2018,2020,2022,2024,2026,2028,2030,2032,2034,2036,2038,2040,2042,2044,2046,2048,2050,2052,2054,2056,2058,2060,2062,2064,2066,2068,2070,2072,2074,2076,2078,2080,2082,2084,2086,2088,2090,2092,2094,2096,2098,2100,2102,2104,2106,2108,2110,2112,2114,2116,2118,2120,2122,2124,2126,2128,2130,2132,2134,2136,2138,2140,2142,2144,2146,2148,2150,2152,2154,2156,2158,2160,2162,2164,2166,2168,2170,2172,2174,2176,2178,2180,2182,2184,2186,2188,2190,2192,2194,2196,2198,2200,2202,2204,2206,2208,2210,2212,2214,2216,2218,2220,2222,2224,2226,2228,2230,2232,2234,2236,2238,2240,2242,
2244,2246,2248,2250,2252,2254,2256,2258,2260,2262,2264,2266,2268,2270,2272,2274,2276,2278,2280,2282,2284,2286,2288,2290,2292,2294,2296,2298,2300,2302,2304,2306,2308,2310,2312,2314,2316,2318,2320,2322,2324,2326,2328,2330,2332,2334,2336,2338,2340,2342,2344,2346,2348,2350,2352,2354,2356,2358,2360,2362,2364,2366,2368,2370,2372,2374,2376,2378,2380,2382,2384,2386,2388,2390,2392,2394,2396,2398,2400,2402,2404,2406,2408,2410,2412,2414,2416,2418,2420,2422,2424,2426,2428,2430,2432,2434,2436,2438,2440,2442,2444,2446,2448,2450,2452,2454,2456,2458,2460,2462,2464,2466,2468,2470,2472,2474,2476,2478,2480,2482,2484,2486,2488,2490,2492,2494,2496,2498,2500,2502,2504,2506,2508,2510,2512,2514,2516,2518,2520,2522,2524,2526,2528,2530,2532,2534,2536,2538,2540,2542,2544,2546,2548,2550,2552,2554,2556,2558,2560,2562,2564,2566,2568,2570,2572,2574,2576,2578,2580,2582,2584,2586,2588,2590,2592,2594,2596,2598,2600,2602,2604,2606,2608,2610,2612,2614,2616,2618,2620,2622,2624,2626,2628,2630,2632,2634,2636,2638,2640,2642,2644,2646,2648,2650,2652,2654,2656,2658,2660,2662,2664,2666,2668,2670,2672,2674,2676,2678,2680,2682,2684,2686,2688,2690,2692,2694,2696,2698,2700,2702,2704,2706,2708,2710,2712,2714,2716,2718,2720,2722,2724,2726,2728,2730,2732,2734,2736,2738,2740,2742,2744,2746,2748,2750,2752,2754,2756,2758,2760,2762,2764,2766,2768,2770,2772,2774,2776,2778,2780,2782,2784,2786,2788,2790,2792,2794,2796,2798,2800,2802,2804,2806,2808,2810,2812,2814,2816,2818,2820,2822,2824,2826,2828,2830,2832,2834,2836,2838,2840,2842,2844,2846,2848,2850,2852,2854,2856,2858,2860,2862,2864,2866,2868,2870,2872,2874,2876,2878,2880,2882,2884,2886,2888,2890,2892,2894,2896,2898,2900,2902,2904,2906,2908,2910,2912,2914,2916,2918,2920,2922,2924,2926,2928,2930,2932,2934,2936,2938,2940,2942,2944,2946,2948,2950,2952,2954,2956,2958,2960,2962,2964,2966,2968,2970,2972,2974,2976,2978,2980,2982,2984,2986,2988,2990,2992,2994,2996,
2998,3000,3002,3004,3006,3008,3010,3012,3014,3016,3018和3020(或含有一種或多種這些SEQ ID的免疫原性片段的蛋白質(zhì),或含有與這些SEQID之一有序列相同性(宜高于50%,如60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高)的序列的蛋白質(zhì));●WO97/28273的圖4或
圖13所公開的蛋白質(zhì);●含有選自如下氨基酸序列的蛋白質(zhì)如WO96/29412公開的SEQ ID 1-8(或含有一種或多種這些SEQ ID的免疫原性片段的蛋白質(zhì),或含有與這些SEQ ID之一有序列相同性(宜高于50%,如60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高)的序列的蛋白質(zhì));●含有選自如下氨基酸序列的蛋白質(zhì)如WO95/03413公開的SEQ ID 1-23(或含有一種或多種這些SEQ ID的免疫原性片段的蛋白質(zhì),或含有與這些SEQ ID之一有序列相同性(宜高于50%,如60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高)的序列的蛋白質(zhì));●含有選自如下氨基酸序列的蛋白質(zhì)如WO99/31132公開的SEQ ID 2(或含有SEQ ID 2的免疫原性片段的蛋白質(zhì),或含有與SEQ ID 2序列相同(宜高于50%,如60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高)的序列的蛋白質(zhì));●抗腦膜炎奈瑟球菌血清群A的多糖抗原;●抗腦膜炎奈瑟球菌血清群C的多糖抗原,如Costantino等人(1992)Vaccine 10691-698所公開的;●抗腦膜炎奈瑟球菌血清群Y的多糖抗原;●抗腦膜炎奈瑟球菌血清群W的多糖抗原;●抗流感嗜血菌的多糖抗原;●抗肺炎球菌的多糖抗原;●抗白喉的保護(hù)性抗原,由白喉類毒素如CRM197突變體[如,Del Guidice等人(1998)Molecular Aspects of Medicine191-70]構(gòu)成;●抗破傷風(fēng)的保護(hù)性抗原,由破傷風(fēng)毒素[如Wassilak & Orenstein,疫苗,第4章(Plotkin & Mortimer編輯),1988]構(gòu)成;●抗百日咳的保護(hù)性抗原,由百日咳全毒素(PT)和絲狀凝血素(FHA)構(gòu)成,還可任選地含有百日咳桿菌粘附素(pertactin)和/或凝集原2和3[如,Gustafsson等人(1996)N.Engl.J.Med.334349-355;Rappoli等人(1991)TIBTECH9232-238];●抗幽門螺旋桿菌的保護(hù)性抗原,包含一種或多種CagA(如WO93/18150)、VacA(如,WO93/18150)、NAP(如,WO99/53310)、HopX(如WO98/04702)、HopY(如,WO98/04702)、尿激酶;●抗乙型肝炎病毒的保護(hù)性抗原,由HBV表面抗原和/或HBV核心抗原構(gòu)成。
當(dāng)組合物含有抗白喉的抗原時,這種組合物宜含有抗破傷風(fēng)和脊髓灰質(zhì)炎的抗原。當(dāng)組合物含有抗破傷風(fēng)的抗原時,該組合物宜含有抗白喉和脊髓灰質(zhì)炎的抗原。當(dāng)組合物含有抗脊髓灰質(zhì)炎的抗原時,該組合物宜含有抗白喉和破傷風(fēng)的抗原。
百日咳毒素是毒素蛋白,當(dāng)存在于組合物中時,宜將其去毒。去毒化可通過化學(xué)和/或遺傳方法進(jìn)行。優(yōu)選的去過毒的突變體是9K/129G雙突變體[如,Rappuoli(1997)Nature Medicine3374-376]。
當(dāng)組合物含有以不同新生和成熟形式存在的蛋白質(zhì)時,宜選用該蛋白質(zhì)的成熟形式。例如,當(dāng)含有NspA時,(WO96/29412;還可參見Martin等人(1997)J.Exp.med 185 1173-1183)宜選用沒有信號肽的蛋白質(zhì)成熟形式。
當(dāng)組合物含有多糖抗原時,宜將多糖偶聯(lián)于載體蛋白。
組合物中本發(fā)明的蛋白質(zhì)宜與組合物中的至少一種保護(hù)性抗原協(xié)同地相互作用。
治療、預(yù)防、診斷本發(fā)明還提供了用作藥劑(宜為疫苗)或作為診斷試劑的本發(fā)明的組合物。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的組合物在生產(chǎn)下列物質(zhì)中的應(yīng)用(i)用于治療或預(yù)防奈瑟球菌屬細(xì)菌感染的藥劑;(ii)用于檢測奈瑟球菌屬細(xì)菌或檢測抗奈瑟球菌屬細(xì)菌抗體是否存在的診斷試劑;和/或(iii)用于產(chǎn)生抗奈瑟球菌屬細(xì)菌的抗體的試劑。所述奈瑟球菌屬細(xì)菌可以是任何物種或菌株(例如淋病奈瑟球菌),但優(yōu)選腦膜炎奈瑟球菌,尤其是血清群B。
本發(fā)明還提供了一種治療患者的方法,該方法包括給予患者治療有效量的本發(fā)明的核酸、蛋白質(zhì)和/或抗體。該方法宜為免疫法。
本發(fā)明的疫苗可以是預(yù)防性(即預(yù)防感染)或治療性的(即治療感染后的疾病)。
方法另一方面,本發(fā)明提供了各種方法。
提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白的方法,該方法包括步驟在誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的條件下,培育本發(fā)明的宿主細(xì)胞。
提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或核酸的方法,其中用化學(xué)法部分或全部地合成所述蛋白或核苷酸。
提供了一種檢測本發(fā)明的多核苷酸的方法,該方法包括下列步驟(a)在雜交條件下使本發(fā)明的核酸探針與生物樣品接觸,形成雙鏈體;和(b)檢測所述的雙鏈體。
提供了一種檢測本發(fā)明的蛋白質(zhì)的方法,該方法包括下列步驟(a)在適合形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下使本發(fā)明的抗體和生物樣品接觸;和(b)檢測所述復(fù)合物。
本發(fā)明的實施方案以下是可用于實施本發(fā)明(例如為了免疫或診斷目的而使用所公開的序列)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和程序的綜述。該綜述不是對本發(fā)明的限制,相反它只是給出了一些可以使用但并非必需的例子。
綜述除非另有描述,本發(fā)明的實施將采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù),這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。這些技術(shù)在下列文獻(xiàn)中有全面的描述例如,Sambrook《分子克隆實驗手冊》第2版(1989);《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover編1985);《寡核苷酸的合成》(M.J.Gait編,1984);《核酸的雜交》(B.D.Hames和S.J.Higgins編.1984);《轉(zhuǎn)錄和翻譯》(B.D.Hames和S.J.Higgins編,1984);《動物細(xì)胞培養(yǎng)》(R.I.Freshney編,1986);《固定化細(xì)胞和酶》(IRL Press,1986);B.Perbal,《分子克隆實用指南》(1984);《酶學(xué)方法》系列叢書(Academic Press,Inc.),尤其是154和155卷;《哺乳動物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體》(J.H.Miller和M.P.Calos編,1987,Cold SpringHarbor Laboratory);Mayer和Walker編(1987),《細(xì)胞和分子生物學(xué)的免疫化學(xué)方法》(Academic Press,London);Scopes,(1987)《蛋白質(zhì)的純化原理和實踐》第2版(Springer-Verlag,N.Y.),以及《實驗免疫學(xué)手冊》I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell編1986)。
在本說明書中采用了核苷酸和氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)縮寫。
當(dāng)組合物中X+Y總重量的至少85%是X時,則稱含有X的組合物“基本無Y”。較佳地,X占組合物中X+Y總重量的至少約90%,更佳地為至少約95%或者甚至99%(重量)。
術(shù)語“包含”指“含有”和“由……構(gòu)成”,例如“包含”X的組合物可以完全由X構(gòu)成,或者可以含有X之外的物質(zhì),例如X+Y。
術(shù)語“異源”指在自然界中發(fā)現(xiàn)不在一起的兩種生物學(xué)組分。這種組分可以是宿主細(xì)胞、基因、或調(diào)控區(qū)如啟動子。盡管異源組分在自然界中發(fā)現(xiàn)不在一起,但是它們能一起起作用,例如當(dāng)與某基因異源的一種啟動子與該基因操作性相連時。另一個例子是奈瑟球菌序列與小鼠宿主細(xì)胞異源。另一例子是來自相同或不同蛋白質(zhì)的兩個表位,它們已經(jīng)以自然界沒有的排列方式組裝在一個蛋白質(zhì)中。
“復(fù)制起點”是啟動和調(diào)節(jié)多核苷酸(例如表達(dá)載體)復(fù)制的一種多核苷酸序列。復(fù)制起點可作為細(xì)胞內(nèi)多核苷酸復(fù)制的自主性單位,能在其自身的控制下進(jìn)行復(fù)制。復(fù)制起點是載體在特定宿主細(xì)胞中復(fù)制所需要的。有了某一復(fù)制起點,表達(dá)載體就能在細(xì)胞中合適蛋白的存在下高拷貝數(shù)地復(fù)制。這些起點的例子是在酵母中有效的自主復(fù)制序列;以及在COS-7細(xì)胞中有效的病毒性T-抗原。
“突變體”指與天然或已公開的序列不同但具有序列相同性的DNA、RNA或氨基酸序列。根據(jù)具體的序列,天然或已公開的序列與突變序列間序列相同性的程度宜高于50%(如60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高,用上述Smith-Waterman算法計算)。如本文所述,本文提供的核酸序列的核酸分子或區(qū)域的“等位基因突變體”,是在另一或第二種分離物基因組的基本上同個基因座上存在的核酸或區(qū)域,它們由于例如突變或重組而導(dǎo)致的天然變異而具有類似但不相同的核酸序列。編碼區(qū)域的等位基因突變體通常編碼具有與相比較的基因所編碼的蛋白質(zhì)的類似的活性。等位基因突變體還可編碼基因5’或3’未翻譯區(qū)域(如調(diào)控區(qū))中的變化(如,參見美國專利No.5,753,235)。
表達(dá)系統(tǒng)奈瑟球菌屬細(xì)菌的核苷酸序列可在各種不同的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá);例如那些使用哺乳動物細(xì)胞、桿狀病毒、植物、細(xì)菌和酵母的系統(tǒng)。
i.哺乳動物系統(tǒng)哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域中已知的。哺乳動物啟動子是能結(jié)合哺乳動物RNA聚合酶并啟動編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)的下游(3′)轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動子具有一個轉(zhuǎn)錄起始區(qū),其通常鄰近編碼序列的5′端,還具有一個TATA盒,其通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游25-30個堿基對(bp)處。認(rèn)為TATA盒指導(dǎo)RNA聚合酶II在正確位點開始RNA合成。哺乳動物啟動子還含有一個上游啟動子元件,其通常位于TATA盒上游100至200bp內(nèi)。該上游啟動子元件決定了轉(zhuǎn)錄啟動的速度,并可在兩個方向之一上起作用[Sambrook等人(1989)“克隆基因在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)”《分子克隆實驗手冊》,第2版]。
哺乳動物病毒基因通常是高表達(dá)的,具有廣泛的宿主范圍;因此,編碼哺乳動物病毒基因的序列提供了特別有用的啟動子序列。例子包括SV40早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒LTR啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)以及單純皰疹病毒啟動子。另外,從非病毒基因(如鼠金屬硫蛋白基因)衍生的序列也提供了有用的啟動子序列。表達(dá)可以是組成型的或受調(diào)控的(誘導(dǎo)型),取決于啟動子能否在激素反應(yīng)性細(xì)胞中用促糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)。
增強(qiáng)元件(增強(qiáng)子)的存在,聯(lián)合上述啟動子元件通常會提高表達(dá)水平。增強(qiáng)子是這樣一種調(diào)控性DNA序列,當(dāng)其與同源或異源啟動子相連,合成在正常的RNA起始位點開始時,它能刺激轉(zhuǎn)錄提高1000倍。當(dāng)增強(qiáng)子位于轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游,處于正?;蚍D(zhuǎn)方向,或距離啟動子1000個核苷酸以上的距離時,它均具有活性[Maniatis等人(1987)Science 2361237;Alberts等人(1989)《細(xì)胞分子生物學(xué)》,第2版]。從病毒衍生的增強(qiáng)子元件可能是特別有用的,因為它們通常具有較寬的宿主范圍。例子包括SV40早期基因增強(qiáng)子[Dijkema等人(1985)EMBO J.4761]以及衍生自Rous肉瘤病毒的長末端重復(fù)序列(LTR)的增強(qiáng)子/啟動子[Gorman等人(1982b)Proc.Natl.Acad.Sci.796777]以及來自人巨細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子/啟動子[Boshart等人(1985)Cell 41521]。另外,一些增強(qiáng)子僅僅在誘導(dǎo)物(例如激素或金屬離子)的存在下是可調(diào)節(jié)的并具有活性[Sassone-Corsi和Borelli(1986)Trends Genet.2215;Maniatis等人(1987)Science 2361237]。
DNA分子可在哺乳動物細(xì)胞中胞內(nèi)表達(dá)。啟動子序列可以和DNA分子直接相連,在這種情況下,重組蛋白N端的第一個氨基酸始終是甲硫氨酸,其由ATG起始密碼子編碼。如果需要,可通過和溴化氰體外培育來從蛋白上切下此N端。
另外,外來蛋白也可從細(xì)胞中分泌到生長培養(yǎng)基中,方法是產(chǎn)生嵌合的DNA分子,該DNA分子編碼的融合蛋白包括一前導(dǎo)序列片段,該片段在哺乳動物細(xì)胞中提供了外源蛋白的分泌。較佳的,在前導(dǎo)序列片段和外源基因之間可以有能在體內(nèi)或體外斷裂的加工位點。前導(dǎo)序列片段通常編碼一種信號肽,該信號肽由指導(dǎo)從細(xì)胞分泌出蛋白質(zhì)的疏水性氨基酸組成。腺病毒三聯(lián)前導(dǎo)序列是哺乳動物細(xì)胞中分泌外來蛋白的一個前導(dǎo)序列的例子。
通常,哺乳動物細(xì)胞識別的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列是位于翻譯終止密碼子3′的調(diào)控區(qū)域,因此它和啟動子元件一起側(cè)接于編碼序列。成熟mRNA的3′端由定點的轉(zhuǎn)錄后斷裂和聚腺苷酸化形成[Birnstiel等人(1985)Cell 41349;Proudfoot和Whitelaw(1988)″真核RNA的終端和3′端加工″《轉(zhuǎn)錄和剪接》(B.D.Hames和D.M.Glover編);Proudfoot(1989)Trends Biochem.Sci.14105]。這些序列指導(dǎo)mRNA的轉(zhuǎn)錄,mRNA能被翻譯成該DNA編碼的多肽。轉(zhuǎn)錄終止子/聚腺苷酸化信號的例子包括從SV40衍生的那些[Sambrook等人(1989)“克隆基因在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)”《分子克隆實驗指南》]。
通常,上述組件,包括啟動子、聚腺苷酸化信號以及轉(zhuǎn)錄終止序列被一起放入表達(dá)構(gòu)建物中。如果需要,表達(dá)構(gòu)建物中還包括增強(qiáng)子、具有功能性剪接供體和受體位點的內(nèi)含子以及前導(dǎo)序列。構(gòu)建物的表達(dá)通常以復(fù)制子形式維持,例如是能在宿主(如哺乳動物細(xì)胞或細(xì)菌)中穩(wěn)定維持的染色體外元件(如質(zhì)粒)。哺乳動物復(fù)制系統(tǒng)包括從動物病毒衍生的那些系統(tǒng),其需要反式作用因子來進(jìn)行復(fù)制。例如,含有乳多空病毒復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒,如SV40[Gluzman(1981)Cell 23175]或多瘤病毒,在合適的病毒T抗原的存在下復(fù)制出極高的拷貝數(shù)。哺乳動物復(fù)制子的其它例子包括衍生自牛乳頭瘤病毒和EB病毒的復(fù)制子。另外,復(fù)制子可以有兩個復(fù)制系統(tǒng),從而使其能維持在例如哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)并能在原核宿主中克隆和擴(kuò)增。這些哺乳動物細(xì)菌穿梭載體的例子包括pMT2[Kaufman等人(1989)Mol.Cell.Biol.9946]和pHEBO[Shimizu等人(1986)Mol.Cell.Biol.61074]。
所用的轉(zhuǎn)化步驟取決于待轉(zhuǎn)化的宿主。將異源多核苷酸導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域所知的,其包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、Polybrene(1,5-二甲基-1,5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、將多核苷酸包裹在脂質(zhì)體中以及將DNA直接顯微注射到胞核中。
可作為宿主進(jìn)行表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞系是本領(lǐng)域中已知的,其包括許多從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的無限增殖的細(xì)胞系,包括但不局限于,中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、海拉細(xì)胞、乳倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(如Hep G2)和其它許多細(xì)胞系。
ii.桿狀病毒系統(tǒng)也可將編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸插入合適的昆蟲表達(dá)載體中,并與該載體中的控制元件操作性相連。載體構(gòu)建采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)??偟貋碚f,表達(dá)系統(tǒng)的組分包括一種轉(zhuǎn)移載體,通常是細(xì)菌質(zhì)粒,其含有桿狀病毒基因組片段以及便于插入待表達(dá)異源基因的限制性位點;野生型桿狀病毒,其序列與轉(zhuǎn)移載體中的桿狀病毒特異性片段同源(這使得異源基因能同源重組到桿狀病毒基因組中);以及合適的昆蟲宿主細(xì)胞和生長培養(yǎng)基。
將編碼蛋白質(zhì)的DNA序列插入轉(zhuǎn)移載體中后,將載體和野生型病毒基因組轉(zhuǎn)染到昆蟲宿主細(xì)胞中,使載體和病毒基因組重組。表達(dá)包裝的重組病毒,鑒定并純化重組噬斑。桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)材料及其方法,除別的以外,可以試劑盒形式購自Invitrogen,San Diego CA(″MaxBac″試劑盒)。這些技術(shù)通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的,在Summers和Smith的Texas AgriculturalExperiment Station Bulletin No.1555(1987)(后稱“Summer和Smith的文章”)中有充分描述。
在將編碼蛋白質(zhì)的DNA序列插入桿狀病毒基因組之前,通常將上述組件,包括啟動子、前導(dǎo)序列(如果需要)、感興趣的編碼序列以及轉(zhuǎn)錄終止序列裝配在中間置換型構(gòu)建物(轉(zhuǎn)移載體)中。該構(gòu)建物可含有單個基因以及操作性相連的調(diào)控元件;多個基因,每個基因有其自己的一套操作性相連調(diào)控元件;或是由同一組調(diào)控元件調(diào)控的多個基因。中間置換型構(gòu)建物通常保持在一個復(fù)制子中,例如能在宿主(如細(xì)菌)內(nèi)穩(wěn)定保持的染色體外元件(如質(zhì)粒)。復(fù)制子將具有一個復(fù)制系統(tǒng),從而使其能保持在合適的宿主中進(jìn)行克隆和擴(kuò)增。
目前,用來將外源基因?qū)階cNPV的最常用的轉(zhuǎn)移載體是pAc373。還可設(shè)計本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它許多載體。這些載體包括如pVL985(其將多角體蛋白的起始密碼子從ATG變?yōu)锳TT,并在ATT下游32個堿基對處引入一個BamHI克隆位點;見Luckow和Summers,Virology(1989)1731)。
質(zhì)粒通常還含有多角體蛋白聚腺苷酸化信號(Miller等人(1988)Ann.Rev.Microbiol.,42177)以及用來在大腸桿菌中選擇和繁殖的原核氨芐青霉素抗性(amp)基因和復(fù)制起點。
桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體通常含有桿狀病毒啟動子。桿狀病毒啟動子是能結(jié)合桿狀病毒RNA聚合酶并啟動編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)下游(5′到3′)轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動子具有一個轉(zhuǎn)錄起始區(qū),該區(qū)通常鄰近編碼序列的5′端。該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括一個RNA聚合酶結(jié)合位點以及一個轉(zhuǎn)錄起始位點。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體還可能具有稱為增強(qiáng)子的第二區(qū),如果該區(qū)域存在,它通常遠(yuǎn)離結(jié)構(gòu)基因。表達(dá)可以是調(diào)控型或組成型的。
在病毒感染周期晚期大量轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)基因提供了特別有用的啟動子序列。例子包括從編碼病毒多角體蛋白的基因衍生獲得的序列,F(xiàn)riesen等人(1986)“桿狀病毒基因表達(dá)的調(diào)控”《桿狀病毒分子生物學(xué)》(Walter Doerfler編輯);EPO公開號127 839和155 476;以及編碼p10蛋白的基因,Vlak等人(1988),J.Gen.Virol.69765。
編碼合適的信號序列的DNA可以衍生自分泌的昆蟲或桿狀病毒蛋白的基因(如桿狀病毒多角體蛋白基因)(Carbonell等人,(1988)Gene,73409)。另外,由于哺乳動物細(xì)胞翻譯后修飾(如信號肽斷裂、蛋白水解斷裂和磷酸化)的信號看來可被昆蟲細(xì)胞識別,且分泌和胞核積累所需的信號看來在無脊椎動物細(xì)胞和脊椎動物細(xì)胞之間是保守的,因此也可用非昆蟲來源的前導(dǎo)序列來提供昆蟲中的分泌,這些前導(dǎo)序列例如是從編碼人α-干擾素(Maeda等人(1985),Nature315592)、人胃泌素釋放的肽(Lebacq-Verheyden等人(1988),Molec.Cell.Biol.83129)、人IL-2(Smith等人(1985)Proc.Nat’l.Acad Sci.USA,828404)、小鼠IL-3(Miyaiima等人(1987)Gene 58273)和人葡糖腦苷脂酶(Martin等人(1988)DNA,799)的基因衍生獲得的。
重組多肽或聚蛋白可以在胞內(nèi)表達(dá),或如果它是用合適的調(diào)控序列表達(dá)的,就可被分泌。非融合的外源蛋白良好的胞內(nèi)表達(dá)通常需要理想地具有短前導(dǎo)序列的異源基因在ATG起始信號前有合適的翻譯起始信號。如果需要,可通過和溴化氰體外培育,從成熟蛋白上切下N端甲硫氨酸。
另外,通過產(chǎn)生嵌合的DNA分子將非天然分泌的重組聚蛋白或蛋白從昆蟲細(xì)胞中分泌出來,該嵌合的DNA分子所編碼的融合蛋白包含一前導(dǎo)序列片段,該片段提供了從昆蟲中分泌外源蛋白的作用。該前導(dǎo)序列片段通常編碼一種信號肽,該信號肽包含的疏水性氨基酸引導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
在插入了編碼該蛋白表達(dá)產(chǎn)物前體的DNA序列和/或基因后,用轉(zhuǎn)移載體的異源DNA和野生型桿狀病毒的基因組DNA共同轉(zhuǎn)化(通常是共轉(zhuǎn)染)昆蟲細(xì)胞宿主。此構(gòu)建物的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列通常包含桿狀病毒基因組2-5kb片段。將異源DNA引入桿狀病毒中所需位點內(nèi)的方法是本領(lǐng)域所知的。(見Summers和Smith的文章,同上;Ju等人(1987);Smith等人,Mol.Cell.Biol.(1983)32156;和Luckow和Summers(1989))。例如,插入可以是通過同源雙交換重組來插入一個基因如多角體蛋白基因中;插入還可以是插入構(gòu)建的所需桿狀病毒基因內(nèi)的限制性酶切位點中。Miller等人(1989),Bioessays 491。當(dāng)DNA序列被克隆在表達(dá)載體多角體蛋白基因位置中時,其5′和3′均側(cè)接了多角體蛋白特異性序列,并位于多角體蛋白啟動子的下游。
隨后將新形成的桿狀病毒表達(dá)載體包裝到感染性重組桿狀病毒中。發(fā)生頻率很低(在約1%和5%之間)的同源重組;因此,共轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生的大多數(shù)病毒仍是野生型病毒。因此,需要用一種方法來鑒別重組病毒。該表達(dá)系統(tǒng)的一個優(yōu)點是肉眼篩選能區(qū)分重組病毒。在病毒感染后期,天然病毒產(chǎn)生的多角體蛋白在受其感染細(xì)胞的胞核中產(chǎn)生的水平非常高。累積的多角體蛋白形成的包涵體,其還含有包埋顆粒。這些大小至多為15微米的包涵體具有高度的折光性,從而使它們呈現(xiàn)明亮的發(fā)光外觀,在光學(xué)顯微鏡下很容易觀察。感染了重組病毒的細(xì)胞缺少包涵體。為了區(qū)分重組病毒和野生型病毒,用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將轉(zhuǎn)染上清接種到單層昆蟲細(xì)胞上形成噬斑。即,在光學(xué)顯微鏡下篩選存在(表明是野生型病毒)或不存在(表明是重組病毒)包涵體的噬斑?!爱?dāng)代微生物學(xué)方法”第2卷(Ausubel等人編輯),16.8(增補(bǔ)10,1990);Summers和Smith的文章,同上;Miller等人(1989)。
已經(jīng)開發(fā)出感染進(jìn)入幾種昆蟲細(xì)胞的重組桿狀病毒表達(dá)載體。例如,已經(jīng)開發(fā)出用于感染以下昆蟲細(xì)胞的重組桿狀病毒埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿丫紋夜蛾(Autographa californica)、家蠶(Bombyx mori)、黑尾果蠅(Drosophilamelanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉紋夜蛾(Trichoplusiani)(WO 89/046699;Carbonell等人(1985)J.Virol.56153;Wright(1986)Nature321718;Smith等人(1983)Mol.Cell.Biol.32156;綜述見Fraser等人(1989)InVitro Cell.Dev.Biol.25225)。
可以購得細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基用于在桿狀病毒/表達(dá)系統(tǒng)中直接表達(dá)和融合表達(dá)異源多肽;細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所知的。參見Summers和Smith的文章,同上。
然后,經(jīng)修飾的昆蟲細(xì)胞可以生長在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中,該培養(yǎng)基能穩(wěn)定地保持該質(zhì)粒于修飾的昆蟲宿主中。當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物的基因處于可誘導(dǎo)的控制下時,可以使宿主生長至高密度,并誘導(dǎo)表達(dá)。另外,當(dāng)表達(dá)是組成型時,產(chǎn)物將被連續(xù)表達(dá)到培養(yǎng)基中,營養(yǎng)性培養(yǎng)基必需不斷循環(huán),取出感興趣的產(chǎn)物同時補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物。產(chǎn)物可用以下這些技術(shù)來純化例如層析,如HPLC、親和層析、離子交換層析等;電泳;密度梯度離心;溶劑抽提等。產(chǎn)物可按需作進(jìn)一步純化,以基本上除去所有也分泌到培養(yǎng)基中或由昆蟲細(xì)胞裂解而產(chǎn)生的昆蟲蛋白,以提供一種至少基本上不含宿主碎片如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多糖的產(chǎn)物。
為了獲得蛋白質(zhì)的表達(dá),將從轉(zhuǎn)化子衍生獲得的重組宿主細(xì)胞培育在允許重組蛋白的編碼序列表達(dá)的條件下。這些條件將隨所選定的宿主細(xì)胞而變。然而,本領(lǐng)域技術(shù)人員容易根據(jù)本領(lǐng)域已知的知識來確定該條件。
iii.植物系統(tǒng)本領(lǐng)域已知有許多植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和全植物遺傳表達(dá)系統(tǒng)。典型的植物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)包括在以下專利中描述的那些,如US 5,693,506;US5,659,122;和US 5,608,143。Zenk,Phytochemistry 303861-3863(1991)中描述了在植物細(xì)胞培養(yǎng)物中遺傳表達(dá)的其它例子。除上述參考文獻(xiàn)外,關(guān)于植物蛋白信號肽的描述還可在下列文獻(xiàn)中找到Vaulcombe等人,Mol.Gen.Genet.20933-40(1987);Chandler等人,Plant Molecular Biology 3407-418(1984);Rogers,J.Biol.Chem.2603731-3738(1985);Rothstein等人,Gene 55353-356(1987);Whittier等人,Nucleic Acids Research 152515-2535(1987);Wirsel等人,Molecular Microbiology 33-14(1989);Yu等人,Gene 122247-253(1992)。關(guān)于用植物激素、赤霉素酸和赤霉素酸誘導(dǎo)分泌的酶調(diào)節(jié)植物基因表達(dá)的描述可在R.L.Jones和J.MacMillin,Gibberellins,《植物生理學(xué)進(jìn)展》,Malcolm B.Wilkins編輯,1984 Pitman Publishing Limited,London,21-52頁中找到。描述其它調(diào)節(jié)代謝的基因的參考文獻(xiàn)參見Sheen,Plant Cell,21027-1038(1990);Maas等人,歐洲分子生物學(xué)協(xié)會雜志(EMBO J.)93447-3452(1990);Benkel和Hickey,美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.).841337-1339(1987)。
通常,利用本領(lǐng)域已知的技術(shù),將所需的多核苷酸序列插入一表達(dá)盒中,該表達(dá)盒含有為在植物中操作而設(shè)計的基因調(diào)控元件。將該表達(dá)盒插入所需的表達(dá)載體中,表達(dá)盒的上游和下游有適合在植物宿主中表達(dá)的伴隨序列。這些伴隨序列可來自質(zhì)?;虿《?,并為載體提供所需的性能,以允許載體將DNA從起初的克隆宿主(如細(xì)菌)中移動到所需植物宿主中?;A(chǔ)的細(xì)菌/植物載體構(gòu)建物最好能提供寬的宿主范圍原核復(fù)制起點;原核可選擇的標(biāo)記;以及,對于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化而言,宜提供T DNA序列用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移至植物染色體。當(dāng)異源基因不易檢測時,該構(gòu)建物最好還具有一個適用于確定植物細(xì)胞是否已經(jīng)轉(zhuǎn)化的可選擇標(biāo)記基因。關(guān)于合適標(biāo)記(例如對于禾草類家族成員)的綜述可在Wilmink和Dons,1993,Plant Mol.Biol.Reptr,11(2)165-185中找到。
還建議采用適合將異源序列整合到植物基因組中的序列。這些序列可能包括用于同源重組的轉(zhuǎn)座子序列以及允許將異源表達(dá)盒隨機(jī)插入植物基因組中的Ti序列。合適的原核可選擇標(biāo)記包括抗生素(如氨芐青霉素或四環(huán)素)抗性標(biāo)記。編碼其它功能的其它DNA序列也可存在于載體中,這是本領(lǐng)域所知的。
本發(fā)明的核酸分子可包括在一個表達(dá)盒中來表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)。通常只要一個表達(dá)盒,但是兩個或多個表達(dá)盒也是可行的。除了編碼異源蛋白的序列外,重組表達(dá)盒還含有下列元件啟動子區(qū)域、植物5′非翻譯序列、起始密碼子(根據(jù)結(jié)構(gòu)基因原來是否具有而定)、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止序列。表達(dá)盒5′和3′端的獨特限制性酶位點能使表達(dá)盒方便地插入預(yù)先存在的載體中。
異源編碼序列可以用于任何與本發(fā)明有關(guān)的蛋白。編碼感興趣的蛋白的序列將編碼出一個信號肽,該信號肽能適當(dāng)?shù)丶庸ず娃D(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì),并且通常缺少可能會導(dǎo)致本發(fā)明的所需蛋白與膜結(jié)合的序列。由于對于大部分來說,轉(zhuǎn)錄起始區(qū)將針對發(fā)芽期間表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因,采用提供轉(zhuǎn)運(yùn)的信號肽,也可提供轉(zhuǎn)運(yùn)感興趣的蛋白質(zhì)。通過這種方式,感興趣的蛋白將從表達(dá)該蛋白的細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)出來,并能被有效地收獲。通常,種子中的分泌是通過糊粉或小盾體上皮層進(jìn)入種子的胚乳。盡管不需要使蛋白從產(chǎn)生該蛋白的細(xì)胞中分泌出來,但是這種分泌有利于重組蛋白的分離和純化。
由于所需基因產(chǎn)物的最終表達(dá)將在真核細(xì)胞中進(jìn)行,因此需要確定克隆的基因部分是否含有作為內(nèi)含子被宿主剪接體機(jī)制加工的序列。如果是這樣,需要對“內(nèi)含子”區(qū)進(jìn)行定點誘變,以防止一部分遺傳信息作為錯誤的內(nèi)含子密碼而喪失,Reed和Maniatis,Cell 4195-105,1985。
可用微量移液管以機(jī)械方式轉(zhuǎn)移重組DNA,將載體直接顯微注射到植物細(xì)胞中。Crossway,Mol.Gen.Genet,202179-185。還可用聚乙二醇將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中,Krens等人,Nature,296,72-74,1982。導(dǎo)入核酸片段的另一種方法是用小顆粒進(jìn)行高速彈道貫穿,在這些小珠或顆粒的基質(zhì)中或表面上帶有核酸,Klein等人,Nature,327,70-73,1987,Knudsen和Muller,1991,Planta,185330-336提出用顆粒轟擊大麥胚乳以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因大麥。還有一種導(dǎo)入方法是使原生質(zhì)體和其它實體(微細(xì)胞(minicell)、細(xì)胞、溶酶體或其它可融合的脂質(zhì)表面體)融合,F(xiàn)raley等人,美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),79,1859-1863,1982。
載體也可通過電穿孔導(dǎo)入植物細(xì)胞中。(Fromm等人,PNAS825824,1958)。在該技術(shù)中,在含有基因構(gòu)建物的質(zhì)粒存在下電穿孔植物原生質(zhì)體。高電場強(qiáng)度的電脈沖使生物膜可逆地被通透,從而允許導(dǎo)入質(zhì)粒。電穿孔的植物原生質(zhì)體重新形成細(xì)胞壁,分裂并形成植物愈傷組織。
能分離出原生質(zhì)體并能培育成全再生植物的所有植物,都能用本發(fā)明進(jìn)行轉(zhuǎn)化,從而回收得到含有轉(zhuǎn)基因的全植物。已經(jīng)知道實際上可以從培育的細(xì)胞或組織再生所有的植物,其包括但不局限于,甘蔗、甜菜、棉花、果實和其它樹、豆科植物和蔬菜的所有主要種類。一些合適的植物包括,例如,草莓屬、蓮花屬、苜蓿屬、驢食豆屬、三葉草屬、胡盧巴屬、豇豆屬、柑橘屬、亞麻屬、老鸛草屬、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜屬(Daucus)、鼠耳芥屬、蕓苔屬、蘿卜屬、白芥屬、顛茄屬、辣椒屬、曼陀羅屬、天仙子屬、番茄屬、煙草屬、茄屬、碧冬茄屬、毛地黃屬、Majorana、菊苣屬、向日葵屬、萵苣屬、雀麥屬、天門冬屬、金魚草屬、龍骨角屬、龍面花屬(Nemesia)、天竺葵屬、稷屬、狼尾草屬、毛茛屬、千里光屬、蛾蝶花屬(Salpiglossis)、香瓜屬、Browaalia、大豆屬、黑麥草屬、玉蜀黍?qū)?、小麥屬、蜀黍?qū)俸吐恿_屬各種類。
再生方式隨各種植物而有所不同,但是通常是首先提供含有異源基因拷貝的轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體懸液。形成愈傷組織,從愈傷組織中誘生出枝條,隨后是根。另外,從原生質(zhì)體懸液可以誘生形成胚。這些胚象天然的胚那樣發(fā)芽形成植物。培養(yǎng)基通常含有各種氨基酸和激素,如植物生長素和細(xì)胞分裂素。尤其是對于玉米和苜蓿屬來說,在培養(yǎng)基中加入谷氨酸和脯氨酸也是很有利的。枝條和根通常同時發(fā)育。有效的再生取決于培養(yǎng)基、基因型以及培養(yǎng)史。如果控制了這三個變量,那么再生能完全再現(xiàn)和重復(fù)。
在一些植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中,本發(fā)明所需的蛋白可能被分泌出來,或者蛋白可從全植物中提取出來。當(dāng)本發(fā)明所需的蛋白被分泌到培養(yǎng)基中后,就可進(jìn)行收集?;蛘?,可以用機(jī)械方式破碎胚以及無胚-半種子或其它植物組織,以釋放出分泌到細(xì)胞和組織之間的蛋白。將該混合物懸于緩沖液中,以收回可溶性蛋白。然后用常規(guī)的蛋白分離和純化方法純化重組蛋白。用常規(guī)方法調(diào)節(jié)時間、溫度、pH、氧和體積等參數(shù),以優(yōu)化異源蛋白的表達(dá)和回收。
iv.細(xì)菌系統(tǒng)細(xì)菌表達(dá)技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。細(xì)菌啟動子是能結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶并啟動下游(3′)編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列。啟動子具有一個轉(zhuǎn)錄起始區(qū),其通常位于編碼序列的5′端附近。該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點以及一個轉(zhuǎn)錄起始位點。細(xì)菌啟動子可能還有第二個功能區(qū)域稱為操縱子,它可能與毗鄰的RNA合成開始的RNA聚合酶結(jié)合位點重疊。該操縱子允許負(fù)調(diào)節(jié)(可誘導(dǎo))的轉(zhuǎn)錄,因為基因阻遏蛋白可能結(jié)合操縱子并因而抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄。在負(fù)調(diào)節(jié)元件(如操縱子)不存在時,可能發(fā)生組成型表達(dá)。另外,正調(diào)節(jié)可通過基因激活蛋白結(jié)合序列來實現(xiàn),如果有的話,該結(jié)合序列通常鄰近RNA聚合酶結(jié)合序列的(5′)?;蚣せ畹鞍椎睦邮欠纸獯x物激活劑蛋白(CAP),它幫助啟動大腸桿菌(E.coli)中的lac操縱子的轉(zhuǎn)錄[Raibaud等人(1984)Annu.Rev.Genet.18173]。因此,表達(dá)的調(diào)控可能是正作用或負(fù)作用,從而增強(qiáng)或減弱轉(zhuǎn)錄。
編碼代謝途徑中的酶的序列提供了特別有用的啟動子序列。例子包括衍生自糖(如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人(1977)Nature 1981056]和麥芽糖)代謝酶的啟動子序列。其它例子包括衍生自生物合成酶(如色氨酸(trp))[Goeddel等人(1980)Nuc.Acids Res.84057;Yelverton等人(1981)Nucl.Acids Res.9731;美國專利4,738,921;EP-A-0036776和EP-A-0121775]的啟動子序列。β-內(nèi)酰胺酶(bla)啟動子系統(tǒng)[Weissmann(1981)″干擾素的克隆和其它錯誤″《干擾素3》(I.Gresser編輯)],λ噬菌體PL[Shimatake等人(1981)Nature 292128]和T5[美國專利4,689,406]啟動子系統(tǒng)也提供了有用的啟動子序列。
另外,非天然存在的合成的啟動子也可象細(xì)菌啟動子一樣起作用。例如,一種細(xì)菌或噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄激活序列可以和另一種細(xì)菌或噬菌體啟動子的操縱子序列連接在一起,形成合成的雜交啟動子[美國專利4,551,433]。例如,tac啟動子是雜合的trp-lac啟動子,它由trp啟動予以及受lac阻遏蛋白調(diào)節(jié)的lac操縱子序列組成[Amann等人(1983)Gene 25167;de Boer等人,(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.8021]。另外,細(xì)菌啟動子可包括非細(xì)菌來源但能結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶并啟動轉(zhuǎn)錄的天然存在的啟動子。天然存在的非細(xì)菌來源的啟動子還能和相容的RNA聚合酶偶聯(lián)在一起,從而在原核細(xì)胞中高水平地表達(dá)某些基因。噬菌體T7 RNA聚合酶/啟動子系統(tǒng)就是一種偶聯(lián)的啟動子系統(tǒng)[Studier等人(1986)J.Mol.Biol.189113;Tabor等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.821074]。另外,雜合的啟動子還可由噬菌體啟動子以及大腸桿菌操縱子區(qū)域組成(EP-A-0267 851)。
除了有功能的啟動子序列外,有效的核糖體結(jié)合位點對于外來基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)也是有用的。在大腸桿菌中,核糖體結(jié)合位點稱為Shine-Dalgarno(SD)序列,其包括起始密碼子(ATG)以及在起始密碼子上游3-11個核苷酸處的長度為3-9個核苷酸的序列[Shine等人(1975)Nature 25434]。認(rèn)為SD序列是通過SD序列和大腸桿菌16S rRNA的3′端之間堿基配對來促進(jìn)mRNA與核糖體結(jié)合的[Steitz等人(1979)″信使RNA中的遺傳信號和核苷酸序列″生物學(xué)調(diào)節(jié)和發(fā)育基因表達(dá)″(編者R.F.Goldberger)]。為了表達(dá)具有弱的核糖體結(jié)合位點的原核基因和真核基因[Sambrook等人(1989)″克隆基因在大腸桿菌中的表達(dá)″《分子克隆實驗手冊》]。
DNA分子可以在胞內(nèi)表達(dá)。啟動子序列可以直接與DNA分子相連,在這種情況下,N端的第一個氨基酸始終是甲硫氨酸,其由ATG起始密碼子編碼。如果需要,可通過和溴化氰體外培育或通過和細(xì)菌甲硫氨酸N-端肽酶體內(nèi)或體外培育,將N端的甲硫氨酸從蛋白質(zhì)上切下(EP-A-0219 237)。
融合蛋白為直接表達(dá)提供了另一種方法。通常,將編碼內(nèi)源細(xì)菌蛋白或其它穩(wěn)定的蛋白之N端部分的DNA序列與異源編碼序列的5′端融合。在表達(dá)時,該構(gòu)建物將提供這兩個氨基酸序列的融合物。例如,λ噬菌體細(xì)胞基因可以和外源基因的5′端相連并在細(xì)菌中表達(dá)。所得融合蛋白宜保留一個酶(因子Xa)加工位點,以便將噬菌體蛋白與外源基因切開[Nagai等人(1984)Nature 309810]。融合蛋白也可用lacZ[Jia等人(1987)Gene 60197],trpE[Allen等人(1987)J.Biotechnol.593;Makoff等人(1989),J.Gen.Microbiol.13511]以及Chey[EP-A-0324 647]基因的序列組成。兩個氨基酸序列連接處的DNA序列可以編碼或不編碼一可切割的位點。另一個例子是遍在蛋白融合蛋白。這種融合蛋白由遍在蛋白區(qū)域組成,該區(qū)域宜保留一個酶(例如遍在蛋白特異性加工蛋白酶)加工位點,以便將外源蛋白和遍在蛋白切開。通過這種方法,可以分離獲得天然的外源蛋白[Miller等人(1989)Bio/Technology 7698]。
另外,還可通過產(chǎn)生嵌合的DNA分子來將外源蛋白分泌出細(xì)胞,該嵌合的DNA分子編碼的融合蛋白含有一個信號肽序列片段,該序列片段能使細(xì)菌中的外源蛋白分泌出來[美國專利4,336,336]。信號序列片段通常編碼一個信號肽,該信號肽含有疏水性氨基酸,能指引蛋白分泌出細(xì)胞。蛋白質(zhì)被分泌到生長培養(yǎng)基(革蘭陽性菌)中或細(xì)胞內(nèi)膜和外膜之間的周質(zhì)間隙內(nèi)(革蘭陰性菌)。在編碼的信號肽片段和外源基因之間宜具有能在體內(nèi)或體外切割的加工位點。
編碼合適信號序列的DNA可以從分泌性細(xì)菌蛋白的基因衍生獲得,這些基因例如是大腸桿菌外膜蛋白基因(ompA)[Masui等人(1983),《基因表達(dá)的實驗操作》;Ghrayeb等人(1984)EMBO J.32437]以及大腸桿菌堿性磷酸酶信號序列(phoA)[Oka等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.827212]。另一個例子是,可采用各種芽孢桿菌菌株的α淀粉酶基因的信號序列將異源蛋白分泌出枯草芽孢桿菌[Palva等人(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582;EP-A-0244 042]。
通常,細(xì)菌所識別的轉(zhuǎn)錄終止序列是位于翻譯終止密碼子3′的調(diào)控區(qū),它和啟動子一起側(cè)接在編碼序列的兩側(cè)。這些序列指導(dǎo)mRNA的轉(zhuǎn)錄,而mRNA能被翻譯成該DNA所編碼的多肽。轉(zhuǎn)錄終止序列通常包括約50個核苷酸的DNA序列,該序列能形成幫助終止轉(zhuǎn)錄的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。例子包括衍生自具有強(qiáng)啟動子的基因(如大腸桿菌中的trp基因以及其它生物合成的基因)的轉(zhuǎn)錄終止序列。
上述組件,包括啟動子、信號序列(如果需要)、感興趣的編碼序列以及轉(zhuǎn)錄終止序列通常一起被放在表達(dá)構(gòu)建物中。表達(dá)構(gòu)建物通常以復(fù)制子的形式維持,例如能在宿主(如細(xì)菌)中穩(wěn)定維持的染色體外元件(如質(zhì)粒)。復(fù)制子具有一個復(fù)制系統(tǒng),從而允許其維持在原核宿主中或進(jìn)行表達(dá)或進(jìn)行克隆和擴(kuò)增。另外,復(fù)制子可以是高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。高拷貝數(shù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)大致在約5至200之間,通常在約10至150之間。含有高拷貝數(shù)質(zhì)粒的宿主宜含有至少約10個質(zhì)粒,更佳的含有至少約20個質(zhì)粒。根據(jù)載體以及外源蛋白對宿主的影響,可以選擇高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的載體。
另外,表達(dá)構(gòu)建物可以和一個整合載體一起整合入細(xì)菌基因組中。整合載體通常含有至少一個序列與細(xì)菌染色體同源,從而允許該載體整合。整合看來是載體和細(xì)菌染色體中的同源DNA之間重組的結(jié)果。例如,用不同芽孢桿菌菌株的DNA構(gòu)建的整合載體整合到芽孢桿菌染色體中(EP-A-0127 328)。整合載體還可包含噬菌體或轉(zhuǎn)座子序列。
通常,染色體外構(gòu)建物以及整合的表達(dá)構(gòu)建物可含有可選擇的標(biāo)記,以便選擇已經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株??蛇x擇標(biāo)記可在細(xì)菌宿主中表達(dá),其包括賦予細(xì)菌對藥物(如氨芐青霉素、氯霉素、紅霉素、卡那霉素(新霉素)和四環(huán)素)抗性的基因[Davies等人(1978)Annu.Rev.Microbiol.32469]。可選擇標(biāo)記還可包括生物合成性基因,如在組氨酸、色氨酸以及亮氨酸生物合成途徑中的那些基因。
另外,上述某些組件可以一起放在轉(zhuǎn)化載體中。轉(zhuǎn)化載體通常包含一個可選擇標(biāo)記,如上所述,該載體以復(fù)制子形式維持或發(fā)展成一個整合載體。
已經(jīng)開發(fā)出了用于轉(zhuǎn)化到許多細(xì)菌中的表達(dá)和轉(zhuǎn)化載體(無論是染色體外復(fù)制子還是整合載體)。例如,已經(jīng)開發(fā)出了用于下列細(xì)菌的表達(dá)載體枯草芽孢桿菌[Palva等人,(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582;EP-A-0036 259和063 953;WO 84/04541],大腸桿菌[Shimatake等人,(1981)Nature 292128;Amann等人,(1985)Gene 40183;Studier等人,(1986)J.Mol.Biol.189113;EP-A-0036 776、136 829和136 907],酪鏈球菌[Powell等人,(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655];淺青紫鏈球菌[Powell等人,(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655],淺青紫鏈霉菌[美國專利4,745,056]。
將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主的方法是本領(lǐng)域熟知的,通常包括用氯化鈣或其它試劑(如二價陽離子和二甲亞砜)處理對細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。DNA還可通過電穿孔方法導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)化程序通常因待轉(zhuǎn)化的細(xì)菌種類而不同。[例如參見,例如使用桿菌Masson等人,(1989)FEMS Microbiol.Lett.60273;Palva等人,(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582;EP-A-0036 259和063 953;WO84/04541;使用彎曲桿菌Miller等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85856;和Wang等人,(1990)J.Bacteriol.172949;使用埃希氏大腸桿菌Cohen等人,(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.692110;Dower等人,(1988)Nucleic Acids Res.166127;Kushner(1978)″用ColEl-衍生質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的改進(jìn)方法″GeneticEngineeringProceedings of the International Symposium on Genetic Engineering(H.W.Boyer和S.Nicosia編輯);Mandel等人,(1970)J.Mol.Biol.53159;Taketo(1988)Biochim.Biophys.Acta 949318;使用乳酸桿菌Chassy等人,(1987)FEMSMicrobiol.Lett.44173;使用假單胞菌Fiedler等人,(1988)Anal.Biochem17038;使用葡萄球菌Augustin等人,(1990)FEMS Microbiol.Lett.66203;使用鏈球菌Barany等人,(1980)J.Bacteriol.144698;Harlander(1987)″用電穿孔轉(zhuǎn)化鏈球菌產(chǎn)乳酸微生物″Streptococcal Genetics(J.Ferretti和R.CurtissIII編輯);Perry等人,(1981)Infect.Immun.321295;Powell等人,(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655;Somkuti等人,(1987)Proc.4th Evr.Cong.Biotechnology 1412]。
v.酵母表達(dá)酵母表達(dá)系統(tǒng)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。酵母啟動子是能結(jié)合酵母RNA聚合酶并啟動下游(3′)編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列。啟動子具有一個轉(zhuǎn)錄起始區(qū),它通常位于編碼序列的5′端附近。該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點(″TATA盒″)以及一個轉(zhuǎn)錄起始位點。酵母啟動子可能還有第二個功能區(qū)域稱為上游激活序列(UAS),如果存在的話,它通常遠(yuǎn)離結(jié)構(gòu)基因。UAS允許調(diào)節(jié)(可誘導(dǎo))的表達(dá)。在UAS不存在時,發(fā)生組成型表達(dá)。表達(dá)的調(diào)控可能是正作用或負(fù)作用的,從而增強(qiáng)或減弱轉(zhuǎn)錄。
酵母是一種發(fā)酵生物體,具有活潑的代謝途徑,因此編碼代謝途徑中的酶的序列提供了特別有用的啟動子序列。例子包括醇脫氫酶(ADH)(EP-A-0284044)、烯醇酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸變位酶、以及丙酮酸激酶(PyK)(EP-A-0329 203)。編碼酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也提供了有用的啟動子序列[Myanohara等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 801]。
另外,非天然存在的合成的啟動子也可象酵母啟動子一樣起作用。例如,一種酵母啟動子的UAS序列可以和另一種酵母啟動子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)連接在一起,形成合成的雜合啟動子。這種雜合啟動子的例子包括與GAP轉(zhuǎn)錄激活區(qū)相連的ADH調(diào)控序列(美國專利No.4,876,197和4,880,734)。雜合啟動子的其它例子包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的調(diào)控序列組成的啟動子與糖酵解酶基因如GAP或PyK的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的組合(EP-A-0164 556)。另外,酵母啟動子可包括非酵母來源但能結(jié)合酵母RNA聚合酶并啟動轉(zhuǎn)錄的天然存在的啟動子。這些啟動子的例子包括,尤其是,[Cohen等人,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 771078;Henikoff等人,(1981)Nature 283835;Hollenberg等人,(1981)Curr.Topics Microbiol.Immunol.96119;Hollenberg等人,(1979)″細(xì)菌抗生素抗性基因在釀酒酵母中的表達(dá)″Plasmids of Medical,Environmentaland Commercial Importance(K.N.Timmis和A.Puhler編輯);Mercerau-Puigalon等人,(1980)Gene 11163;Panthier等人,(1980)Curr.Genet.2109]。
DNA分子可以在酵母菌胞內(nèi)表達(dá)。啟動子序列可以直接與DNA分子相連,在這種情況下,重組蛋白N端的第一個氨基酸始終是甲硫氨酸,其由ATG起始密碼子編碼。如果需要,可通過和溴化氰體外培育將N端的甲硫氨酸從蛋白質(zhì)上切下。
象在哺乳動物、桿狀病毒以及細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中一樣,融合蛋白為酵母表達(dá)系統(tǒng)提供了另一種方法。通常,將編碼內(nèi)源酵母蛋白或其它穩(wěn)定的蛋白之N端部分的DNA序列與異源編碼序列的5′端融合。在表達(dá)時,該構(gòu)建物將提供這兩個氨基酸序列的融合物。例如,酵母或人超氧化物歧化酶(SOD)基因可以和外源基因5′端相連并在酵母中表達(dá)。兩個氨基酸序列連接處的DNA序列可以編碼或不編碼可切割的位點。例如參見EP-A-0196 056。另一個例子是遍在蛋白融合蛋白。這種融合蛋白由遍在蛋白區(qū)域組成,該區(qū)域宜保留一個酶(例如遍在蛋白特異性加工蛋白酶)加工位點,以便將外源蛋白和遍在蛋白切開。因此,通過這種方法,可以分離獲得天然的外源蛋白(例如WO88/024066)。
另外,還可通過產(chǎn)生嵌合的DNA分子來將外源蛋白從細(xì)胞分泌到生長培養(yǎng)基中,該嵌合的DNA分子編碼的融合蛋白含有一個前導(dǎo)序列片段,該前導(dǎo)序列片段能使酵母中的外源蛋白分泌出來。較佳的,在編碼的前導(dǎo)片段和外來基因之間宜具有能在體內(nèi)或體外切割的加工位點。該前導(dǎo)序列片段通常編碼了含有疏水性氨基酸的信號肽,其引導(dǎo)蛋白從細(xì)胞分泌出來。
編碼合適信號序列的DNA可以從分泌性酵母蛋白的基因衍生獲得,這些基因例如有酵母轉(zhuǎn)化酶基因(EP-A-0012 873;JPO 62096,086)以及A-因子基因(美國專利4,588,684)。另外,非酵母來源的前導(dǎo)序列(如干擾素前導(dǎo)序列)的存在也能提供分泌出酵母的作用(EP-A-0060 057)。
較佳的一類分泌前導(dǎo)序列采用了酵母α-因子基因的片段,其含有″pre″信號序列和″pro″區(qū)??刹捎玫摩烈蜃悠蔚念愋桶ㄈLpre-proα因子前導(dǎo)序列(約83個氨基酸殘基)以及截短的α-因子前導(dǎo)序列(通常約25至50個氨基酸殘基)(美國專利4,546,083和4,870,008;EP-A-0324 274)。采用α-因子前導(dǎo)片段提供分泌作用的其它前導(dǎo)序列包括雜合的α-因子前導(dǎo)序列,其由第一個酵母的pre序列以及第二個酵母α因子的pro區(qū)域組成(例如見WO 89/02463)。
通常,酵母識別的轉(zhuǎn)錄終止序列是位于翻譯終止密碼子3′的調(diào)控區(qū),其和啟動子一起側(cè)接在編碼序列的兩側(cè)。這些序列指導(dǎo)mRNA的轉(zhuǎn)錄,而mRNA能被翻譯成該DNA所編碼的多肽。轉(zhuǎn)錄終止序列和其它酵母識別的終止序列的例子是編碼糖酵解酶的那些轉(zhuǎn)錄終止序列。
上述組件,包括啟動子、前導(dǎo)序列(如果需要時)、感興趣的編碼序列以及轉(zhuǎn)錄終止序列,通常被一起放在表達(dá)構(gòu)建物中。表達(dá)構(gòu)建物通常以復(fù)制子的形式保持,例如能在宿主(如酵母或細(xì)菌)中穩(wěn)定保持的染色體外元件(如質(zhì)粒)。復(fù)制子可能具有兩個復(fù)制系統(tǒng),從而允許其能維持在例如酵母中進(jìn)行表達(dá),并能維持在原核宿主進(jìn)行克隆和擴(kuò)增。這些酵母-細(xì)菌穿梭載體的例子包括YEp24[Botstein等人(1979)Gene 817-24],pCL/1[Brake等人,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 814642-4646]和YRp17[Stinchcomb等人(1982)J.Mol.Biol.158157]。另外,復(fù)制子可以是高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。高拷貝數(shù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)大致在約5至200之間,通常在約10至150之間。含有高拷貝數(shù)質(zhì)粒的宿主宜含有至少約10個質(zhì)粒,更佳的含有至少約20個質(zhì)粒。根據(jù)載體以及外源蛋白對宿主的影響,可以選擇高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的載體。例如參見Brake等人,同上。
另外,表達(dá)構(gòu)建物可以和一個整合載體一起整合入酵母基因組中。整合載體通常含有至少一個序列與酵母染色體同源,從而允許該載體整合,最好含有兩個同源序列側(cè)接該表達(dá)構(gòu)建物。整合看來是載體和酵母染色體中同源DNA之間重組的結(jié)果[Orr-Weaver等人(1983)Methods in Enzymol.101228-245]。通過選擇合適的同源序列插入載體中,可將整合載體導(dǎo)入酵母中某一特定的基因座。見Orr-Weaver等人,同上??梢哉先胍粋€或多個表達(dá)構(gòu)建物,這可能會影響重組蛋白產(chǎn)生的水平[Rine等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 806750]。載體中的染色體序列可以載體中的單個片段形式存在(從而導(dǎo)致整個載體的整合),或是與染色體中的相鄰片段同源的兩個片段,這兩個片段在載體中側(cè)接在表達(dá)構(gòu)建物兩側(cè),從而可導(dǎo)致僅表達(dá)構(gòu)建物的穩(wěn)定性整合。
通常,染色體外構(gòu)建物以及整合的表達(dá)可建物均含有可選擇的標(biāo)記,以便選擇已經(jīng)轉(zhuǎn)化的酵母菌株??蛇x擇標(biāo)記可包括能在酵母宿主中表達(dá)的生物合成基因(如ADE2、HIS4、LEU2、TRP1和ALG7以及G418抗性基因),這些基因分別賦予酵母細(xì)胞對衣霉素以及G418的抗性。另外,合適的可選擇標(biāo)記還可能為酵母在毒性化合物(如金屬)存在下提供生長能力。例如,CUP1的存在使酵母能在銅離子存在下生長[Butt等人,(1987)Microbiol,Rev.51351]。
另外,上述某些組件可以一起放在轉(zhuǎn)化載體中。轉(zhuǎn)化載體通常包含一個可選擇標(biāo)記,如上所述,該載體以復(fù)制子形式維持或發(fā)展成一個整合載體。
已經(jīng)開發(fā)出了用于轉(zhuǎn)化入許多酵母中的表達(dá)和轉(zhuǎn)化載體(無論是染色體外復(fù)制子還是整合載體)。例如,已經(jīng)開發(fā)出用于下列酵母菌的表達(dá)載體白色念珠菌[Kurtz,等人,(1986)Mol.Cell.Biol.6142],麥芽糖念珠菌[Kunze,等人,(1985)J.Basic Microbiol.25141],多形漢遜酵母[Gleeson,等人,(1986)J.Gen.Microbiol.1323459;Roggenkamp等人,(1986)Mol.Gen.Genet.202302],脆壁克魯維酵母[Das,等人,(1984)J.Bacteriol.1581165],乳酸克魯維酵母[DeLouvencourt等人,(1983)J.Bacteriol.154737;Van den Berg等人,(1990)Bio/Technology 8135],季也蒙畢赤酵母[Kunze等人,(1985)J.Basic Microbiol.25141],巴斯德畢赤酵母[Cregg,等人,(1985)Mol.Cell.Biol.53376;美國專利No.4,837,148和4,929,555],釀酒酵母[Hinnen等人,(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751929;Ito等人,(1983)J.Bacteriol.153163],栗酒裂植酵母[Beach和Nurse(1981)Nature 300706],以及Yarrowia lipolytica[Davidow,等人,(1985)Curr.Genet.10380471 Gaillardin,等人,(1985)Curr.Genet.1049]。
將外源DNA導(dǎo)入酵母宿主的方法是本領(lǐng)域熟知的,通常包括用堿陽離子處理轉(zhuǎn)化原生質(zhì)球或完整酵母細(xì)胞。轉(zhuǎn)化程序通常因待轉(zhuǎn)化的酵母種類而不同。例如參見,[Kurtz等人,(1986)Mol.Cell.Biol.6142;Kunze等人,(1985)J.Basic Microbiol.25141;念珠菌];[Gleeson等人,(1986)J.Gen.Microbiol.1323459;Roggenkamp等人,(1986)Mol.Gen.Genet.202302;漢遜酵母];[Das等人,(1984)J.Bacteriol.1581165;De Louvencourt等人,(1983)J.Bacteriol.1541165;Van den Berg等人,(1990)Bio/Technology 8135;克魯維酵母];[Cregg等人,(1985)Mol.Cell.Biol.53376;Kunze等人,(1985)J.Basic Microbiol.25141;美國專利No.4,837,148和4,929,555;畢赤酵母];[Hinnen等人,(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75;1929;Ito等人,(1983)J.Bacteriol.153163釀酒酵母];[Beach和Nurse(1981)Nature 300706;裂殖酵母];[Davidow等人,(1985)Curr.Genet.1039;Gaillardin等人,(1985)Curr.Genet.1049;Yarrowia]。
抗體本文所用的術(shù)語“抗體”指由至少一個抗體結(jié)合位點組成的一個或一組多肽。“抗體結(jié)合位點”是一個三維結(jié)合空間,其內(nèi)表面形狀和電荷分布與抗原表位的特征互補(bǔ),從而使抗體與抗原結(jié)合。“抗體”例如包括,脊椎動物抗體、雜合抗體、嵌合抗體、人源化抗體、經(jīng)修飾的抗體、單價抗體、Fab蛋白以及單結(jié)構(gòu)域抗體。
針對本發(fā)明蛋白的抗體可用于親和層析、免疫試驗以及區(qū)別/鑒定奈瑟球菌蛋白。
針對本發(fā)明蛋白的多克隆和單克隆抗體可用常規(guī)方法制得。通常,首先用蛋白來免疫合適的動物,較佳的是小鼠、大鼠、家兔或山羊。由于可獲得的血清體積多,能獲得標(biāo)記的抗家兔和抗山羊抗體,因此對于制備多克隆抗血清來說,家兔和山羊是較佳的。免疫通常這樣進(jìn)行將蛋白以鹽水(較佳的以佐劑如弗氏完全佐劑)混合或乳化,然后腸胃外(通常是皮下或肌內(nèi))注射該混合物或乳劑。每次注射50-200微克的劑量就足夠了。2-6周后用鹽水(較佳的是用弗氏不完全佐劑)配的蛋白質(zhì)注射一次或多次以強(qiáng)化免疫。另外可以用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行體外免疫來產(chǎn)生抗體,從本發(fā)明的目的來看,認(rèn)為其與體內(nèi)免疫等效。將免疫后的動物血液抽取到玻璃或塑料容器中,25℃培育該血液1小時,然后4℃培育2-18小時,獲得多克隆抗血清。離心(例如1000g 10分鐘)回收血清。家兔每次取血可獲得約20-50毫升。
用Kohler和Milstein的標(biāo)準(zhǔn)方法[Nature(1975)256495-96]或其改進(jìn)方法制得單克隆抗體。通常,如上所述對小鼠或大鼠免疫。然而,并非是對動物取血然后抽提血清,而是取出脾臟(以及任選地取出幾個大的淋巴結(jié)),將其分散成單細(xì)胞。如果需要,可將細(xì)胞懸液(在除去非特異性粘附的細(xì)胞后)加入包被了蛋白質(zhì)抗原的板或孔中,對脾細(xì)胞進(jìn)行篩選。表達(dá)抗原特異性的膜結(jié)合免疫球蛋白的B細(xì)胞結(jié)合到板上,不象懸液其它物質(zhì)那樣被洗去。然后對所得B細(xì)胞或所有解離的脾細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),使其與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤,培養(yǎng)在選擇性培養(yǎng)基(如次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷培養(yǎng)基,“HAT”)中。通過有限稀釋接種所得雜交瘤,并測定特異性結(jié)合免疫抗原(且不結(jié)合無關(guān)抗原)的抗體的產(chǎn)生。然后,體外(例如在組織培養(yǎng)瓶或中空纖維反應(yīng)器中)或體內(nèi)(如小鼠腹水中)培養(yǎng)所選的分泌單克隆抗體的雜交瘤。
如果需要,抗體(無論是多克隆還是單克隆抗體)可用常規(guī)技術(shù)來標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、放射活性原子(尤其是32P和125I)、密電子試劑、酶、以及具有特異性結(jié)合配偶的配體。酶通常靠其活性來檢測。例如,辣根過氧化物酶通常是檢測其將3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)變成藍(lán)色的能力,可用分光光度計定量測定?!疤禺愋越Y(jié)合配偶”指能以高特異性結(jié)合配體分子的蛋白質(zhì),例如抗原以及對其有特異性的單克隆抗體。其它特異性結(jié)合配偶包括生物素和親和素或鏈親和素,IgG和蛋白A,以及本領(lǐng)域已知的許多受體-配體對。應(yīng)理解,上述內(nèi)容并非要將各種標(biāo)記分成不同的類,因為同一標(biāo)記可在幾種不同的模型中起作用。例如,125I可作為放射活性標(biāo)記,或作為密電子試劑。HRP可作為酶或單抗的抗原。另外,一種物質(zhì)可以和各種標(biāo)記組合以獲得所需的效果。例如,在實施本發(fā)明中,單抗和親和素也需要標(biāo)記,因此,可以用生物素標(biāo)記單抗,并用標(biāo)記了125I的親和素檢測其存在,或用標(biāo)記HRP的抗生物素單抗檢測其存在。其它替換和可能性對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的,所以應(yīng)認(rèn)作屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的等價物。
藥物組合物藥物組合物可包含本發(fā)明的多肽、抗體或核酸。該藥物組合物將包含治療有效量的本發(fā)明的多肽、抗體或多核苷酸。
本文所用的術(shù)語“治療有效量”指治療劑治療、緩解或預(yù)防目標(biāo)疾病或狀況的量,或是表現(xiàn)出可檢測的治療或預(yù)防效果的量。該效果例如可通過化學(xué)標(biāo)記或抗原水平來檢測。治療效果也包括生理性癥狀的減輕,例如導(dǎo)致體溫降低。對于某一對象的精確有效量取決于該對象的體型和健康狀況、病癥的性質(zhì)和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此,預(yù)先指定準(zhǔn)確的有效量是沒用的。然而,對于某給定的癥狀而言,可以用常規(guī)實驗來確定該有效量,臨床醫(yī)師是能夠判斷出來的。
為了本發(fā)明的目的,有效的劑量為給予個體約0.01毫克/千克至50毫克/千克或0.05毫克/千克至10毫克/千克的DNA構(gòu)建物。
藥物組合物還可含有藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑(例如抗體、多肽、基因或其它治療劑)給藥的載體。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體,且給藥后沒有過分的毒性。合適的載體可能是大的、代謝緩慢的大分子,如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物以及無活性的病毒顆粒。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。
本文可用的藥學(xué)上可接受的鹽例如有無機(jī)酸鹽,如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等;以及有機(jī)酸鹽,如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。
治療性組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體,如水、鹽水、甘油和乙醇。另外,這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì),如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。通常,可將治療性組合物制成可注射劑,例如液體溶液或懸浮液;還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。脂質(zhì)體也包括在藥學(xué)上可接受的載體的定義中。
給藥方法一旦配成本發(fā)明的組合物,可將其直接給予對象。待治療的對象可以是動物;尤其可以治療人對象。
直接輸送該組合物通??赏ㄟ^皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸送至組織間隙來實現(xiàn)。組合物也可輸送至病灶區(qū)。其它給藥方式包括口服和肺給藥、栓劑和透皮或經(jīng)皮膚施用(參見例如WO98/20734)、用針、基因槍或手持無針注射器(hypospray)。治療劑量方案可以是單劑方案或多劑方案。
疫苗疫苗包含免疫性抗原、免疫原、多肽、蛋白或核酸,通常與“藥學(xué)上可接受的載體”組合,這些載體包括本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子,如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂質(zhì)凝集物(如油滴或脂質(zhì)體)以及無活性的病毒顆粒。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。另外,這些載體可起免疫刺激劑(“佐劑”)作用。另外,抗原或免疫原可以和細(xì)菌類毒素(如白喉、破傷風(fēng)、霍亂、幽門螺桿菌等病原體的類毒素)偶聯(lián)。
增強(qiáng)組合物效果的較佳的佐劑包括但不局限于(1)鋁鹽(alum),如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等;(2)水包油型乳劑配方(有或沒有其它特異性的免疫刺激劑,如胞壁酰肽(見下文)或細(xì)菌細(xì)胞壁成分),例如,(a)MF59TM(WO 90/14837;第10章“疫苗設(shè)計亞基和佐劑方法”,Powell和Newman編,Plenum Press,1995),其含有5%鯊烯、0.5%吐溫 80和0.5%Span 85(任選地含有不同量的MTP-PE(見下文),雖然并不需要),用微量流化器(如110Y型微量流化器(Microfluidics,Newton,MA))制成亞微米級顆粒;(b)SAF,其含有10%鯊烯、0.4%吐溫80、5%普盧蘭尼克(pluronic)嵌段聚合物L(fēng)121以及thr-MDP(見下文),微量流化成亞微米級乳劑或渦流振蕩產(chǎn)生粒徑較大的乳劑,和(c)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)(Ribi Immunoehem,Hamilton,MT),其含有2%鯊烯、0.2%吐溫80以及選自單磷酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)、和細(xì)胞壁骨架(CWS)的一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁組分,較佳的是MPL+CWS(DetoxTM);(3)皂素佐劑,例如可采用StimulonTM(Cambridge Bioscience,Worcester,MA)或從其產(chǎn)生的顆粒,如ISCOM(免疫刺激性復(fù)合物);(4)弗氏完全佐劑(CFA)和弗氏不完全佐劑(IFA);(5)細(xì)胞因子,如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干擾素(如γ干擾素)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CFS)、腫瘤壞死因子(TNF)等;以及(6)作為免疫刺激劑來增強(qiáng)組合物效果的其它物質(zhì)。Alum和MF59TM是較佳的。
如上所述,胞壁酰肽包括但不局限于,N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲基胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰氨?;?L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)等。
免疫原性組合物(如用于免疫的抗原/免疫原/多肽/蛋白/核酸,藥學(xué)上可接受的載體以及佐劑),通常含有稀釋劑,如水,鹽水,甘油,乙醇等。另外,輔助性物質(zhì),如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等可存在于這類運(yùn)載體中。
通常,可將免疫原性組合物制成可注射劑,例如液體溶液或懸液;還可制成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的固體形式。該制劑還可乳化或包封在脂質(zhì)體中,在上述藥學(xué)上可接受的載體下增強(qiáng)佐劑效果。
用作疫苗的免疫原性組合物,包含免疫學(xué)有效量的抗原性或免疫原性多肽以及上述其它所需的組分?!懊庖邔W(xué)有效量”指以單劑或連續(xù)劑一部分給予個體的量對治療或預(yù)防是有效的。該用量根據(jù)所治療個體的健康狀況和生理狀況、所治療個體的類別(如非人靈長類、靈長類等)、個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗的配制、治療醫(yī)師對醫(yī)療狀況的評估、及其它的相關(guān)因素而定。預(yù)計該用量將在相對較寬的范圍內(nèi),可通過常規(guī)實驗來確定。
常規(guī)方法是從腸胃外途徑通過注射給予免疫原性組合物,例如皮下、肌內(nèi)或透皮給藥(例如WO98/20734)。適合其它給藥方式的其它配方包括口服和肺制劑、栓劑和透皮施藥。治療劑量可以是單劑方案或多劑方案。疫苗可以結(jié)合其它免疫調(diào)節(jié)劑一起給予。
作為以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的疫苗的一種替代方案是,可以采用DNA疫苗接種[例如,Robinson和Torres(1997)Seminars in Immunology 9271-283;Donnelly等人(1997)Annu Rev.Immunol 15617-648;見下文]。
多核苷酸和多肽藥物組合物除了上述的藥學(xué)上可接受的載體和鹽外,多核苷酸和多肽組合物中還可采用下列附加試劑。
A.多肽一個例子是多肽,其包括但不局限于脫唾液酸血清類粘蛋白(ASOR);運(yùn)鐵蛋白;脫唾液酸糖蛋白;抗體;抗體片段;鐵蛋白;自介素;干擾素;粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF);粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、干細(xì)胞因子和促紅細(xì)胞生成素。還可使用病毒抗原,如包膜蛋白。另外,可用來自其它侵襲性生物的蛋白,例如瘧原蟲惡性瘧疾的環(huán)孢子蛋白的17個氨基酸的肽(稱為RII)。
B.激素,維生素等其它可包括的種類例如是激素、類固醇、雄激素、雌激素、甲狀腺激素或維生素、葉酸。
C.聚亞烷基、多糖等另外,聚(亞烷基)二醇可以和所需的多核苷酸或多肽組合在一起。在一個較佳的實施方案中,聚(亞烷基)二醇是聚乙二醇。另外,可以加入單糖、二糖或多糖。在此方面的一個較佳實施方案中,多糖是葡聚糖或DEAE-葡聚糖。另外有脫乙酰殼多糖和聚交酯-聚乙醇酸內(nèi)酯共聚物。
D.脂質(zhì)和脂質(zhì)體所需的多核苷酸或多肽還可在輸送給對象或?qū)ο笱苌募?xì)胞之前包裹在脂質(zhì)中或包裹在脂質(zhì)體中。
脂質(zhì)包裹通常用能穩(wěn)定結(jié)合或捕獲并保留核酸的脂質(zhì)體來實現(xiàn)。濃縮的多核苷酸與脂質(zhì)制劑之比可以不同,但是通常在約1∶1(毫克DNA∶微摩爾脂質(zhì))之間,或脂質(zhì)更多。關(guān)于脂質(zhì)體作為輸送核酸的載體的綜述參見Hug和Sleight(1991)Biochim.Biophys.Acta.10971-17;Straubinger(1983)Meth.Enzymol.101512-527。
用于本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑包括陽離子(帶正電荷)、陰離子(帶負(fù)電荷)和中性制劑。陽離子脂質(zhì)體已經(jīng)顯示出能以有功能的形式介導(dǎo)質(zhì)粒DNA的胞內(nèi)輸送(Felgner(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413-7416);mRNA(Malone(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866077-6081);和純化的轉(zhuǎn)錄因子的胞內(nèi)輸送(Debs(1990)J.Biol.Chem.26510189-10192)。
陽離子脂質(zhì)體很容易購得。例如,N[1-2,3-二油烯基氧)丙基]-N,N,N-三乙銨(DOTMA)脂質(zhì)體可以以Lipofectin的商標(biāo)從GIBCO BRL,Grand Island,NY購得。(另見Felgner,同上)。其它商品脂質(zhì)體包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。其它陽離子脂質(zhì)體可用本領(lǐng)域熟知的方法從易購得的材料制得。例如參見,Szoka(1978)PNAS USA 754194-4198;WO90/11092關(guān)于DOTAP(1,2-二(油酰基氧)-3-(三甲基銨溶)丙烷)脂質(zhì)體合成的描述。
同樣,陰離子和中性脂質(zhì)體也是容易獲得的,例如購自Avanti PolarLipids(birmingham,AL),或容易用易購得的材料制得。這種材料包括磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰乙醇胺、二油?;字D憠A(DOPC)、二油?;字8视?DOPG)、二油?;字R掖及?DOPE)。這些材料還能以合適比例與DOTMA和DOTAP原料混合。用這些材料制備脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域熟知的。
脂質(zhì)體可包含多層脂質(zhì)體(MLV),小的單層脂質(zhì)體(SUV)、或大的單層脂質(zhì)體(LUV)。各種脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物可用本領(lǐng)域已知的方法制得。例如參見Straubinger(1983)Meth.Immunol.101512-527;Szoka(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 754194-4198;Papahadjopoulos(1975)Biochim.Biophys.Acta 394483;Wilson(1979)Cell 1777);Deamer和Bangham(1976)Biochim.Biophys.Acta443629;Ostro(1977)Biochem.Biophys.Res.Commun.76836;Fraley(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 763348);Enoch和Strittmatter(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76145;Fraley(1980)J.Biol.Chem.(1980)25510431;Szoka和Papahadjopoulos(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75145;以及Schaefer-Ridder(1982)Science 215166。
E.脂蛋白另外,脂蛋白也可加入待輸送的多核苷酸或多肽中。采用的脂蛋白的例子包括乳糜微粒、HDL、IDL、LDL和VLDL。還可采用這些蛋白的突變體、片段或融合蛋白。另外,可采用天然存在的脂蛋白的修飾物,例如乙酰化的LDL。這些脂蛋白能使多核苷酸的輸送指向表達(dá)脂蛋白受體的細(xì)胞。較佳的,如果待輸送的多核苷酸中加入了脂蛋白,則組合物中不加入其它尋靶的配體。
天然存在的脂蛋白包含脂質(zhì)和蛋白部分。蛋白部分稱為脫輔基蛋白。目前,已經(jīng)分離并鑒定出了脫輔基蛋白A、B、C、D和E。其中至少有兩個含有幾種蛋白,用羅馬數(shù)字AI、AII、AIV;CI、CII、CIII命名。
脂蛋白可包含多個脫輔基蛋白。例如,天然存在的乳糜微粒包含A、B、C和E,隨著時間的推移,這些脂蛋白失去A,得到C和E脫輔基蛋白。VLDL包含A、B、C、和E脫輔基蛋白,LDL包含脫輔基蛋白B;HDL包含脫輔基蛋白A、C和E。
這些脫輔基蛋白的氨基酸是已知的,并且在下列文獻(xiàn)中有所描述Breslow(1985)Annu Rev.Biochem 54699;Law(1986)Adv.Exp Med.Biol.151162;Chen(1986)J Biol Chem 26112918;Kane(1980)Proc Natl Acad Sci USA772465;and Utermann(1984)Hum Genet 65232。
脂蛋白含有各種脂質(zhì),包括甘油三酯、膽固醇(游離的和酯型)以及磷脂。天然存在的脂蛋白中脂質(zhì)的組成是不同的。例如,乳糜微粒主要含甘油三酯。關(guān)于天然存在的脂蛋白的脂質(zhì)含量更詳細(xì)的描述可在例如Meth.Enzymol.128(1986)中找到。選擇脂質(zhì)的組成,以使脫輔基蛋白的構(gòu)型有利于受體結(jié)合活性。還可選擇脂質(zhì)的組成,以促進(jìn)與多核苷酸結(jié)合分子中的疏水性相互作用和結(jié)合。
天然存在的脂蛋白可以用諸如超離心方法從血清中分離出來。這些方法在Meth.Enzymol.(同上);Pitas(1980)J.BioChem.2555454-5460以及Mahey(1979)J Clin.Invest 64743-750中有所描述。脂蛋白還可在體外產(chǎn)生,或通過在所需宿主細(xì)胞中表達(dá)脫輔基蛋白基因的重組方法產(chǎn)生。例如參見Atkinson(1986)Annu Rev Biophys Chem 15403和Radding(1958)Biochim Biophys Acta 30443。脂蛋白也可購自商業(yè)供應(yīng)商,如Biomedical Techniologies,Inc.,Stoughton,Massachusetts,USA。關(guān)于脂蛋白的進(jìn)一步描述可在Zuckermann等人的WO98/06437中找到。
F.聚陽離子試劑聚陽離子試劑可以與或不與脂蛋白一起包括在含所需待輸送多核苷酸/多肽的組合物中。
聚陽離子試劑通常在生理性相關(guān)的pH下表現(xiàn)出凈的正電荷,并能中和核酸的電荷,而有助于輸送至所需位置。這些試劑具有體外、活體外和體內(nèi)的用途。聚陽離子試劑可用來將核酸通過肌內(nèi)或皮下等輸送至活的對象。
下面是用作聚陽離子試劑的多肽例子聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸和魚精蛋白。其它例子包括組蛋白、魚精蛋白、人血清白蛋白、DNA結(jié)合蛋白、非組蛋白染色體蛋白、DNA病毒的外殼蛋白,如(X174,轉(zhuǎn)錄因子還含有結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)域,因此可用作核酸凝聚劑。簡言之,轉(zhuǎn)錄因子如C/CEBP、c-jun、c-fos、AP-1、AP-2、AP-3、CPF、Prot-1、Sp-1、Oct-1、Oct-2、CREP、和TFIID含有結(jié)合DNA序列的基本結(jié)構(gòu)域。
聚陽離子有機(jī)試劑包括精胺、亞精胺和腐胺。
從上面的清單可以推出聚陽離子試劑的尺寸和物理性能,以構(gòu)建其它多肽聚陽離子試劑或產(chǎn)生合成的聚陽離子試劑。
有用的合成聚陽離子試劑例如包括,DEAE-葡聚糖、Polybrene。LipofectinTM和lipofectAMINETM是與多核苷酸/多肽組合時形成聚陽離子復(fù)合物的單體。
核酸雜交“雜交”指兩個核酸序列相互之間通過氫鍵而結(jié)合。通常,一個序列固定于固體載體,另一個將游離于溶液內(nèi)。然后,在有利于形成氫鍵的條件下使兩個序列相互接觸。影響這種結(jié)合的因素包括溶劑的類型和體積;反應(yīng)溫度;雜交時間;攪拌;封閉液相序列與固體載體非特異性結(jié)合的試劑(Denhardt′s試劑或BLOTTO);各序列的濃度;是否使用化合物來增加序列結(jié)合的速度(硫酸葡聚糖或聚乙二醇);以及雜交后洗滌條件的嚴(yán)謹(jǐn)程度。見Sambrook等人[同上]第2卷,第9章,9.47至9.57頁。
“嚴(yán)謹(jǐn)性”指有利于非常相似的序列結(jié)合而不利于不同序列結(jié)合的雜交反應(yīng)條件。例如,應(yīng)選擇溫度和鹽濃度的組合,使溫度比所研究的雜交的Tm計算值低大約120至200℃。溫度和鹽濃度??赏ㄟ^初步實驗中憑經(jīng)驗來確定,在初步實驗中,固定在濾膜上的基因組DNA樣品與感興趣的序列雜交,然后在不同的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下洗滌。見Sambrook等人第9.50頁。
在進(jìn)行例如Southern印跡時,要考慮的參數(shù)是(1)待印跡的DNA的復(fù)雜性以及(2)探針與受檢測序列之間的同源性。對于高度復(fù)雜的真核基因組中的單拷貝基因,待研究片段的總量可以在10的一個數(shù)量級范圍內(nèi)變化,質(zhì)粒為0.1至1微克,或?qū)⑹删w消化至10-9至10-8克。對于復(fù)雜性較低的多核苷酸,可以采用實際上更短的印跡、雜交以及接觸時間,更少量的起始多核苷酸,以及比活更低的探針。例如,從1微克酵母DNA開始,用僅僅1小時的接觸時間,印跡2小時,然后和108cpm/μg的探針雜交4-8小時,就可以檢測單拷貝酵母基因。對于單拷貝哺乳動物基因而言,一種保守的方法是從10微克DNA開始,印跡過夜,在10%硫酸葡聚糖存在下用108cpm/μg以上的探針雜交過夜,導(dǎo)致接觸時間約為24小時。
有幾個因素可能會影響探針與感興趣片段之間的DNA-DNA雜交物的解鏈溫度(Tm),因而影響雜交和洗滌的合適條件。在許多情況下,探針并非與待測片段100%同源。其它常常遇到的變量包括雜交序列的長度和G+C總含量,以及雜交緩沖液的離子強(qiáng)度和甲酰胺含量。所有這些因素的作用可近似表示成一個方程式Tm=81+16.6(log10Ci)+0.4[%(G+C)]-0.6(%甲酰胺)-600/n-1.5(%錯配)其中Ci是鹽濃度(單價離子),n是雜交物堿基對的長度(對Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138267-284的方法稍作了修改)。
在設(shè)計雜交實驗時,影響核酸雜交的一些因素可以方便地予以改變。雜交和洗滌時的溫度以及洗滌時的鹽濃度的調(diào)節(jié)最為簡單。隨著雜交溫度(即嚴(yán)謹(jǐn)度)的升高,不同源的鏈之間發(fā)生雜交的可能性變得更少,結(jié)果背景值降低。如果放射性標(biāo)記的探針并非與固定的片段完全同源(這在基因家族和種間雜交實驗中是常見的),則必須降低雜交溫度,而背景值將會增加。洗滌溫度以類似的方式影響雜交帶的強(qiáng)度和背景值的程度。洗滌的嚴(yán)謹(jǐn)性也隨鹽濃度的降低而升高。
通常,在50%甲酰胺存在下的方便的雜交溫度是對于靶片段同源性達(dá)95%至100%的探針而言,是42℃;對于同源性為90%至95%的探針,為37℃;對于同源性為85%和90%的探針,為32℃。對于較低的同源性,應(yīng)用上述方程式應(yīng)相應(yīng)地降低甲酰胺含量和調(diào)節(jié)溫度。如果探針和靶片段之間的同源性是未知的,則最簡單的方法是從非嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交和洗滌條件開始。如果在放射自顯影后發(fā)現(xiàn)了非特異性的條帶或高背景值,則可在高嚴(yán)謹(jǐn)性下洗滌濾膜,并重新曝光。如果曝光所需時間使得該方法不切實際,則應(yīng)平行測試幾種雜交和/或洗滌嚴(yán)謹(jǐn)性。
本發(fā)明實施方式腦膜炎球菌80-85kDa蛋白質(zhì)的鑒定已發(fā)現(xiàn)從腦膜炎奈瑟球菌血清群B制備的多種外膜小泡制劑含有約80-85kDa的成分。用SDS-PAGE凝膠純化該蛋白質(zhì)并進(jìn)行N-端測序(SEQ ID 1)。
制備的抗SDS-PAGE純化蛋白的抗體與50種以上的不同血清群和血清型的腦膜炎奈瑟球菌菌株中的當(dāng)量蛋白質(zhì)相互反應(yīng)。還觀察到與淋病奈瑟球菌、多糖奈瑟球菌(N.polysaccharia)和乳糖奈瑟球菌(N.lactamica)的交叉反應(yīng)。接受過疫苗的患者的血清也與該蛋白質(zhì)反應(yīng)。
從血清群B腦膜炎奈瑟球菌克隆了完整的基因(SEQ ID 2),并推斷其編碼的蛋白質(zhì)(SEQ ID 3)。通過與上述N-端測序相比較,推斷出信號肽(SEQ ID 4)和成熟序列(SEQ ID 5)。
腦膜炎奈瑟球菌血清群A和淋病奈瑟球菌中相應(yīng)基因的鑒定在血清群B腦膜炎奈瑟球菌序列的基礎(chǔ)上,克隆和測序了腦膜炎奈瑟球菌血清群A和淋病奈瑟球菌的相應(yīng)序列(稱為‘ORF21’)。
SEQ ID 6列出了血清群A腦膜炎奈瑟球菌的完整基因,SEQ ID 7列出了其所編碼的蛋白質(zhì)。SEQ ID 8和9是信號肽和成熟序列。
SEQ ID 10列出了淋病奈瑟球菌的完整序列,SEQ ID 11列出了其編碼的蛋白質(zhì)。SEQ ID 12和13為信號肽和成熟序列。
序列的比較將這些蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)它們是高度同源的。
腦膜炎奈瑟球菌血清群B序列和淋病奈瑟球菌序列顯示在797aa重疊的片段中有95.4%相同。
102030405060orf21.pep MKLKQIASALMMLGISPLALADFTIQDIRVEGLQRTEPSTVFNYLPVKVGDTYNDTHGSA|||||||||||||||||||:||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep MKLKQIASALMMLGISPLAFADFTIQDIRVEGLQRTEPSTVFNYLPVKVGDTYNDTHGSA102030405060708090 100 110 120orf21.pep IIKSLYATGFFDDVRVETADGQLLLTVIERPTIGSLNITGAKMLQNDAIKKNLESFGLAQ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep IIKSLYATGFFDDVRVETADGQLLLTVIERPTIGSLNITGAKMLQNDAIKKNLESFGLAQ708090 100 110 120
130 140 150 160 170 180orf21.pep SQYFNQATLNQAVAGLKEEYLGRGKLNIQITPKVTKLARNRVDIDITIDEGKSAKITDIE||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep SQYFNQATLNQAVAGLKEEYLGRGKLNIQITPKVTKLARNRVDIDITIDEGKSAKITDIE130 140 150 160 170 180190 200 210 220 230 240orf21.pep FEGNQVYSDRKLMRQMSLTEGGIWTWLTRSNQFNEQKFAQDMEKVTDFYQNNGYFDFRIL||||||||||||||||||||||||||||||::|::|||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep FEGNQVYSDRKLMRQMSLTEGGIWTWLTRSDRFDRQKFAQDMEKVTDFYQNNGYFDFRIL190 200 210 220 230 240250 260 270 280 290 300orf21.pep DTDIQTNEDKTKQTIKITVHEGGRFRWGKVSIEGDTNEVPKAELEKLLTMKPGKWYERQQ|||||||||||:||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep DTDIQTNEDKTRQTIKITVHEGGRFRWGKVSIEGDTNEVPKAELEKLLTMKPGKWYERQQ250 260 270 280 290 300310 320 330 340 350 360orf21.pep MTAVLGEIQNRMGSAGYAYSEISVQPLPNAETKTVDFVLHIEPGRKIYVNEIHITGNNKT||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep MTAVLGEIQNRMGSAGYAYSEISVQPLPNAGTKTVDFVLHIEPGRKIYVNEIHITGNNKT310 320 330 340 350 360370 380 390 400 410 420orf21.pep RDEVVRRELRQHESAPYDTSKLQRSKERVELLGYFDNVQFDAVPLAGTPDKVDLNMSLTE||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep RDEVVRRELRQMESAPYDTSKLQRSKERVELLGYFDNVQFDAVPLAGTPDKVDLNMSLTE370 380 390 400 410 420430 440 450 460 470 480orf21.pep RSTGSLDLSAGWVQDTGLVMSAGVSQDNLFGTGKSAALRASRSKTTLNGSLSFTDPYFTA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep RSTGSLDLSAGWVQDTGLVMSAGVSQDNLFGTGKSAALRASRSKTTLNGSLSFTDPYFTA430 440 450 460 470 480490 500 510 520 530 540orf21.pep DGVSLGYDVYGKAFDPRKASTSIKQYKTTTAGAGIRMSVPVTEYDRVNFGLVAEHLTVNT||||||||:|||||||||||||:|||||||||:|:||::||||||||||||:||||||||orf21ng.pep DGVSLGYDIYGKAFDPRKASTSVKQYKTTTAGGGVRMGIPVTEYDRVNFGLAAEHLTVNT490 500 510 520 530 540550 560 570 580 590 600orf21.pep YNKAPKHYADFIKKYGKTDGTDGSFKGWLYKGTVGWGRNKTDSALWPTRGYLTGVNAEIA||||||:|||||:|||||||:|||||| |||||||||||||||| |||||||||||||||orf21ng.pep YNKAPKRYADFIRKYGKTDGADGSFKGLLYKGTVGWGRNKTDSASWPTRGYLTGVNAEIA550 560 570 580 590 600610 620 630 640 650 660orf21.pep LPGSKLQYYSATHNQTWFFPLSKTFTLKMGGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGGLGSVR||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep LPGSKLQYYSATHNQTWFFPLSKTFTLMLGGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGGLGSVR610 620 630 640 650 660670 680 690 700 710 720orf21.pep GYESGTLGPKVYDEYGEKISYGGNKKANVSAELLFPMPGAKDARTVRLSLFADAGSVWDG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep GYESGTLGPKVYDEYGEKISYGGNKKANVSAELLFPMPGAKDARTVRLSLFADAGSVWDG670 680 690 700 710 720730 740 750 760 770 780orf21.pep KTYDDNSSSATGGRVQNIYGAGNTHKSTFTNELRYSAGGAVTWLSPLGPMKFSYAYPLKK:||::| :| :::|: |:||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep RTY----TAAENGNNKSVYSE-NAHKSTFTNELRYSAGGAVTWLSPLGPMKFSYAYPLKK730740 750 760 770790orf21.pep KPEDEIQRFQFQLGTTF|||||||||||||||||orf21ng.pep KPEDEIQRFQFQLGTTFX780 790
腦膜炎奈瑟球菌血清群A和B序列顯示在797aa重疊的片段中有99.9%相同。
102030405060orf21.pepMKLKQIASALMMLGISPLALADFTIQDIRVEGLQRTEPSTVFNYLPVKVGDTYNDTHGSA|||||||||||:||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep MKLKQIASALMVLGISPLALADFTIQDIRVEGLQRTEPSTVFNYLPVKVGDTYNDTHGSA102030405060708090 100 110 120orf21.pepIIKSLYATGFFDDVRVETADGQLLLTVIERPTIGSLNITGAKMLQNDAIKKNLESFGLAQ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep IIKSLYATGFFDDVRVETADGQLLLTVIERPTIGSLNITGAKMLQNDAIKKNLESFGLAQ708090 100 110 120130 140 150 160 170 180orf21.pepSQYFNQATLNQAVAGLKEEYLGRGKLNIQITPKVTKLARNRVDIDITIDEGKSAKITDIE||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep SQYFNQATLNQAVAGLKEEYLGRGKLNIQITPKVTKLARNRVDIDITIDEGKSAKITDIE130 140 150 160 170 180190 200 210 220 230 240orf21.pepFEGNQVYSDRKLMRQMSLTEGGIWTWLTRSNQFNEQKFAQDMEKVTDFYQNNGYFDFRIL||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep FEGNQVYSDRKLMRQMSLTEGGIWTWLTRSNQFNEQKFAQDMEKVTDFYQNNGYFDFRIL190 200 210 220 230 240250 260 270 280 290 300orf21.pepDTDIQTNEDKTKQTIKITVHEGGRFRWGKVSIFGDTNEVPKAELEKLLTMKPGKWYERQQ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep DTDIQTNEDKTKQTIKITVHFGGRFRWGKVSIFGDTNEVPKAFLFKLLTMKPGKWYERQQ250 260 270 280 290 300310 320 330 340 350 360orf21.pepMTAVLGEIQNRMGSAGYAYSEISVQPLPNAETKTVDFVLHIEPGRKIYVNEIHITGNNKT||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep MTAVLGEIQNRMGSAGYAYSEISVQPLPNAETKTVDFVLHIEPGRKIYVNEIHITGNNKT310 320 330 340 350 360370 380 390 400 410 420orf21.pepRDEVVRRELRQMESAPYDTSKLQRSKERVELLGYFDNVQFDAVPLAGTPDKVDLNMSLTE||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep RDEVVRRELRQMESAPYDTSKLQRSKERVELLGYFDNVQFDAVPLAGTPDKVDLNMSLTE370 380 390 400 410 420430 440 450 460 470 480orf21.pepRSTGSLDLSAGWVQDTGLVMSAGVSQDNLFGTGKSAALRASRSKTTLNGSLSFTDPYFTA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf2 1a.pep RSTGSLDLSAGWVQDTGLVMSAGVSQDNLFGTGKSAALRASRSKTTLNGSLSFTDPYFTA430 440 450 460 470 480490 500 510 520 530 540orf21.pepDGVSLGYDVYGKAFDPRKASTTSIKQYKTTAGAGIRMSVPVTEYDRVNFGLVAEHLTVNT||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep DGVSLGYDVYGKAFDPRKASTSIKQYKTTTAGAGIRMSVPVTEYDRVNFGLVAEHLTVNT490 500 510 520 530 540550 560 570 580 590 600orf21.pepYNKAPKHYADFIKKYGKTDGTDGSFKGWLYKGTVGWGRNKTDSALWPTRGYLTGVNAEIA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep YNKAPKHYADFIKKYGKTDGTDGSFKGWLYKGTVGWGRNKTDSALWPTRGYLTGVNAEIA550 560 570 580 590 600610 620 630 640 650 660
orf21.pepLPGSKLQYYSATHNQTWFFPLSKTFTLMLGGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGGLGSVR||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep LPGSKLQYYSATHNQTWFFPLSKTFTLMLGGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGGLGSVR610 620 630 640 650 660670 680 690 700 710 720orf21.pepGYESGTLGPKEYGEYGEKISYGGNKKANVSAELLFPMPGAKDARTVRLSLFADAGSVWDG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep GYESGTLGPKVYDEYGEKISYGGNKKANVSAELLFPMPGAKDARTVRLSLFADAGSVWDG670 680 690 700 710 720730 740 750 760 770 780orf21.pepKTYDDNSSSATGGRVQNIYGAGNTHKSTFTNELRYSAGGAVTWLSPLGPMKFSYAYPLKK||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep KTYDDNSSSATGGRVQNIYGAGNTHKSTFTNELRYSAGGAVTWLSPLGPMKFSYAYPLKK730 740 750 760 770 780790orf21.pepKPEDEIQRFQFQLGTTF|||||||||||||||||orf21a.pep KPEDEIQRFQFQLGTTFX790高度保守表明單種蛋白質(zhì)可能引發(fā)針對多種奈瑟球菌屬物種的免疫應(yīng)答。
克隆、表達(dá)和純化腦膜炎奈瑟球菌菌株2996和MC58在100GC培養(yǎng)基中生長至指數(shù)期,離心收獲,并懸浮于5ml緩沖液中(20%w/v蔗糖、50mM Tris-HCl、50mM EDTA,pH8)。在冰上培育10分鐘后,添加10ml裂解溶液(50mM NaCl、1%Na-Sarkosyl、50μg/ml蛋白酶K)裂解這些細(xì)菌,懸浮液在37℃孵育2小時。進(jìn)行二次苯酚抽提(平衡到pH8.0),并進(jìn)行一次CHCl3/異戊醇(24∶1)提取。加入0.3M乙酸鈉和2體積乙醇以沉淀DNA,離心收集。用70%(v/v)乙醇沖洗沉淀物1次,將它們再溶解于4.0ml TE緩沖液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0)。通過讀取OD260測定DNA的濃度。
用如下寡核苷酸,通過PCR擴(kuò)增不含編碼前導(dǎo)肽序列的ORF21orf21正向引物<SEQ ID 105>(BamHI-NdeI)orf21反向引物<SEQ ID 106>(XhoI)5’引物包括2個限制位點(BamHI-NdeI),3’引物包括XhoI限制位點,以便將擴(kuò)增的產(chǎn)品(相應(yīng)于ORF21)直接克隆入兩個表達(dá)載體克隆pGEX-KG(用BamHI-XhoI),以獲得N-端GST-融合蛋白;和克隆入pET21b+(用NdeI-XhoI),以獲得C-端His-融合蛋白。
以下為標(biāo)準(zhǔn)PCR流程在40μM各寡核苷酸引物、400-800μM dNTP溶液、1x PCR緩沖液(包括1.5mM MgCl2)、2.5單位TaqI DNA聚合酶(用Perkin-ElmerAmpliTaq,Boerhingher Mannheim ExpandTMLong Template)存在時,用200ng2996或MC58菌株的基因組DNA或10ng從重組克隆得到的質(zhì)粒DNA制備物作為模板。
將全部混合物在95℃預(yù)先培育3分鐘后,將每份樣品進(jìn)行兩步的擴(kuò)增用排除引物限制酶拖尾的雜交溫度(Tm1)進(jìn)行前5輪。然后,根據(jù)全長寡核苷酸計算的雜交溫度(Tm2)進(jìn)行30輪。在68℃或72℃進(jìn)行的延伸的時間根據(jù)要擴(kuò)增的Orf的長度各不相同。對Orf1而言,延伸時間從3分鐘開始,每輪增加15秒。循環(huán)在72℃的10分鐘延伸步驟中完成。
擴(kuò)增的DNA直接加樣到1%瓊脂糖凝膠上。按制造商說明,用Qiagen GelExtraction Kit從凝膠純化相應(yīng)于正確大小條帶的DNA片段。
用合適的限制酶消化純化的相應(yīng)于擴(kuò)增的片段的DNA,從而將其克隆入pET-21b+或pET22b+。用QIAquick PCR純化試劑盒(按制造商說明書)純化消化的片段,并用H2O或10mM Tris(pH8.5)洗脫。用合適的限制酶消化質(zhì)粒載體,加樣到1.0%瓊脂糖凝膠上,并用Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit純化相應(yīng)于消化的載體的條帶。
將預(yù)先進(jìn)行過消化和純化的相應(yīng)于各基因的片段連接入pET21b+或pET22b+。將摩爾比為3∶1的片段/載體與T4 DNA連接酶在制造商提供的連接緩沖液中一起使用。
通過在冰上培育連接酶反應(yīng)溶液和細(xì)菌40分鐘,在37℃培育3分鐘,將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5或HB101。然后添加800μl LB肉湯,在37℃培育20分鐘。在Eppendorf離心機(jī)上以最高速度離心這些細(xì)胞,重懸浮于約200μl上清液中,將它們置于LB氨芐青霉素(100mg/ml)瓊脂上。
37℃將隨機(jī)選出的集落在4.0ml LB肉湯+100μg/ml氨芐青霉素上生長過夜,篩選重組克隆。沉淀細(xì)胞,并按制造商的說明書用Qiagen QIAprep SpinMiniprep Kit提取質(zhì)粒DNA。用合適的內(nèi)切酶消化約1μg各小量制備物,將消化物加樣到1-1.5%瓊脂糖凝膠上(根據(jù)所需插入片段的尺寸),與分子量標(biāo)記物相平行(1kb DNA Ladder,GIOBCO)。按插入片段的尺寸為依據(jù)選出陽性克隆。
將各基因克隆入表達(dá)載體后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入適合重組蛋白表達(dá)的大腸桿菌菌株中。用1μl各構(gòu)建物轉(zhuǎn)化上述大腸桿菌BL21-DE3。將單個重組集落接種到2ml LB+Amp(100μg/ml)中,在37℃培育過夜,然后以1∶30稀釋于100ml燒瓶內(nèi)的20ml LB+Amp(100μg/ml)中,使OD600為0.1到0.2之間。將該燒瓶在30℃或37℃的回轉(zhuǎn)式水浴振蕩器上培育,直到OD600顯示已生長到適合表達(dá)培育的指數(shù)生長期(0.4-0.8OD)。加入0.1mM IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。在30℃或37℃培育3小時后,測定OD600并檢驗表達(dá)。將1.0ml各份樣品在微型離心機(jī)上離心,將沉淀重懸浮于PBS中,用SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)染色分析。
GST融合蛋白被表達(dá),但發(fā)現(xiàn)它是不溶的(即不可純化)。His-融合蛋白被表達(dá)成不溶的蛋白質(zhì)。
對作為His融合蛋白純化的各克隆而言,劃線培育單集落,37℃將它們在LB/Amp(100μg/ml)的瓊脂板上培育過夜。將從該板上分離的集落在20mlLB/Amp(100μg/ml)液體培養(yǎng)基上培育,并在37℃振蕩生長過夜。將此過夜的培養(yǎng)物以1∶30稀釋于1.0升LB/Amp(100μg/ml)液體培養(yǎng)基中,將其在最佳溫度(30或37℃)生長,直到OD550達(dá)到0.6-0.8。加入IPTG(終濃度為1.0mM)引發(fā)重組蛋白的表達(dá),將此培養(yǎng)物再培育3小時。4℃以8000g離心15分鐘收獲細(xì)菌。將細(xì)菌沉淀重懸浮于7.5ml緩沖液B(8M尿素、10mM Tirs-HCl、100mM磷酸鹽緩沖液,pH8.8)中。用450型Branson超聲波儀以40W在冰上超聲處理四次(每次30秒)破壞細(xì)胞,在4℃以13000×g離心30分鐘。將沉淀重懸浮于2.0ml緩沖液C(6M鹽酸胍、100mM磷酸鹽緩沖液、10mM Tirs-HCl、pH7.5)中,并用Dounce勻漿器處理10次。將勻漿在13000g離心30分鐘,保留上清液。將上清液與150μl Ni2+-樹脂(預(yù)先用緩沖液B平衡過的)混合,在室溫平緩攪拌條件下培育30分鐘。該樹脂是Chelating Sepharose Fast Flow(Pharmacia),按制造商的說明書制備的。將分批的制備物在4℃以700×g離心5分鐘,棄去上清液。用10ml緩沖液B沖洗樹脂兩次(分批)10分鐘,重懸浮于1.0ml緩沖液B中,加樣到一次性柱上。在室溫下,繼續(xù)用緩沖液B沖洗樹脂,直到流出液的OD280達(dá)到0.02-0.01。用緩沖液D(8M尿素、10mM Tirs-HCl、100mM磷酸鹽緩沖液,pH6.3)進(jìn)一步?jīng)_洗樹脂,直到流出液的OD280達(dá)到0.02-0.01。加入700μl洗脫緩沖液B(8M尿素、10mM Tirs-HCl、100mM磷酸鹽緩沖液,pH4.5)洗脫His-融合蛋白,收集組分直到OD280顯示收集了所有的重組蛋白。用SDS-PAGE分析20μl每份的各洗脫組分。用Bradford分析評估蛋白質(zhì)濃度。
為了使蛋白質(zhì)復(fù)性,在上述得到的變性組分中加入甘油,使終濃度為10%v/v。用滲析緩沖液I(10%v/v甘油、0.5M精氨酸、50mM磷酸鹽緩沖液、5.0mM還原的谷胱甘肽、0.5mM氧化的谷胱甘肽、2.0M尿素,pH8.8)將蛋白質(zhì)稀釋至200μg/ml,并用相同的緩沖液在4℃透析12-14小時。然后用緩沖液II(10%v/v甘油、0.5M精氨酸、50mM磷酸鹽緩沖液、5.0mM還原的谷胱甘肽、0.5mM氧化的谷胱甘肽,pH8.8)在4℃透析12-14小時。用下式計算蛋白質(zhì)濃度
蛋白質(zhì)(mg/ml)=(1.55×OD280)-(0.76×OD260)為了對ORF21進(jìn)行免疫學(xué)定性,在第0、21和35天用抗原使Balb/C小鼠免疫,在第49天分析血清。
在如下的ELISA分析中ORF21得到了陽性結(jié)果將包囊化的MenB M7和包囊化的菌株接種于巧克力瓊脂平板上,在37℃、5%CO2培育過夜。用無菌dracon藥簽從該瓊脂板上收集細(xì)菌菌落,并將它們接種到含有0.25%葡萄糖的Mueller-Hinton肉湯(Difco)中。每30分鐘通過測定OD620監(jiān)測細(xì)菌的生長。讓細(xì)菌繼續(xù)生長直到OD值達(dá)到0.4-0.5。將培養(yǎng)物在4000rpm離心10分鐘。棄去上清液,用PBS沖洗這些細(xì)菌2次,重懸浮于含有0.025%甲醛的PBS中,在37℃培育1小時,然后在4℃攪拌培育過夜。在96孔Greiner板的各孔中加入100μl細(xì)菌細(xì)胞,在4℃培育過夜。然后用PBT沖洗緩沖液(0.1%Tween-20的PBS溶液)沖洗這些孔3次。將200μl飽和緩沖液(2.7%聚乙烯吡咯烷酮10的水溶液)加到各孔中,將這些板在37℃培育2小時。用PBT沖洗這些孔3次。在各孔中加入200μl稀釋的血清(稀釋緩沖液1%BSA、0.1%Tween-20、0.1%NaN3的PBS溶液),將這些平板在37℃培育2小時。用PBT沖洗這些孔3次。在各孔中加入100μl HRP-偶聯(lián)的兔抗小鼠(Dako)血清(用稀釋緩沖液作1∶2000稀釋),將這些平板在37℃培育90分鐘。用PBT緩沖液沖洗這些孔3次。在各孔中加入100μl HRP的底物緩沖液(25ml檸檬酸緩沖液pH5、10mg鄰-苯二胺(phenildiamine)和10μl H2O2),將這些平板置于室溫20分鐘。在各孔中加入100μl12.5%H2SO4,隨后測定OD490。隨意地計算ELISA滴定度,作為OD490值為0.4的、超過免疫前血清的水平的血清的稀釋度。當(dāng)OD490為0.4的血清的稀釋比大于1∶400時,將ELISA視為陽性。
為了評估ORF21在細(xì)胞內(nèi)的定位,使用如下FACS分析將包囊化的MenBM7菌株接種于巧克力瓊脂平板上,在37℃、5%CO2培育過夜。用無菌dracon藥簽從該瓊脂板上收集細(xì)菌菌落,并將它們接種到4支各裝有8ml包括0.25%葡萄糖的Mueller-Hinton肉湯(Difco)的試管中。每30分鐘通過測定OD620監(jiān)測細(xì)菌的生長。讓細(xì)菌繼續(xù)生長直到OD值達(dá)到0.35-0.5。將培養(yǎng)物在4000rpm離心10分鐘。棄去上清液,用封阻緩沖液(1%BSA的PBS溶液、0.4%NaN3)重懸浮沉淀,在4000rpm離心5分鐘。將細(xì)胞重懸浮于封阻緩沖液中,使OD620達(dá)到0.05。在Costar96孔板的各孔中加入100μl細(xì)菌細(xì)胞。將100μl稀釋的(1∶100、1∶200、1∶400)血清(用封阻緩沖液稀釋)加到各孔中,在4℃培育2小時。將細(xì)胞在4000rpm離心5分鐘,抽出上清液,在各孔中加入200μl/孔封阻緩沖液沖洗細(xì)胞。將100μl R-藻紅蛋白(phicoerytrin)偶聯(lián)的F(ab)2山羊抗小鼠抗體(以1∶100稀釋)加到各孔中,將這些平板在4℃培育1小時。在4000rmp離心5分鐘,使細(xì)胞離心沉降,加入200μl/孔的封阻緩沖液沖洗。抽出上清液,將細(xì)胞重懸浮于200μl/孔的PBS,0.25%甲醛中。將樣品轉(zhuǎn)移到FACScan管中并讀數(shù)。FACScan(激光功率15mW)設(shè)定的條件如下FL2開;FSC-H臨界點92;FSC PMT電壓E01;SSC PMT474;Amp.Gains6.1;FL-2PMT586;補(bǔ)償值0。
與FACS一樣,如下進(jìn)行Western分析來評估細(xì)胞內(nèi)的定位將來自MenB菌株2996的純化的蛋白質(zhì)(500ng/泳道)、外膜小泡(5μg)和全細(xì)胞提取物(25μg)加樣到12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上,將它們轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。該轉(zhuǎn)移用轉(zhuǎn)移緩沖液(0.3%Bris堿、1.44%甘氨酸、20%(v/v)甲醇)在4℃、150mA進(jìn)行2小時。4℃在飽和緩沖液(10%脫脂牛奶、0.1%Triton X100的PBS溶液)中培育過夜,使該膜飽和。用沖洗緩沖液(3%脫脂牛奶、0.1%Triton X100的PBS溶液)沖洗該膜2次,與用以1∶200稀釋的小鼠血清,在37℃培育2小時。沖洗該膜2次,與用1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠Ig的稀釋液培育90分鐘。用0.1%Triton X100的PBS溶液沖洗該膜2次,用Opti-4CN底物試劑盒(Bio-Rad)顯色。加入水終止反應(yīng)。
如下制備OMV37℃、5%CO2,在5GC平板上生長腦膜炎奈瑟球菌菌株2996,用接種環(huán)收獲,并重懸浮于10ml 20mM Tris-HCl pH7.5、2mM EDTA中。在56℃熱滅活45分鐘,在冰上超聲處理5分鐘(50%負(fù)載循環(huán)(duty cycle),50%輸出,Branson超聲發(fā)生器,3mm微型尖頭)破壞細(xì)菌。在5000g離心10分鐘,除去未被破壞的細(xì)胞,回收含有全細(xì)胞包膜成分的上清液,并在4℃以50000g離心過夜。將含膜的沉淀重懸浮于2%月桂酰肌氨酸鈉、20mM Tris-HCl pH7.5、2mM EDTA中,并在室溫培育20分鐘以溶解內(nèi)膜。在10000g離心上清液10分鐘以除去聚集物,將上清液在50000g繼續(xù)離心3小時。在PBS中沖洗含有外膜的沉淀物,將其重懸浮于相同的緩沖液中。以BSA為標(biāo)準(zhǔn),用D.C.Bio-Rad蛋白質(zhì)分析(改進(jìn)的Lowry法)測定蛋白質(zhì)的濃度。
如下制備全細(xì)胞提取物將腦膜炎奈瑟球菌菌株2996在GC平板上生長過夜,用接種環(huán)收獲,重懸浮于1ml 20mM Tris-HCl。在56℃熱滅活30分鐘。
ELISA、FACS和Western分析都顯示ORF21是表面外露的。
用如下的細(xì)菌分析ORF21得到良好的結(jié)果37℃、5%CO2將腦膜炎奈瑟球菌菌株2996在巧克力平板上生長過夜(從冷凍原液開始)。收集菌落,并用7mlMueller-Hinton肉湯(含有0.25%葡萄糖)培育,使OD620達(dá)到0.05-0.08。37℃振蕩培育此培養(yǎng)物約1.5小時,直到OD620值達(dá)到0.23-0.24。用50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.2,含有10mM MgCl2、10mM CaCl2和0.5%(w/v)BSA)(分析緩沖液)稀釋這些細(xì)菌,使工作稀釋液(working dilution)的濃度為105CFU/ml。終反應(yīng)混合物的總體積為50μl,其中25μl為順序兩倍稀釋的測試血清,12.5μl工作稀釋液的細(xì)菌,12.5μl幼兔補(bǔ)體(終濃度25%)。對照包括用補(bǔ)體血清培育的細(xì)菌、用細(xì)菌和在56℃滅活30分鐘的補(bǔ)體培育的免疫血清。添加了幼兔補(bǔ)體后,用標(biāo)題方法立即(時間0)將10μl對照接種Muller-Hinton瓊脂平板上。將此96孔板在37℃旋轉(zhuǎn)培育1小時。將7μl各樣品點樣在Mueller-Hinton瓊脂平板上,而10μl對照用標(biāo)題方法置于平板上(時間1)。37℃培育這些瓊脂平板18小時,計算相應(yīng)于時間0和時間1的菌落。
計算機(jī)分析圖1顯示了ORF2 1的序列以及計算機(jī)分析的數(shù)據(jù)。
ORF21具有如下AMPHI區(qū)域[Gao等人,(1989)J.Immunol.1433007;Robert等人(1996)AIDS Res Hum Retrovir12593;Quakyi等人(1992)Scand J Immunolsuppl.119]SEQ ID 14到32。
抗原指數(shù)算法確定了如下區(qū)域SEQ ID 33到70。
Hopp & Woods分析表明如下親水區(qū)域SEQ ID 71到104。
SEQ ID 14-104可用作這些寡肽或較長的多肽的一部分。
圖2顯示了MenA、MenB和淋球菌的ORF21序列的排列。
疫苗表達(dá)了如上鑒定的三種蛋白質(zhì),并將它們用于免疫接種。觀察到對這些蛋白質(zhì)良好的免疫應(yīng)答。
組合疫苗此外,將這些蛋白質(zhì)各與抗其它病原性生物的抗原(如抗血清群C腦膜炎的Chiron多糖疫苗)相組合,用于免疫接種。觀察到聯(lián)合的免疫應(yīng)答。
可以理解本發(fā)明僅以示例的方式進(jìn)行了描述,在本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)還可進(jìn)行許多改變。
序列表<110>啟龍股份公司(CHIRON SpA)<110>國家公共衛(wèi)生研究所(STATENS INSTITUTT FOR FOLKEHELSE)<120>85kDa奈瑟球菌的抗原<130>P023527WO<150>GB-9928197.4<151>1999-11-29<150>GB-0005698.6<151>2000-03-09<160>106<170>SeqWin99,1.02版本<210>1<211>15<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>1Asp Phe Thr Ile Gln Asp Ile Arg Val Glu Gly Leu Gln Arg Thr1 5 10 15<210>2<211>2394<212>DNA<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>2atgaaactga aacagattgc ttccgcactg atgatgttgg gcatatcgcc tttggcactt 60gccgacttca ccatccaaga catccgcgtc gaaggcttgc agcgtaccga gccgagtacc 120gtattcaact acctgcccgt caaagtcggc gacacctaca acgacacaca cggcagtgcc 180atcatcaaaa gcctgtacgc caccggtttc tttgacgacg tacgcgtcga aactgcggac 240gggcagctcc tgctgaccgt tatcgaacgc cccaccatcg gctcgctcaa catcaccggc 300gcaaaaatgc tgcaaaacga cgccattaag aaaaacctcg aatcgttcgg gctggcgcag 360tcgcaatact ttaatcaggc gacactcaat caggcagtcg ccggcctgaa agaagaatac 420ctcgggcgcg gcaaactcaa tatccaaatc acgcccaaag taaccaaact cgcccgcaac 480cgcgtcgaca tcgacatcac gattgacgag ggcaaatccg ccaaaatcac cgacatcgaa 540tttgaaggca accaagtcta ttccgaccgc aaactgatgc ggcaaatgtc cctgaccgaa 600ggcggcattt ggacatggct gacacgaagc aaccaattca acgagcagaa atttgcccaa 660gatatggaaa aagtaaccga cttctaccaa aataacggct acttcgattt ccgtatcctc 720gataccgaca tccaaaccaa cgaagacaaa accaagcaga ccatcaaaat caccgtccac 780gaaggcggac gtttccgttg gggcaaagtc tccatcgaag gcgacaccaa cgaagtcccc 840aaagccgaac tggaaaaact gctgaccatg aagcccggca aatggtacga acgccagcag 900atgaccgccg ttttgggtga gattcagaac cgcatgggct cggcaggcta cgcatacagc 960gaaatcagcg tacagccgct gccgaacgct gaaaccaaaa ccgtcgattt cgtcctgcac 1020atcgaaccgg gccggaaaat ctacgtcaac gaaatacaca tcaccggcaa caacaaaacc 1080cgcgacgaag tcgtccgccg tgaattacgc caaatggaat ccgcacctta cgacacctcc 1140aagctgcaac gttccaaaga gcgcgtcgag cttttgggct acttcgacaa tgtccagttt 1200gatgctgtcc cgcttgccgg cacgcccgac aaagtcgatt tgaacatgag tctgaccgaa 1260cgttccaccg gttccctgga tttgagcgcg ggttgggttc aagataccgg gttggtcatg 1320tccgcaggcg tttcccaaga caacctgttc ggtacgggca agtcggccgc actgcgcgcc 1380tccaggagca aaaccacgct taacggctcg ctgtcgttta ctgacccgta cttcacggca 1440gacggggtca gcctgggcta cgatgtttac ggaaaagcct tcgacccgcg caaagcatcg 1500accagcatca aacaatataa aaccaccacg gcaggcgcag gcatccgcat gagcgtgcct 1560gttaccgaat acgaccgcgt gaatttcggt ttggtggcag aacacctgac cgtcaacacc 1620tacaacaaag cgcccaaaca ctatgccgac tttatcaaga aatacggcaa aaccgacggc 1680acagacggca gcttcaaagg ctggctgtac aaaggtaccg tcggctgggg gcgcaacaaa 1740accgacagcg cgttatggcc gacgcgcggc tacctgacgg gcgtgaacgc cgaaatcgcc 1800ctgcctggca gcaaactgca atactactcc gccacccaca accaaacctg gttcttcccc 1860ctgagcaaaa ccttcacgct gatgctcggc ggcgaagtcg gcattgcggg cggctacggc 1920agaaccaaag aaatcccctt ctttgaaaac ttctacggcg gcggcctggg ttcggtgcgc 1980ggatacgaaa gcggcacgct cggtccgaaa gtctatgacg aatacggcga aaaaatcagc 2040tacggcggca acaaaaaagc caacgtctcc gccgagctgc tcttcccgat gcccggcgcg 2100aaagacgcgc gcaccgtccg cctgagcctg tttgccgacg caggcagcgt gtgggacggc 2160aaaacctacg acgacaacag cagttccgcg accggcggca gggttcaaaa catttacggc 2220gccggcaata cccataaatc cacctttacc aacgaattgc gctattccgc cggcggcgcg 2280gttacctggc tctcgccttt aggcccgatg aaattcagct acgcctaccc gctgaagaaa 2340aaaccggaag acgaaatcca acgcttccaa ttccaactcg gcacgacgtt ctaa2394<210>3<211>797<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>3Met Lys Leu Lys Gln Ile Ala Ser Ala Leu Met Met Leu Gly Ile Ser1 5 10 15Pro Leu Ala Leu Ala Asp Phe Thr Ile Gln Asp Ile Arg Val Glu Gly20 25 30Leu Gln Arg Thr Glu Pro Ser Thr Val Phe Asn Tyr Leu Pro Val Lys35 40 45Val Gly Asp Thr Tyr Asn Asp Thr His Gly Ser Ala Ile Ile Lys Ser50 55 60Leu Tyr Ala Thr Gly Phe Phe Asp Asp Val Arg Val Glu Thr Ala Asp65 70 75 80Gly Gln Leu Leu Leu Thr Val Ile Glu Arg Pro Thr Ile Gly Ser Leu85 90 95Asn Ile Thr Gly Ala Lys Met Leu Gln Asn Asp Ala Ile Lys Lys Asn100 105 110Leu Glu Ser Phe Gly Leu Ala Gln Ser Gln Tyr Phe Asn Gln Ala Thr115 120 125Leu Asn Gln Ala Val Ala Gly Leu Lys Glu Glu Tyr Leu Gly Arg Gly130 135 140Lys Leu Asn Ile Gln Ile Thr Pro Lys Val Thr Lys Leu Ala Arg Asn145 150 155 160Arg Val Asp Ile Asp Ile Thr Ile Asp Glu Gly Lys Ser Ala Lys Ile165 170 175Thr Asp Ile Glu Phe Glu Gly Asn Gln Val Tyr Ser Asp Arg Lys Leu180 185 190Met Arg Gln Met Ser Leu Thr Glu Gly Gly Ile Trp Thr Trp Leu Thr195 200 205Arg Ser Asn Gln Phe Asn Glu Gln Lys Phe Ala Gln Asp Met Glu Lys210 215 220Val Thr Asp Phe Tyr Gln Asn Asn Gly Tyr Phe Asp Phe Arg Ile Leu225 230 235 240Asp Thr Asp Ile Gln Thr Asn Glu Asp Lys Thr Lys Gln Thr Ile Lys245 250 255Ile Thr Val His Glu Gly Gly Arg Phe Arg Trp Gly Lys Val Ser Ile260 265 270Glu Gly Asp Thr Asn Glu Val Pro Lys Ala Glu Leu Glu Lys Leu Leu275 280 285Thr Met Lys Pro Gly Lys Trp Tyr Glu Arg Gln Gln Met Thr Ala Val290 295 300Leu Gly Glu Ile Gln Asn Arg Met Gly Ser Ala Gly Tyr Ala Tyr Ser305 310 315 320Glu Ile Ser Val Gln Pro Leu Pro Asn Ala Glu Thr Lys Thr Val Asp325 330 335Phe Val Leu His Ile Glu Pro Gly Arg Lys Ile Tyr Val Asn Glu Ile340 345 350His Ile Thr Gly Asn Asn Lys Thr Arg Asp Glu Val Val Arg Arg Glu355 360 365Leu Arg Gln Met Glu Ser Ala Pro Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Gln Arg370 375 380Ser Lys Glu Arg Val Glu Leu Leu Gly Tyr Phe Asp Asn Val Gln Phe385 390 395 400Asp Ala Val Pro Leu Ala Gly Thr Pro Asp Lys Val Asp Leu Asn Met405 410 415Ser Leu Thr Glu Arg Ser Thr Gly Ser Leu Asp Leu Ser Ala Gly Trp420 425 430Val Gln Asp Thr Gly Leu Val Met Ser Ala Gly Val Ser Gln Asp Asn435 440 445Leu Phe Gly Thr Gly Lys Ser Ala Ala Leu Arg Ala Ser Arg Ser Lys450 455 460Thr Thr Leu Asn Gly Ser Leu Ser Phe Thr Asp Pro Tyr Phe Thr Ala465 470 475 480Asp Gly Val Ser Leu Gly Tyr Asp Val Tyr Gly Lys Ala Phe Asp Pro485 490 495Arg Lys Ala Ser Thr Ser Ile Lys Gln Tyr Lys Thr Thr Thr Ala Gly
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Gly Arg Gly Lys Leu1 5 10<210>78<211>12<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>78Lys Val Thr Lys Leu Ala Arg Asn Arg Val Asp Ile1 5 10<210>79<211>18<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>79Ile Thr Ile Asp Glu Gly Lys Ser Ala Lys Ile Thr Asp Ile Glu Phe1 5 10 15Glu Gly<210>80<211>8<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>80Tyr Ser Asp Arg Lys Leu Met Arg1 5<210>81<211>16<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>81Asn Gln Phe Asn Glu Gln Lys Phe Ala Gln Asp Met Glu Lys Val Thr1 5 10 15<210>82<211>18<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>82Arg Ile Leu Asp Thr Asp Ile Gln Thr Asn Glu Asp Lys Thr Lys Gln1 5 10 15Thr Ile<210>83<211>7<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>83Glu Gly Gly Arg Phe Arg Trp1 5<210>84<211>16<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>84Ser Ile Glu Gly Asp Thr Asn Glu Val Pro Lys Ala Glu Leu Glu Lys1 5 10 15<210>85<211>6<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>85Ile Gln Asn Arg Met Gly1 5<210>86<211>7<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>86Pro Asn Ala Glu Thr Lys Thr1 5<210>87<211>7<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>87Glu Pro Gly Arg Lys Ile Tyr1 5<210>88<211>18<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>88Gly Asn Asn Lys Thr Arg Asp Glu Val Val Arg Arg Glu Leu Arg Gln1 5 10 15Met Glu<210>89<211>16<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>89Ala Pro Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Gln Arg Ser Lys Glu Arg Val Glu1 5 10 15<210>90<211>8<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>90Gly Thr Pro Asp Lys Val Asp Leu1 5<210>91<211>7<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>91Leu Thr Glu Arg Ser Thr Gly1 5<210>92<211>14<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>92Lys Ser Ala Ala Leu Arg Ala Ser Arg Ser Lys Thr Thr Leu1 5 10<210>93<211>10<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>93Ala Phe Asp Pro Arg Lys Ala Ser Thr Ser1 5 10<210>94<211>5<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>94Thr Glu Tyr Asp Arg1 5<210>95<211>7<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>95Asn Lys Ala Pro Lys His Tyr1 5<210>96<211>15<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>96Phe Ile Lys Lys Tyr Gly Lys Thr Asp Gly Thr Asp Gly Ser Phe1 5 10 15<210>97<211>7<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>97Gly Arg Asn Lys Thr Asp Ser1 5<210>98<211>5<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>98Gly Arg Thr Lys Glu1 5<210>99<211>8<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>99Lys Val Tyr Asp Glu Tyr Gly Glu1 5<210>100<211>7<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>100Gly Asn Lys Lys Ala Asn Val1 5<210>101<211>9<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>101Gly Ala Lys Asp Ala Arg Thr Val Arg1 5<210>102<211>9<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>102Lys Thr Tyr Asp Asp Asn Ser Ser Ser1 5<210>103<211>5<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>103Thr Gly Gly Arg Val1 5<210>104<211>10<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>104Leu Lys Lys Lys Pro Glu Asp Glu Ile Gln1 5 10<210>105<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>orf21正向引物<400>105cgcggatccc atatggactt caccatccaa gac33<210>106<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>orf21反向引物<400>106cccgctcgag ttagaacgtc gtgccgag 28
權(quán)利要求
1.包括一個或多個如下氨基酸序列的蛋白質(zhì)SEQ ID 1、SEQ ID 3、SEQ ID4、SEQ ID 5、SEQ ID 7、SEQ ID 8、SEQ ID 9、SEQ ID 11、SEQ ID 12、SEQ ID 13、和SEQ ID 14到104。
2.包括與如下序列相同性高于50%的序列的蛋白質(zhì)SEQ ID 1、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5、SEQ ID 7、SEQ ID 8、SEQ ID 9、SEQ ID 11、SEQ ID 12或SEQ ID 13。
3.包括選自以下序列的至少7個連續(xù)氨基酸的片段的蛋白質(zhì)SEQ ID 1、SEQID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5、SEQ ID 7、SEQ ID 8、SEQ ID 9、SEQ ID 11、SEQ ID12或SEQ ID 13。
4.與權(quán)利要求1-3任一所述的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。
5.編碼權(quán)利要求1-3任一所述的蛋白質(zhì)的核酸。
6.含有SEQ ID 2、SEQ ID 6或SEQ ID 10的核酸。
7.含有與SEQ ID 2、SEQ ID 6或SEQ ID 10序列相同性高于50%的序列的核酸。
8.含有選自SEQ ID 2、SEQ ID 6或SEQ ID 10的至少10個連續(xù)核苷酸的片段的核酸。
9.一種組合物,其特征在于,所述的組合物含有權(quán)利要求1-3任一所述的蛋白質(zhì),權(quán)利要求4所述的抗體,和/或權(quán)利要求5-8任一所述的核酸。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物,其特征在于,所述的組合物還含有一種或多種選自以下的免疫原性成分●WO99/57280公開的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段;●WO99/36544公開的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段;●WO99/24578公開的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段;●WO97/28273公開的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段;●WO96/29412公開的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段;●WO95/03413公開的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段;●WO99/31132公開的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段;●抗腦膜炎奈瑟球菌血清群A的保護(hù)性抗原;●抗腦膜炎奈瑟球菌血清群C的保護(hù)性抗原;●抗腦膜炎奈瑟球菌血清群Y的保護(hù)性抗原;●抗腦膜炎奈瑟球菌血清群W的保護(hù)性抗原;●抗流感嗜血菌的保護(hù)性抗原;●抗肺炎球菌的保護(hù)性抗原;●抗白喉的保護(hù)性抗原;●抗破傷風(fēng)的保護(hù)性抗原;●抗百日咳的保護(hù)性抗原;●抗幽門螺旋桿菌的保護(hù)性抗原;●抗脊髓灰質(zhì)炎的保護(hù)性抗原;和/或●抗乙型肝炎病毒的保護(hù)性抗原。
11.如權(quán)利要求9或10所述的組合物,其特征在于,所述的組合物用作藥物。
12.如權(quán)利要求9或10所述的組合物,其特征在于,所述的組合物用作疫苗。
13.權(quán)利要求9或10所述的組合物在制備用于治療或預(yù)防奈瑟球菌引起的感染的藥物中的用途。
14.一種治療患者的方法,該方法包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求9或10所述的組合物。
全文摘要
已克隆、測序和表達(dá)了腦膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌的85kDa抗原。這種抗原對腦膜炎奈瑟球菌的多種菌株、血清群和血清型是共有的,而且在淋病奈瑟球菌、多糖奈瑟球菌和乳糖奈瑟球菌中也是共有的。腦膜炎奈瑟球菌(血清群A和B)和淋病奈瑟球菌的該蛋白質(zhì)的序列是高度同源的。
文檔編號A61K39/10GK1433471SQ00818571
公開日2003年7月30日 申請日期2000年11月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月29日
發(fā)明者M·M·朱利亞尼, M·皮扎, R·拉普奧利, J·霍爾斯特 申請人:啟龍股份公司, 國家公共衛(wèi)生研究所