專利名稱：用于治療和保護結(jié)締組織尤其是軟骨的可植入基材的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及關(guān)節(jié)病中用于治療和保護軟骨的可植入基材(substrate)，更具體地說，涉及用于治療和/或保護結(jié)締組織尤其是軟骨的可植入基材，它包括至少一種利于體內(nèi)細胞侵入和/或形成細胞基質(zhì)和/或釋放所用因素(means)內(nèi)組份的結(jié)構(gòu)，和至少一種用于激活局部存在的細胞使之再生為組織的因素。本發(fā)明還涉及該基材的制造方法，一種在關(guān)節(jié)病中用本發(fā)明基材治療和/或保護結(jié)締組織尤其是軟骨的方法，以及本發(fā)明基材在外科和組織工程中的用途。
關(guān)節(jié)病骨關(guān)節(jié)病是世界上最常見的關(guān)節(jié)病之一，65歲以上人群中大多數(shù)受其影響。治療骨關(guān)節(jié)病的方法因此與臨床、保健政策和經(jīng)濟存在密切相關(guān)。在這種原發(fā)性退行性年齡依賴性疾病的病程中，關(guān)節(jié)表面會發(fā)生局部逐步損壞，并發(fā)生臨近和軟骨下骨結(jié)構(gòu)的反應性局部生長失調(diào)(骨贅)，導致疼痛，以及功能和行動限制。影響骨關(guān)節(jié)病發(fā)生的系統(tǒng)性因素是年齡、性別、體重、骨質(zhì)疏松、遺傳因素和過度的機械負荷(mechanical stress)。局部因素包括關(guān)節(jié)的特定形狀、變形、創(chuàng)傷和具有特殊作用的生物力學因素。雖然是原發(fā)性退行性發(fā)生過程，但在骨關(guān)節(jié)病的病程中可觀察到炎性變性，例如滑膜炎(關(guān)節(jié)內(nèi)皮發(fā)炎)和促進炎癥的生物信使物質(zhì)(細胞因子和生長因子)產(chǎn)生。以上變化表現(xiàn)為承重軟骨和骨結(jié)構(gòu)部位的組織平衡失調(diào)，即，退行性過程與修復過程之間失去了平衡(WB van den Berg細胞因子和生長因子在骨關(guān)節(jié)病中軟骨損壞中的作用。Z Rheumatol.58136-141，1999)。
病因是包括骨、肌肉和關(guān)節(jié)神經(jīng)支配在內(nèi)整個關(guān)節(jié)部位的功能失調(diào)，最后造成過度的機械負荷和生化介導的病患關(guān)節(jié)損傷。而且，重要的是，目前還無法治愈該疾病一般的理療、鎮(zhèn)痛、消炎藥(非甾體類抗風濕藥)都是不徹底的對癥治療。傳統(tǒng)整形外科手段(擴創(chuàng)，關(guān)節(jié)刮削，顯微骨折，鉆孔)也并非完全有效。如果發(fā)生廣泛變性，就只能用假關(guān)節(jié)進行手術(shù)重塑了(JA Buckwalter，HJ Mankin關(guān)節(jié)軟骨的修復和移植關(guān)節(jié)炎和風濕病411131-1342，1998)。用細胞和生長因子通過組織工程再生軟骨組織工程為功能活性的自體細胞移植和任選形狀的生物材料移植提供了新的技術(shù)可能。
用這種技術(shù)可以塑造或培植新的軟骨和骨組織。通常，組織工程的基礎是自體細胞培育，這些細胞被用于日后以溶液或成熟移植體的形式移植到患者體內(nèi)。但不幸的是，這些細胞的繁殖能力有限，而且，體外多次傳代會使這些細胞的功能嚴重丟失。
組織工程的另一種方法是用生長因子刺激組織本身再生，或至少刺激預先取自患者的細胞分化。就此而言，特別值得注意的是TGF-β-超家族，因為它們在組織和器官的發(fā)育中具有重要作用。在組織工程中，運用這些因子有許多截然不同的理論。例如，部分細胞可用TGF-β-家族的基因轉(zhuǎn)染以促進其成熟，但同時也是為了保護例如慢性炎癥關(guān)節(jié)的組織免遭再次損壞(EvansCH，Robbins PD關(guān)節(jié)炎的基因療法，基因療法直接基因轉(zhuǎn)移的方法和應用，JA Wolff編，Boston，Birkhuser，321，(1994)；Kalden JR，Geiler T，Hermann M，Bertling WGentherapieder rheumatoiden Arthritis-ein bereits anwendbares Therapieprinzip？-Z Rheumatol57139-47(1988)；Herndon JH，Robbins PD，Evans CH關(guān)節(jié)炎你的基因治愈了嗎？美國骨關(guān)節(jié)外科雜志81152-7，(1991))。
另一種方法是用釋放系統(tǒng)(US5,910,489)，即，由可吸收的微?；蚣毎d體瞬間釋放出因子，用于例如在治療的關(guān)鍵階段穩(wěn)定植入體。最后，不用細胞，僅用生長因子和生物材料就可以直接再生出組織(Kübler，Osteoinduktion und-reparation，Mund-Kiefer-Gesichtschir.，1，2-25，(1997))。
發(fā)現(xiàn)和鑒定能夠影響體細胞成熟和分化的新因子就可以僅由少量白體細胞制造出完全成熟的替代軟骨或骨。
然而，這種技術(shù)的主要缺點在于必需首先獲得患者的組織樣品，還需要進行相當復雜的細胞培養(yǎng)。
干細胞，生長因子的聚集在自然發(fā)生的組織愈傷過程中，損傷周圍的細胞通常會聚集起來以填補損傷。它們主要是前體細胞，這些細胞以后將通過分化發(fā)育成具有特定功能的組織細胞。因此，發(fā)生骨折時，來自骨膜和骨髓的前體細胞遷移到損傷部位，“繞過”軟骨組織而形成新骨。但是，利用侵入的前體細胞自然再生軟骨人體中根本不行。顯微骨折等方法的目標是打開來自骨髓的細胞進入關(guān)節(jié)間隙的通道。
在軟骨治療領域還開發(fā)了一些生物活性物質(zhì)，它們具有趨化性、抗炎性、抗血管生成性、誘導分化或抗粘附性(美國專利5,853,746用功能性壁壘治療和修復軟骨或骨損傷的方法和組合物；美國專利5,817,773利用成纖維細胞生長因子的干細胞刺激、產(chǎn)生、培養(yǎng)和移植；美國專利5,910,489含有透明質(zhì)酸和NSAIDs的局部用組合物)。
本發(fā)明的目的是發(fā)明一種可用于治療和/或保護結(jié)締組織尤其是軟骨的基材。以上目的的實現(xiàn)是通過提供一種可在關(guān)節(jié)病中用于治療和/或保護結(jié)締組織尤其是軟骨的可植入基材。
本發(fā)明的基礎是運用或刺激多能前體細胞和間質(zhì)干細胞來再生組織，涉及繁殖和分化的潛力對軟骨和骨的治療具有極大意義。前體細胞和干細胞的應用方式與成熟細胞的類似。這樣，就可以在特定的培養(yǎng)條件下，用不同的形態(tài)發(fā)生因子，例如FGF(成纖維細胞生長因子)或TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子β)-超家族影響它們的分化(美國專利5,817,773)。
因此，本發(fā)明涉及一種用于治療和/或保護結(jié)締組織尤其是軟骨的可植入基材，它包含至少一種可活化局部存在的細胞以實現(xiàn)組織再生的因素(means)，和至少一個利于體內(nèi)細胞侵入和/或細胞基質(zhì)形成和/或上述因素中組份釋放的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明還涉及一種用于保護和/或治療結(jié)締組織尤其是軟骨的基材，它包含至少一種包括分化和趨化因子的因素，最好還包含前文所述的結(jié)構(gòu)。
在本文中，“基材”即完整的本發(fā)明主題。本發(fā)明的基材可以是，例如，可鋪展或膠粘性“細胞吸引性糊劑”或一種“生物活性軟骨硬膏”。


圖1顯示了本發(fā)明的一種實施方式。
“利于體內(nèi)細胞侵入和/或細胞基質(zhì)形成和/或所用因素中組份釋放的結(jié)構(gòu)”指內(nèi)含本發(fā)明上述因素的基質(zhì)。
“因素”包括所有適用于本發(fā)明的生物活性和非活性組份，它們的作用是激活局部存在的細胞以實現(xiàn)組織再生。
“趨化因子”指能夠?qū)⒓毎拔钡街委煵课换虮景l(fā)明基材所在位置的生物活性因子，所述的細胞例如來自骨髓的軟骨前體細胞，自體間質(zhì)細胞，祖細胞和干細胞。
“分化因子”指能夠誘導細胞例如前文所述細胞生長并形成新組織的生物活性因子。
出人意料的是，本發(fā)明可提供一種基材，它含有能夠誘導并控制來自周圍組織(如果是關(guān)節(jié)軟骨，所述周圍組織就是骨髓或滑膜)的組織前體細胞侵入的因素。這樣的誘導和控制緣自本發(fā)明基材所含因素在治療過程中的釋放。
圖1顯示了一種夾心結(jié)構(gòu)的本發(fā)明優(yōu)選實施方式。因素本發(fā)明的因素能夠誘導并控制來自周圍組織的組織前體細胞向治療部位的侵入。通常，所述因素即能夠動員和/或活化和/或吸引自體間質(zhì)細胞、祖細胞和干細胞的物質(zhì)。具體地說，這些因素包括生物活性因子，例如趨化因子或趨化和分化因子。具體地說有以下因子生長和分化因子，例如TGF超家族的因子，F(xiàn)GF家族的因子，PDGF，IGF，EGF；細胞粘附分子，例如整聯(lián)蛋白，CD44，選擇蛋白，蛋白聚糖；合成肽，例如RGD序列，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸；細胞因子；趨化因子，例如CDMP，CTGF，骨橋蛋白，NO-合成酶阻滯劑；或胞外基質(zhì)組份，例如蛋白聚糖，纖連蛋白，膠原蛋白。
此外，根據(jù)用途，本發(fā)明所述的因素可還包括以下組份酶或其前體，例如蛋白酶，金屬蛋白酶，組織蛋白酶；酶抑制劑，例如THVIP，抗體或催化中心的合成阻滯劑；抗炎添加劑，例如抗炎藥物和/或抗炎因子。
此外，所述因素還可包括自體細胞和非自體細胞，例如間質(zhì)細胞，祖細胞和干細胞/前體細胞，然后由它們釋放出相應的因子。
在進一步的實施方式中，還可將基因或生物活性因子轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)。
本發(fā)明所用因素的兩種或更多種組份可以同時或先后，及/或從本發(fā)明基材或結(jié)構(gòu)的兩相或更多相/組份/層中分別釋放。此外，本發(fā)明的因素和/或結(jié)構(gòu)還可含有延遲組份釋放的機制。結(jié)構(gòu)本發(fā)明的基材還具有利于體內(nèi)細胞侵入和/或形成細胞基質(zhì)和/或釋放所用因素中組份(尤其是所含各因子)的結(jié)構(gòu)，實施方式之一中，所述結(jié)構(gòu)為必選，另一本發(fā)明所述利于體內(nèi)細胞侵入和/或形成細胞基質(zhì)和/或釋放所用因素中組份(尤其是趨化和/或分化因子)的結(jié)構(gòu)包括水凝膠；海綿體(例如膠原質(zhì)海綿體)；
多糖制成的毛或棉毛樣結(jié)構(gòu)(例如，纖維素毛，纖維素棉毛)；天然或合成的多肽(血纖蛋白，聚賴氨酸)；纖維制成的褶紋布、紗或織物(例如可吸收的聚合物纖維)；粘合糊劑(例如丙烯酸酯)，膠粘膜(血纖蛋白原，有涂層的透明質(zhì)酸片)；陶瓷材料；或以上所述的組合。
本發(fā)明所用的結(jié)構(gòu)，亦即本發(fā)明的基材，可以是可吸收的也可以是不可吸收的。例如，可吸收的結(jié)構(gòu)可包含透明質(zhì)酸(最好是分子量400-600kD的透明質(zhì)酸)，聚α羥基酸，膠原，藻酸鹽(酯)，瓊脂糖，血纖蛋白，生物玻璃材料，或它們的組合。不可吸收結(jié)構(gòu)可包含例如陶瓷材料，或陶瓷材料與可吸收性結(jié)構(gòu)的組合。
此外，本發(fā)明的基材可以包含多個亞結(jié)構(gòu)。這些亞結(jié)構(gòu)能夠儲存并釋放本發(fā)明所用因素或其中的各組份，它們包括多個層、液滴/微球或表面包衣。因此，可以在陶瓷材料的格狀結(jié)構(gòu)中包含內(nèi)有本發(fā)明因素的水凝膠。
因此，本發(fā)明基材可以制成海綿的形狀，珠體、膜/片、柵格、棉毛、袋子/墊子、液體、凝膠或多層材料的形式。此時，所述基材可以是含有包含透明質(zhì)酸及趨化生長因子(例如骨橋蛋白)的聚合物(例如聚乙醇酸交酯)毛樣結(jié)構(gòu)。
總的說來，本發(fā)明的基材具有可成形，可鋪展或糊狀特性，并具有彈性或塑性之類機械特性，而且是可注射的。
本發(fā)明的基材或其中的結(jié)構(gòu)(如果有)可以包含多個相和/或組份和/或?qū)?，然后分別釋放兩種或多種因素。
在一優(yōu)選實施方式中，可將間質(zhì)干細胞與透明質(zhì)酸混合，然后在治療部位進行注射。
在一
具體實施例方式
中，所述基材為多層結(jié)構(gòu)，用于覆蓋關(guān)節(jié)表面，在其下表面用栓、空心栓/針和/或固定結(jié)構(gòu)(例如Velcro搭扣)固定。此外，它們可構(gòu)建成在其下表面釋放(例如)軟骨消化酶即金屬蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、組織蛋白酶。所述的栓、空心針或固定結(jié)構(gòu)最好是可吸收的。
在另一實施方式中，用雙筒注射器同時注射或用不同的注射器先后注射間質(zhì)干細胞和/或其他結(jié)締組織前體細胞和透明質(zhì)酸，所述細胞例如骨外膜和軟骨膜的細胞。
本發(fā)明的可植入基材能夠動員、活化和/或吸引自體間質(zhì)細胞、祖細胞和/或干細胞，并刺激它們繁殖、分化和/或成熟。還可向這些細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染基因或上述生物活性因子。制造方法本發(fā)明可植入基材的制造是通過將利于形成細胞基質(zhì)和/或體內(nèi)細胞侵入和/或釋放所用因素中組份的結(jié)構(gòu)與至少一種用于活化局部存在的細胞以再生組織的因素接觸；或者，如果本發(fā)明的基材不包含所述結(jié)構(gòu)，則其制造是通過接觸分化因子和趨化因子。治療方法此外，本發(fā)明還涉及一種治療和/或保護結(jié)締組織的方法，尤其是在關(guān)節(jié)病中。該方法的特征在于結(jié)締組織與本發(fā)明的基材接觸。
“結(jié)締組織”在本文中包括軟骨、骨、腱和半月板。在一優(yōu)選實施方式中，當本發(fā)明方法用于治療和/或保護軟骨時，在軟骨與本發(fā)明基材接觸前先在軟骨的軟骨下間隙內(nèi)形成連接通道。
例如，在進行軟骨治療和保護時，可用血纖蛋白或丙烯酸酯膠粘劑將所述基材固定于關(guān)節(jié)表面。所述血纖蛋白和丙烯酸酯膠粘劑最好與現(xiàn)成的趨化生長因子(軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白或結(jié)締組織生長因子)一同給予。它們被固定于關(guān)節(jié)表面，最好用凝血酶形成人造的超級血凝塊(superclot)?；蛘?，在用雙筒注射器時，本發(fā)明的基材包含一管內(nèi)的本發(fā)明因素，例如分化因子和/或趨化因子，和另一管內(nèi)的凝血酶。具體地說，后一種改換方式用于在治療部位預先形成顯微骨折之后，這樣可以將生物活性物質(zhì)(因素)引入超級血凝塊。
誘導因素和/或因子的釋放最好從外部實施，例如利用磁場、電流或電壓脈沖、物質(zhì)的遷移或注射。
本發(fā)明基材適宜在形成通入例如軟骨下間隙的通道后植入，所述通道可通過例如顯微骨折、鉆孔、針刺等方法形成。在骨髓腔和關(guān)節(jié)間隙之間形成連接通道/孔可使用針柵，而該針柵可以是本發(fā)明結(jié)構(gòu)的一部分?；虿捎肰elcro搭扣樣固定結(jié)構(gòu)，使用時在下面墊以針柵。
以上本發(fā)明優(yōu)選實施方式中之一的方法其特征在于關(guān)節(jié)間隙和骨髓腔之間形成連接通道，關(guān)節(jié)病變軟骨上粘附有粘性的親軟骨層，來自骨髓的細胞被吸引并進入周圍軟骨組織中發(fā)育，粘附層中的環(huán)境則臨時提供營養(yǎng)和良性影響。這樣，使用本發(fā)明基材在關(guān)節(jié)間隙與骨髓腔之間通過大量預先形成的微小孔/通道能夠?qū)崿F(xiàn)連接，由此誘導周圍組織中的組織前體細胞的侵入，并可形成用于形成細胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu)。上述方法的特點之一是所述基材(最好分多層)包含能夠覆蓋關(guān)節(jié)表面的結(jié)構(gòu)和/或因素，由此誘導來自骨髓的軟骨前體細胞的生長和成熟。
本發(fā)明基材表現(xiàn)為已知元素(間質(zhì)細胞，祖細胞，來自骨髓的干細胞/前體細胞，生物活性因子)和新元素(骨髓腔和關(guān)節(jié)間隙之間的連接通道；用于覆蓋關(guān)節(jié)誘導來自骨髓的軟骨前體細胞生長和成熟的多層材料；人造超級血凝塊)的組合，它們相互影響，因為它們的新作用產(chǎn)生了本發(fā)明的優(yōu)點(協(xié)同作用)和期望的成功，這是因為來自骨髓的細胞現(xiàn)在可以在本發(fā)明基材(例如用于覆蓋關(guān)節(jié)表面的多層基材)中被吸引并進入軟骨組織發(fā)育。使用本發(fā)明基材可最大限度地避免外部培養(yǎng)細胞然后將培養(yǎng)細胞植入患者，更好的是，完全替代后者。
本發(fā)明基材的用途體現(xiàn)在它們在外科和組織工程中的應用，具體地說，體現(xiàn)在關(guān)節(jié)病中軟骨治療和保護領域，以及它們用于細胞繁殖、分化和成熟的用途。
以下將通過實施例來進一步解釋本發(fā)明。
NSAID非甾體消炎藥；PDGF血小板源性生長因子(由血小板形成的生長因子)；RGD序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列；PVC聚氯乙烯；TGF-β-超家族轉(zhuǎn)化生長因子β超家族；TIMP金屬蛋白酶的組織抑制劑。
圖1中數(shù)字的說明1鋪展的物質(zhì)；2通向骨髓的連接通道；3前體細胞從骨髓遷出；4生物活性因子的釋放；5間質(zhì)細胞，可以經(jīng)基因修飾；6含有生物活性因子的顆粒；7覆蓋層；8含有分化因子或組織形成因子的層；9含有趨化因子的層。
權(quán)利要求
1.用于治療和/或保護結(jié)締組織尤其是軟骨的可植入基材，它包含至少一種用于活化局部存在的細胞以實現(xiàn)組織再生的藥劑，和至少一個利于體內(nèi)細胞侵入和/或形成細胞基質(zhì)和/或釋放上述藥劑內(nèi)組份的結(jié)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基材，所述的至少一種藥劑包含趨化因子，或分化因子和趨化因子。
3.一種用于治療和/或保護結(jié)締組織尤其是軟骨的可植入基材，包含至少一種包括分化和趨化因子的藥劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的基材，其特征在于具有至少一種覆蓋材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的基材，其特征在于，所述的結(jié)構(gòu)包含至少一個以下組成部分(a)水凝膠；(b)海綿體，例如膠原海綿體；(c)多糖制成的毛或藥綿，例如纖維素毛，纖維素藥綿；(d)天然或合成多肽，如血纖蛋白，聚賴氨酸；(e)纖維制成的褶紋布、紗或織物，例如可吸收的聚合物纖維；(f)粘合糊劑，丙烯酸酯粘合劑，膠粘片，具有血纖蛋白原涂層的透明質(zhì)酸片；(g)陶瓷材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的基材，其特征在于所述的至少一種藥劑含有選自以下物質(zhì)組的生物活性因子生長因子和分化因子，細胞粘附分子，合成肽，細胞因子，趨化因子，和胞外基質(zhì)組份。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的基材，其特征在于包含可將該基材固定于處理部位之內(nèi)或之上的固定結(jié)構(gòu)。
8.權(quán)利要求1至7中任一項所述的基材的制造方法，其特征在于，將形成細胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu)與至少一種用于活化局部存在的細胞以實現(xiàn)組織再生的藥劑相互接觸，或者將分化因子和趨化因子相互接觸。
9.治療和/或保護結(jié)締組織的方法，其特征在于，使結(jié)締組織與權(quán)利要求1至7中任一項所述的基材或按權(quán)利要求8所述方法制得的基材相互接觸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述結(jié)締組織是軟骨，且在軟骨與所述基材接觸前，先在軟骨下間隙內(nèi)形成連接通道。
11.權(quán)利要求1至7中任一項所述基材或按權(quán)利要求8所述方法制得的基材在手術(shù)治療和組織工程中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在關(guān)節(jié)病中用于治療和保護結(jié)締組織尤其是軟骨的可植入基材。本發(fā)明還涉及用于活化靜息間質(zhì)細胞以實現(xiàn)組織再生的系統(tǒng)及其輔助因素。本發(fā)明在關(guān)節(jié)間隙和骨髓腔之間形成微通道。然后在關(guān)節(jié)表面覆蓋以多層材料，這些材料可誘導來自骨髓的軟骨前體細胞生長并成熟。
文檔編號A61F2/30GK1424916SQ00818566
公開日2003年6月18日 申請日期2000年11月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月24日
發(fā)明者M·西廷格, O·舒爾茨, G·R·伯梅斯特 申請人:轉(zhuǎn)組織技術(shù)有限公司