專利名稱：腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的多核苷酸和多肽BASB033及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多核苷酸(此處指“BASB033多核苷酸”)，其編碼的多肽(此處指“BASB033”或者“BASB033多肽”)，重組物質(zhì)，以及它們的生產(chǎn)方法。另一方面，本發(fā)明涉及使用這些多肽和多核苷酸的方法，包括抗細(xì)菌感染的疫苗。另一方面，本發(fā)明涉及檢測某些病原體感染的診斷分析。
背景技術(shù)：
腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)(腦膜炎球菌)是一種常見的從人上呼吸道分離得到的革蘭氏陰性菌。它有時會造成侵襲性細(xì)菌疾病，例如菌血癥和腦膜炎。腦膜炎球菌疾病(meningococcal disease)的發(fā)生率表現(xiàn)出地區(qū)性的季節(jié)差異和年度差異(Schwartz，B.，Moore，P.S.，Broome，C.V.；臨床微生物學(xué)研究(Clin.Microbiol.Rev.)2(增刊)，S18-S24，1989)。溫暖國家中的大多數(shù)這種疾病是由于血清組B菌株引起的，其發(fā)生率從1-10/100,000/年總?cè)丝谥g變化，有時更高(Kaczmarski，E.B.(1997)，Commun.Dis.Rep.Rev.7R55-9，1995；Scholten，R.J.P.M.，Bijlmer，H.A.，Poolman，J.T.等，臨床感染疾病(Clin.Infect.Dis.)16237-246，1993；Cruz，C.，Pavez，G.，Aguilar，E.，等，流行性感染(Epidemiol.Infect.)105119-126，1990)。
血清組A腦膜炎球菌控制的流行病，大多發(fā)生在中部非洲，該病有時會達(dá)到1000/100,000/年的水平(Schwartz，B.，Moore，P.S.，Broome，C.V.臨床微生物學(xué)研究(Clin.Microbiol.Rev.)2(增刊)，S18-S24，1989)。幾乎所有的腦膜炎球菌疾病都是由血清組A，B，C，W-135和Y腦膜炎球菌造成的，四價的A，C，W-135，Y多糖疫苗對此有效(Armand，J.，Arminjon，F(xiàn).，Mynard，M.C.，Lafaix，C.，J.Biol.Stand.10335-339，1982)。
現(xiàn)在多糖疫苗通過將其化學(xué)結(jié)合到載體蛋白質(zhì)上而得到了改進(jìn)(Lieberman，J.M.，Chiu，S.S.，Wong，V.K.，等，JAMA2751499-1503，1996)。
血清組B疫苗是不可用的，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)B莢膜多糖是沒有免疫原性的，很可能是因?yàn)樗c宿主成分有共同的結(jié)構(gòu)相似性(Wyle，F(xiàn).A.，Artenstein，M.S.，Brandt，M.L.等，傳染病雜志(J.Infect.Dis.)126514-522，1972Finne，J.M.，Leinonen，M.，Mkel，P.M.，Lancet ii.355-357，1983)。
多年以來，發(fā)起并進(jìn)行了很多的研究工作，以開發(fā)基于腦膜炎球菌外膜的疫苗(de Moraes，J.C.，Perkins，B.，Camargo，M.C.等，Lancet3401074-1078，1992；Bjune，G..，Hoiby，E.A.，Gronnesby，J.K.等，3381093-1096，1991)。這種疫苗經(jīng)證實(shí)對于年齡較大的兒童(4歲以上)和成年人有57％-85％的功效。
許多細(xì)菌外膜成分出現(xiàn)在這些疫苗中，例如PorA，PorB，Rmp，Opc，Opa，F(xiàn)rpB，而且這些組分對于所觀察到的保護(hù)作用仍需要進(jìn)一步確定。其他細(xì)菌外膜成分，通過使用動物或者人體的與誘導(dǎo)保護(hù)性免疫潛在相關(guān)的抗體得以確定，例如TbpB和NspA(Martin，D.，Cadieux，N.，Hamel，J.，Brodeux，B.R.，實(shí)驗(yàn)藥物雜志(J.Exp.Med.)1851173-1183，1997Lissolo，L.， -Wilmotte，C.，Dumas，p.等，感染免疫(Inf.Immun.)63884-890，1995)。保護(hù)性免疫的機(jī)制包括抗體介導(dǎo)的殺菌活性和調(diào)理素噬菌作用(opsonophagocytosis)。
使用了一種菌血癥動物模型，該模型同時具有所有抗體介導(dǎo)的機(jī)制(Saukkonen，K.，Leinonen，M.，Abdillahi，H.，Poolman，J.T.，疫苗(Vaccine)7325-328，1989)。通常認(rèn)為，后補(bǔ)體成分介導(dǎo)的殺菌機(jī)制對于抗腦膜炎球菌疾病的免疫是至關(guān)重要的(Ross，S.C.，Rosenthal P，J.，Berberic，H.M.，Densen，P.傳染病雜志(J.Infect.Dis.)1551266-1275，1987)。
腦膜炎奈瑟氏球菌感染發(fā)生的頻率在過去幾十年中有大幅度升高。這是由于抗生素抗性菌株增殖的出現(xiàn)，以及免疫系統(tǒng)較弱的人口數(shù)量的增加。分離出抵抗部分或者全部標(biāo)準(zhǔn)抗生素的腦膜炎奈瑟氏球菌已不再罕有。這種現(xiàn)象造成了未滿足的醫(yī)療需求和對新的抗微生物藥劑、疫苗、藥物篩選方法和對該生物體診斷測試的需要。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及BASB033，特別是BASB033多肽和BASB033多核苷酸，重組物質(zhì)，以及它們的生產(chǎn)方法。另一方面，本發(fā)明涉及使用這些多肽和多核苷酸的方法，包括對微生物疾病的預(yù)防和治療，以及其他。另一方面，本發(fā)明涉及檢測與微生物感染相關(guān)的疾病的診斷分析，以及檢測與這些感染相關(guān)的癥狀診斷分析，例如檢測BASB033多核苷酸或多肽表達(dá)或者活性的分析。
通過閱讀以下敘述以及本公開內(nèi)容的其他部分，在本公開發(fā)明精神和范疇內(nèi)的各種變化和修改，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是很明顯的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及BASB033多肽和多核苷酸，下面有對其更詳細(xì)的描述。特別是，本發(fā)明涉及腦膜炎奈瑟氏球菌的BASB033多肽和多核苷酸，它們與肺炎克氏桿菌(K1ebsiella pneumoniae)外膜磷脂酶A蛋白質(zhì)在氨基酸序列同源性上相關(guān)。本發(fā)明尤其涉及BASB033，其核苷酸序列和氨基酸序列分別陳述于SEQ ID NO1，3和SEQ ID NO2，4。在下面序列表中作為“DNA”的序列，被認(rèn)為是代表本發(fā)明一種實(shí)施方案的范例，因?yàn)榫哂幸话慵夹g(shù)的人可以認(rèn)識到這些序列通常可用于多核苷酸，包括多聚核糖核苷酸。
多肽本發(fā)明一方面提供了腦膜炎奈瑟氏球菌的多肽，此處指“BASB033”和“BASB033多肽”，以及其生物的、診斷的、預(yù)防的、臨床的或治療的有用變體，和包含該成分的組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了(a)一種分離出的多肽，該多肽包含一段氨基酸序列，這段氨基酸序列與SEQ ID NO2，4有至少85％同一性，更優(yōu)選有至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性或者完全同一；(b)一種由分離出的多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸包含一段多核苷酸序列，這段多核苷酸序列與SEQ ID NO1，3，就SEQ IDNO1，3全長而言，分別有至少85％同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，甚至更優(yōu)選至少95％的同一性，更優(yōu)選至少97-99％的同一性或者完全同一；(c)一種由分離出的多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸包含一段多核苷酸序列，這段多核苷酸序列編碼的多肽與SEQ ID NO2，4的氨基酸序列有至少85％同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，甚至更優(yōu)選至少95％的同一性，更優(yōu)選至少97-99％的同一性或者完全同一；在SEQ ID NO2，4中提供的BASB033多肽，是來自腦膜炎奈瑟氏球菌ATCCl3090菌株和H44/76菌株的BASB033多肽。
本發(fā)明也提供了一種BASB033多肽的免疫原性片段，該片段是BASB033多肽的一段連續(xù)部分，它具有與包含SEQ ID NO2，4氨基酸序列的多肽相同的或者基本相同的免疫原性。這就是說，該片段(如需要可結(jié)合到載體上)可以引起識別BASB033多肽的免疫反應(yīng)。這樣的免疫原性片段可以包括，例如缺少N-末端前導(dǎo)序列的BASB033多肽，和/或缺少跨膜結(jié)構(gòu)域的BASB033多肽和/或缺少C-末端錨定結(jié)構(gòu)域的BASB033多肽。在一個優(yōu)選方面，根據(jù)本發(fā)明，BASB033的免疫原性片段基本上包含一種多肽全部的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，該多肽與SEQID NO2，4在SEQ ID NO2全長上有至少85％同一性，更優(yōu)選有至少90％的同一性，甚至更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性或者完全同一。
一段片段是指一段多肽，該多肽包含與本發(fā)明任何多肽的一部分完全相同的氨基酸序列，但是并不包含其全部的氨基酸序列。至于BASB033多肽，片段可以是分離的，或者是被包含在一段更大的多肽中構(gòu)成其一部分或者一個區(qū)域，最優(yōu)選是作為單個更大多肽的一段單獨(dú)連續(xù)區(qū)域。
優(yōu)選的片段包括，例如包含部分SEQ ID NO2，4氨基酸序列或其變體的截?cái)喽嚯?，例如一系列包含氨?和/或羧基-末端氨基酸序列的殘基。由宿主細(xì)胞或者在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的本發(fā)明多肽的降解形式也是優(yōu)選的。更優(yōu)選的片段是具有結(jié)構(gòu)或者功能屬性特征的片段，例如包含以下結(jié)構(gòu)區(qū)域的片段α-螺旋和α-螺旋形成區(qū)域(a-helixforming regions)，β-折疊和β-折疊形成區(qū)域(β-sheet-formingregions)，轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)角形成區(qū)域(turn-forming regions)，卷曲和卷曲形成區(qū)域(coil-forming regions)，親水區(qū)域，疏水區(qū)域，α兩親性區(qū)域，B兩親性區(qū)域，柔性區(qū)域，表面形成區(qū)域，底物結(jié)合區(qū)域，以及高度抗原標(biāo)志區(qū)域(high antigenic index regions)。
更優(yōu)選的片段包括一種分離出的多肽，該多肽包含至少15，20，30，40，50，或者100個來自SEQ ID NO2，4氨基酸序列中的連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，或者包括一種分離出的多肽，該多肽包含至少15，20，30，40，50，或者100個從SEQ ID NO2，4氨基酸序列中截取或刪除的連續(xù)氨基酸的氨基酸序列。
通過多肽合成，本發(fā)明多肽的片段可以用于生產(chǎn)相應(yīng)的全長多肽；因此，這些片段可以用作生產(chǎn)本發(fā)明全長多肽的中間體。
特別優(yōu)選的是其中的幾個，5-10，1-5，1-3，1-2或1個氨基酸以任意組合被置換、刪除或者添加的變體。
本發(fā)明的多肽或者免疫原性片段，可以以“成熟的”蛋白質(zhì)形式存在或者可以是較大蛋白質(zhì)，例如前體或者融合蛋白的一部分。包含一段額外的氨基酸序列常常是有利的，這種額外的氨基酸序列包括分泌或者前導(dǎo)序列，原序列(pro-sequence)，像多個組氨酸殘基這樣有助于純化的序列，或者生產(chǎn)重組體時助于穩(wěn)定的額外序列。另外，也考慮了附加外源多肽或者脂質(zhì)尾部或者多核苷酸序列，以增加最終分子免疫原性的潛力。
另一方面，本發(fā)明涉及遺傳工程制備的包含本發(fā)明多肽或者其片段的可溶性融合蛋白，以及各種免疫球蛋白亞類(IgG，IgM，IgA，IgE)的重鏈或者輕鏈的恒定區(qū)的各部分。優(yōu)選的免疫球蛋白是人類IgG的重鏈不變部分，特別是IgGl的重鏈不變部分，融合發(fā)生在鉸鏈區(qū)。在一個特殊的實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分可以通過結(jié)合一段切割序列而簡單地除去，這段切割序列可以被凝血因子Xa切開。
另外，本發(fā)明涉及用遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，以及這些融合蛋白在藥物篩選、診斷和治療上的用途。本發(fā)明的另一方面也涉及編碼這些融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術(shù)的實(shí)例可以在國際專利申請WO94/29458和WO94/22914中找到。
這些蛋白質(zhì)可以化學(xué)結(jié)合，也可以作為重組融合蛋白表達(dá)，融合蛋白與非融合蛋白相比，可以增加在表達(dá)系統(tǒng)中的產(chǎn)量。融合配偶體可以有助于提供T輔助抗原決定簇(免疫融合配偶體)，最好是可以被人體識別的T輔助抗原決定簇，或者有助于蛋白質(zhì)以高于天然重組蛋白的產(chǎn)量表達(dá)(表達(dá)增強(qiáng)子)。優(yōu)選融合配偶體既是免疫融合配偶體又是表達(dá)增強(qiáng)配偶體。
融合配偶體包括來自流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)的蛋白質(zhì)D和來自流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，NS1(紅血球凝聚素，hemagglutinin)。另一種融合配偶體是稱為LytA的蛋白質(zhì)。優(yōu)選使用該分子的C末端部分。LytA來自肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)，該菌合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，酰胺酶LytA，(由1ytA基因{Gene，43(1986)265-272頁}編碼)一種專一性裂解肽聚糖骨架中特定鍵的自溶素。LytA蛋白質(zhì)C末端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與膽堿或者象是DEAE等膽堿類似物親和。這一特性已經(jīng)用于開發(fā)用于表達(dá)融合蛋白的大腸桿菌C-LytA表達(dá)質(zhì)粒。氨基末端包含C-LytA片段的雜合蛋白的純化已經(jīng)有所描述{生物技術(shù)(Biotechnology)10，(1992)795-798頁}。可以利用LytA分子C末端起始于178殘基的重復(fù)部分，例如188-305殘基。
本發(fā)明也包括上述多肽的變體，即通過保守氨基酸置換而與原多肽不同的多肽，由此一個殘基被另一個具有相似特性的殘基所置換。典型的這種置換發(fā)生在丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸之間；絲氨酸和蘇氨酸之間；酸性殘基天冬氨酸和谷氨酸之間；天冬酰胺和谷氨酰胺之間；以及堿性殘基賴氨酸和精氨酸之間；或者芳香族殘基苯丙氨酸和酪氨酸之間。
本發(fā)明的多肽可以用任何合適的方式制備。這樣的多肽包括分離出的天然存在的多肽，重組產(chǎn)生的多肽，合成產(chǎn)生的多肽，或者這些方法結(jié)合產(chǎn)生的多肽。制備這些多肽的方法在本領(lǐng)域是熟知的。
本發(fā)明最優(yōu)選的多肽來自腦膜炎奈瑟氏球菌，然而，這種多肽也可以優(yōu)選得自同分類屬的其他生物。例如，本發(fā)明的多肽也可以得自同分類科或者同目的其他生物。
多核苷酸本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供編碼BASB033多肽的多核苷酸，特別是編碼此處命名為BASB033的多肽的多核苷酸。
在本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多核苷酸包括一段編碼BASB033多肽的區(qū)域，該段區(qū)域包括一段陳述于SEQ ID NO1，3的序列，該序列包括全長的基因，或者其變體。
SEQ ID NO1，3中提供的BASB033多核苷酸，是來自腦膜炎奈瑟氏球菌ATCC13090菌株和H44/76菌株的BASB033多核苷酸。
本發(fā)明的一個方面，提供了分離出的編碼和/或表達(dá)BASB033多肽的核酸分子以及多核苷酸，特別是腦膜炎奈瑟氏球菌BASB033多肽和多核苷酸，例如包括未加工的RNA，核酶RNA，mRNA，cDNA，基因組DNA，B-DNA和Z-DNA。本發(fā)明其他實(shí)施方案包括，生物的、診斷的、預(yù)防的、臨床的或治療的有用多核苷酸和多肽，以及其變體，和包含該成分的組合物。
本發(fā)明的另一個方面，涉及分離出的編碼BASB033多肽的多核苷酸，與其密切相關(guān)的多核苷酸，以及其變體，其中該多核苷酸包括至少一個全長基因，該BASB033多肽具有推導(dǎo)出的SEQ ID NO2，4氨基酸序列。
在本發(fā)明另一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，存在包含或者由SEQ IDNO2，4氨基酸序列組成的來自腦膜炎奈瑟氏球菌的BASB033多肽，或者其變體。
使用此處提供的信息，本發(fā)明編碼BASB033多肽的多核苷酸，例如陳述于SEQ ID NO1，3的多核苷酸序列，可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)的克隆和篩選方法得到，例如使用腦膜炎奈瑟氏球菌細(xì)胞作為起始材料，從細(xì)菌中克隆和篩選染色體DNA片段，接著獲得全長克隆的方法。例如，為得到象在SEQ ID NO1，3中給出的多核苷酸序列這樣的本發(fā)明的多核苷酸序列，在大腸桿菌或者一些其他合適宿主中典型的腦膜炎奈瑟氏球菌染色體DNA克隆文庫，用來自部分序列的放射性標(biāo)記的寡聚核苷酸進(jìn)行探測，該寡聚核苷酸優(yōu)選是17-鏈節(jié)或者更長。然后，使用嚴(yán)格雜交條件，可以辨別出攜帶有與探針DNA相同的DNA的克隆。通過使用按原始多肽序列或者多核苷酸序列設(shè)計(jì)的測序引物，對經(jīng)雜交鑒定的單個克隆進(jìn)行測序，有可能對多核苷酸序列向兩個方向進(jìn)行擴(kuò)增，以確定全長基因序列。例如，方便起見，使用由質(zhì)?？寺≈苽涞淖冃缘碾p鏈DNA進(jìn)行測序。Maniatis，T.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Sambrook等，在分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(MOLECULAR CLONE，A LABORATORYMANUAL)，第二版；冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，冷泉港，紐約(1989)中對合適的方法進(jìn)行了描述。(特別參見通過雜交1.90和對變性的雙鏈DNA模板測序13.70來篩選(Screening By Hybridization 1.90 andSequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.701)。也可以進(jìn)行直接基因組DNA測序，來獲得全長基因序列。本發(fā)明的圖例中，陳述于SEQ ID NO1，3的多核苷酸在腦膜炎奈瑟氏球菌DNA文庫中公開。
此外，陳述于SEQ ID NO1，3的各DNA序列，包含編碼蛋白質(zhì)的開放閱讀框架，該蛋白質(zhì)具有陳述于SEQ ID NO2，4中的大約氨基酸殘基數(shù)目，并具有推導(dǎo)出的分子量，該分子量可以通過技術(shù)熟練者熟知的氨基酸殘基分子量進(jìn)行計(jì)算。
SEQ ID NO1的多核苷酸，在起始密碼子與終止密碼子之間編碼SEQ ID NO2的多肽，起始密碼子對準(zhǔn)SEQ ID NO1的編碼為1的核苷酸，終止密碼子開始于SEQ ID NO1的編碼為1126的核苷酸。
SEQ ID NO3的多核苷酸，在起始密碼子與終止密碼子之間編碼SEQ ID NO4的多肽，起始密碼子對準(zhǔn)SEQ ID NO3的編碼為1的核苷酸，終止密碼子開始于SEQ ID NO3的編碼為1123的核苷酸。
另一方面，本發(fā)明提供了一種分離出的多核苷酸，該多核苷酸包括或者由下面的多核苷酸序列組成(a)一種多核苷酸序列，該多核苷酸序列與SEQ ID NO1，3就SEQ ID NO1，3全長而言，分別有至少85％同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，甚至更優(yōu)選至少95％的同一性，更優(yōu)選至少97-99％的同一性或者完全同一；或者(b)一種編碼一種多肽的多核苷酸序列，該多肽與SEQ IDNO2，4的氨基酸序列分別在SEQ ID NO2，4全長上有至少85％同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，甚至更優(yōu)選至少95％的同一性，更優(yōu)選至少97-99％的同一性或者100％同一。
可以通過一種方法得到編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，包括其來自腦膜炎奈瑟氏球菌以外物種的同系物和直系同源物，該方法包括以下步驟在嚴(yán)格雜交條件(例如，使用45-65℃的溫度范圍，以及O.1-1％的SDS濃度)下，用包含或者由SEQ ID NO1，3的序列或者其片段組成的標(biāo)記探針或可探測探針篩選合適的文庫；分離包含所述多核苷酸序列的全長基因和/或基因組克隆。
本發(fā)明提供了一種多核苷酸序列，其全長與SEQ ID NO1，3中的編碼序列(開放閱讀框架)同一。本發(fā)明也提供了一段編碼成熟多肽或者其片段的序列本身，以及閱讀框架中有另一段編碼序列，例如編碼前導(dǎo)序列或者分泌序列，前蛋白質(zhì)序列，或原蛋白質(zhì)序列，或前原蛋白質(zhì)序列的序列的編碼成熟多肽或者其片段的編碼序列。本發(fā)明的多核苷酸也包括至少一段非編碼序列，例如包括但并不局限于至少一段5’和3’非編碼序列，象轉(zhuǎn)錄但并不翻譯的序列，終止信號(例如rho-依賴的終止信號和rho-不依賴的終止信號)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，Kozak序列，穩(wěn)定mRNA的序列，內(nèi)含子，以及多腺苷酸化信號。
多核苷酸序列也可以包含編碼額外氨基酸的額外編碼序列。例如，可以編碼一段有助于純化融合多肽的標(biāo)記序列。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，標(biāo)記序列是一段六組氨酸肽，這段六組氨酸肽在pQE載體(Qiagen，Inc.)中有提供，在Gentz等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)86821-824(1989)中有描述，或者是一段HA肽標(biāo)記物(Wilson等，細(xì)胞(Cell)37767(1984))，這兩種標(biāo)記序列都有助于純化與之融合的多肽序列。本發(fā)明的多核苷酸也包括但不局限于，包含結(jié)構(gòu)基因和控制基因表達(dá)的天然結(jié)合序列的多核苷酸。
編碼SEQ ID NO2，4的BASB033多肽的核苷酸序列，可以分別與包含于SEQ ID NO1中1到1125位核苷酸的多肽編碼序列同一；或者包含于SEQ ID NO3中1到1122位核苷酸的多肽編碼序列同一。換句話說，它可以是一段編碼SEQ ID NO2，4的多肽的序列，該序列是遺傳密碼冗余(簡并)的結(jié)果。
此處用的名詞“編碼多肽的多核苷酸”包括編碼本發(fā)明多肽的序列的多核苷酸，尤其是細(xì)菌多肽，最好是在SEQ ID NO2，4中公布了氨基酸序列的腦膜炎奈瑟氏球菌BASB033多肽。該名詞也包括這樣的多肽，該多肽包括編碼多肽的單獨(dú)連續(xù)區(qū)域或者不連續(xù)區(qū)域(例如，被整合相間斷的多核苷酸，整合插入序列，整合載體序列，整合轉(zhuǎn)座子序列，或者由于RNA編輯或基因組DNA重組)，以及也包含編碼和/或非編碼序列的額外區(qū)域。
此外，本發(fā)明涉及此處描述的多核苷酸的變體，它們編碼SEQ IDNO2，4的推導(dǎo)的氨基酸序列多肽的變體。
例如，可以使用本發(fā)明多核苷酸的片段來合成本發(fā)明全長的多核苷酸。
此外，特別優(yōu)選的實(shí)施方案是編碼BASB033變體的多核苷酸，這些變體具有SEQ ID NO2，4的BASB033多肽的氨基酸序列，其中的幾個，少數(shù)，5-10個，1-5個，1-3個，2個，1個氨基酸或沒有氨基酸，以任意組合被置換、修飾，刪除和/或添加。其中特別優(yōu)選的是不改變BASB033多肽的性質(zhì)和活性的隱性置換、刪除和添加。
此外，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案是多核苷酸以及與這些多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，該多核苷酸在其全長上，與編碼在SEQ ID NO2，4中公布了氨基酸序列的BASB033多肽的多核苷酸，有至少85％的同一性。在這點(diǎn)上，在其全長上與上述多核苷酸有至少90％同一性的多核苷酸是特別優(yōu)選的，在這些特別優(yōu)選的多核苷酸中，那些有至少95％同一性的多核苷酸是尤其優(yōu)選的。另外，在那些有至少95％同一性的多核苷酸中，有至少97％同一性的多核苷酸是高度優(yōu)選的，在這些有至少97％同一性的多核苷酸中，有至少98％和至少99％同一性的多核苷酸是特別高度優(yōu)選的，有至少99％同一性的多核苷酸是更首選的。
優(yōu)選的實(shí)施方案是編碼這樣多肽的多核苷酸，該多肽基本上保留了與SEQ ID NO1，3的DNA編碼的成熟多肽相同的生物功能或者活性。
依照本發(fā)明一些優(yōu)選實(shí)施方案，提供的多核苷酸可以與BASB033多核苷酸序列，例如SEQ ID NO1，3中的多核苷酸序列，進(jìn)行雜交，特別是在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交。
此外，本發(fā)明涉及與此處提供的多核苷酸序列雜交的多核苷酸。在這點(diǎn)上，本發(fā)明尤其涉及，在嚴(yán)格條件下與此處描述的多核苷酸雜交的多核苷酸。此處使用的名詞“嚴(yán)格條件”和“嚴(yán)格雜交條件”是指，只有當(dāng)序列之間有至少95％的同一性并且優(yōu)選有97％的同一性時才發(fā)生的雜交。嚴(yán)格雜交條件的一個具體實(shí)例是，在包含下列成分的溶液中42℃孵育過夜50％甲酰胺，5xSSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5x Denhardt溶液，10％硫酸葡聚糖，和20微克/ml經(jīng)剪切的變性鮭魚精子DNA，接著在大約65℃ 0.1xSSC中清洗雜交支持物。雜交和清洗條件是公知的并且在Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Molecular CloningA LaboratoryManual)，第二版，冷泉港，紐約(1989)中示例，特別是在其第11章中。溶液雜交也可使用本發(fā)明提供的多核苷酸序列。
本發(fā)明也提供了包含或由這樣的多核苷酸序列組成的多核苷酸，該多核苷酸序列是通過在嚴(yán)格雜交條件下，用具有所說的在SEQID NO1，3中公布的多核苷酸序列或者其片段的探針篩選適當(dāng)?shù)奈膸斓玫降模撐膸彀赟EQ ID NO1，3中公布的多核苷酸序列的完整基因；并且分離該多核苷酸序列。例如，用于獲得這種多核苷酸的片段包括在本文其他地方充分描述的探針和引物。
例如，正如在本文其他地方描述的關(guān)于本發(fā)明的多核苷酸分析，本發(fā)明的多核苷酸可以用作RNA，cDNA和基因組DNA的雜交探針，以分離編碼BASB033的全長cDNA和基因組克隆，分離與BASB033有高度同一性，尤其是高度序列同一性的其他基因的cDNA和基因組克隆。這種探針通常包含至少15個核苷酸殘基或者堿基對。優(yōu)選地，這種探針包含至少30個核苷酸殘基或者堿基對，并且可以包含至少50個核苷酸殘基或者堿基對。特別優(yōu)選的探針包含至少20個核苷酸殘基或者堿基對，并且具有少于30個核苷酸殘基或者堿基對。
BASB033基因的編碼區(qū)域，可以通過使用SEQ ID NO1，3中提供的DNA來合成一段寡聚核苷酸探針進(jìn)行篩選而分離。具有與本發(fā)明基因互補(bǔ)序列的已標(biāo)記寡核苷酸，然后用于篩選cDNA文庫，基因組DNA或m RNA文庫，以鑒定探針與文庫中的哪個成員雜交。
有幾種本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的和熟知的方法，可用于獲得全長的DNA，或者延伸短的DNA，例如那些基于快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)方法(例如參見，F(xiàn)rohman，等，PNAS USA 858998-9002，1998)獲得的DNA。技術(shù)上新近的修改，例如以MarathonTM技術(shù)(ClontechLaboratories Inc.)作為例子，大大地簡化了對長cDNA的搜索。在MarathonTM技術(shù)中，用從所選組織中提取的mRNA制備cDNA，把“連接物”序列連接到每個末端。接著，使用結(jié)合了基因特異性和連接物特異性的寡聚核苷酸引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增(PCR)，以擴(kuò)增DNA“缺失的”5’末端。然后，使用“嵌套”引物，即設(shè)計(jì)的用于在擴(kuò)增產(chǎn)物中退火的引物(典型的連接物特異引物在連接物序列3’以外退火，基因特異的引物在所選擇基因序列的5’以外退火)，重復(fù)進(jìn)行PCR反應(yīng)。接著，該反應(yīng)的產(chǎn)物可以用DNA測序進(jìn)行分析，通過把產(chǎn)物與已存在的DNA直接連接以產(chǎn)生完整序列，或者通過使用設(shè)計(jì)5’引物的新的序列信息來進(jìn)行單獨(dú)的全長PCR，來構(gòu)建全長DNA。
正如本文關(guān)于多核苷酸分析更進(jìn)一步的討論，本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以用作，例如研究試劑，以及用于發(fā)現(xiàn)疾病，特別是人類疾病的治療和診斷的材料。
本發(fā)明的多核苷酸，即來自SEQ ID NOS1-4序列的寡聚核苷酸，可以用于此處描述的方法中，而且優(yōu)選可以用于PCR中，以確定在被感染組織的細(xì)菌中，此處確定的多核苷酸是否全部或者部分被轉(zhuǎn)錄。我們認(rèn)為，這種序列在感染階段的診斷和病原體造成的感染類型的診斷中也是具有用途的。
本發(fā)明也提供了編碼多肽的多核苷酸，該多肽是成熟的蛋白質(zhì)加額外的氨基端或羧基端氨基酸，或者加成熟多肽內(nèi)部的氨基酸(例如，當(dāng)成熟形式有不止一條多肽鏈時)。這種序列可以在把蛋白質(zhì)從其前體加工成成熟形式中發(fā)揮作用，可以允許蛋白質(zhì)運(yùn)輸，可以增長或者縮短蛋白質(zhì)的半衰期或者可以有利于為分析或生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的操縱，以及其他用途。正如體內(nèi)通常發(fā)生的情況，多余的氨基酸可以被細(xì)胞酶類從成熟蛋白質(zhì)中加工除去。
對本發(fā)明的每一個多核苷酸，提供了與之互補(bǔ)的多核苷酸。優(yōu)選的是這些互補(bǔ)多核苷酸與每一個其與之互補(bǔ)的多核苷酸完全互補(bǔ)。
前體蛋白質(zhì)可以是多肽的非活性形式，它是具有成熟形式的融合了一段或者多段前序列的多肽。當(dāng)前序列被除去，這種非活性前體通常被激活。部分或者全部前序列在激活前可以被除去。通常，這種前體被稱為蛋白原。
除了標(biāo)準(zhǔn)的A，G，C，T/U代表核苷酸以外，術(shù)語“N”也可以用于描述本發(fā)明特定的多核苷酸。“N”意味著，在DNA或者RNA序列中，DNA或者RNA四個核苷酸中的任何一個可以出現(xiàn)在這樣一個指定位置上，除了參與和相鄰核苷酸位置結(jié)合時以外，當(dāng)閱讀正確的閱讀框架時，N優(yōu)選不是可以造成在這種閱讀框架中產(chǎn)生成熟前終止密碼子作用的核苷酸。
總之，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼成熟蛋白質(zhì)，成熟蛋白質(zhì)加前導(dǎo)序列(可以稱為前蛋白質(zhì))，具有一段或者多段前序列的成熟蛋白質(zhì)前體，這種前序列并不是前蛋白質(zhì)的前導(dǎo)序列，或者前蛋白原，它是蛋白原的前體，具有一段前導(dǎo)序列和一段或者多段前序列，這些序列通常在產(chǎn)生多肽的活性和成熟形式的加工步驟中被除去。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了本發(fā)明多核苷酸治療或者預(yù)防目的的用途，尤其是遺傳免疫。
本發(fā)明多核苷酸在遺傳免疫中的使用，優(yōu)選利用合適的遞送方法，例如把質(zhì)粒DNA直接注射到肌肉中(Wolff等，人類分子遺傳學(xué)(Hum Mol Genet)(1992)1363，Manthorpe等，Hum Gene Ther.(1983)4419)，遞送與特定蛋白質(zhì)載體結(jié)合的DNA(Wu等，生物化學(xué)雜志(J.Biol Chem.)(1989)26416985)，DNA與硫酸鈣共沉淀(Benvenisy & Reshef，PNAS USA，(1986)839551)，把DNA封裝到各種形式的脂質(zhì)體中(Kaneda等，科學(xué)(Science)(1989)243375)，粒子轟擊(Tang等，自然(Nature)(1992)356152，Eisenbraun等，DNA細(xì)胞生物學(xué)(DNA Cell Biol)(1993)12791)和使用克隆的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在體內(nèi)感染(Seeger等，PNAS USA(1984)815849)。
載體，宿主細(xì)胞，表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明一種或幾種多核苷酸的載體，用本發(fā)明載體遺傳工程操縱的宿主細(xì)胞，以及通過重組技術(shù)制備本發(fā)明多肽。使用來自本發(fā)明DNA構(gòu)建體的RNA，也可以利用無細(xì)胞翻譯體系生產(chǎn)這種蛋白質(zhì)。
可以從包含表達(dá)系統(tǒng)的遺傳工程操縱的宿主細(xì)胞，通過本領(lǐng)域技術(shù)熟練者熟知的方法制備本發(fā)明的重組多肽。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明一種或幾種多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)，涉及用這些表達(dá)系統(tǒng)遺傳工程操縱的宿主細(xì)胞，以及涉及通過重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
對于本發(fā)明多肽的重組生產(chǎn)，對宿主細(xì)胞可以經(jīng)遺傳工程操作插入表達(dá)系統(tǒng)或者其部分或者本發(fā)明的多核苷酸一起進(jìn)行遺傳操作。把多核苷酸引入宿主細(xì)胞可以通過許多在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊中敘述的方法進(jìn)行，例如Davis等，分子生物學(xué)基礎(chǔ)方法(BASIC METHODS INMOLECULAR BIOLOGY)，(1986)和Sambrook，等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL)，第二版；冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，冷泉港，紐約(1989)，例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)位，微注射，陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)柒，電穿孔，轉(zhuǎn)導(dǎo)，刮擦裝載，彈道介入和感染。
適當(dāng)宿主的代表性實(shí)例包括細(xì)菌細(xì)胞，例如鏈球菌細(xì)胞，葡萄球菌細(xì)胞，腸道球菌細(xì)胞，大腸桿菌細(xì)胞，鏈霉菌細(xì)胞，藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞，枯草芽孢桿菌細(xì)胞，粘膜炎莫拉氏菌細(xì)胞，流感嗜血桿菌細(xì)胞以及腦膜炎奈瑟氏球菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞，克魯維酵母菌細(xì)胞，釀酒酵母細(xì)胞，擔(dān)子菌細(xì)胞，白色念珠菌細(xì)胞以及曲霉菌細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞，例如果蠅S2細(xì)胞和斜紋夜蛾Sf9細(xì)胞；動物細(xì)胞，例如CHO，COS，Hela，C127，3T3，BHK，293，CV-1和Bowes黑素瘤細(xì)胞；植物細(xì)胞，例如裸子植物細(xì)胞或被子植物細(xì)胞。
可以使用各種各樣的表達(dá)體系制備本發(fā)明的多肽。這樣的載體其中包括，染色體來源的載體，游離體來源的載體和病毒來源的載體，例如來源于細(xì)菌質(zhì)粒的載體，來源于噬菌體的載體，來源于轉(zhuǎn)座子的載體，來源于酵母游離體的載體，來源于插入元件的載體，來源于酵母染色體元件的載體，來源于病毒的載體，象是桿狀病毒，乳多空病毒，象是SV40，痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒，假狂犬病病毒，細(xì)小核糖核酸病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒和甲病毒，以及其結(jié)合來源的載體，例如來自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的的載體，象是粘粒和噬菌粒。表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建體可以包含調(diào)節(jié)以及引起表達(dá)的控制區(qū)域。通常來說，在宿主中可以適當(dāng)維持、繁殖或者表達(dá)多核苷酸和/或表達(dá)多肽的任何系統(tǒng)或者載體，在這點(diǎn)上都可以用于表達(dá)。使用各種各樣已知的和常規(guī)的技術(shù)，例如象是公布在Sambrook，等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(MOLECULARCLONING，A LABORATORY MANUAL)，(見前)中的技術(shù)，可以把合適的DNA序列插入到表達(dá)體系中。
在真核細(xì)胞重組表達(dá)系統(tǒng)中，為了把翻譯出的蛋白質(zhì)分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中，分泌到周質(zhì)間隙或者細(xì)胞外環(huán)境中，可以把適當(dāng)?shù)姆置谛盘柌迦氲奖磉_(dá)多肽上。這些信號對于該多肽可以是內(nèi)源的或者它們也可以是異源的信號。
本發(fā)明多肽，可以用熟知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)中回收和純化，這些方法包括硫酸銨沉淀或者乙醇沉淀，酸提取，陰離子或者陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石層析和凝集素層析。最優(yōu)選的是用金屬離子親和層析(IMAC)進(jìn)行純化。當(dāng)多肽在細(xì)胞內(nèi)合成、分離和/或純化中變性時，用于蛋白質(zhì)再折疊的熟知技術(shù)可以用于再生活性構(gòu)象。
表達(dá)系統(tǒng)也可以是一種活的重組微生物，例如病毒或者細(xì)菌。感興趣的基因可以被插入到活的重組病毒或者細(xì)菌的基因組中。用這種活的載體進(jìn)行接種或者體內(nèi)感染，將導(dǎo)致在體內(nèi)表達(dá)抗原并且誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。例如，用于這一目的的病毒或者細(xì)菌有痘病毒(例如，痘苗病毒，禽痘病毒，金絲雀痘病毒)，甲病毒(Sindbis病毒，SemlikiForest病毒，Venezuelian Equine Encephalitis病毒)，腺病毒，腺伴隨病毒，細(xì)小核糖核酸病毒(脊髓灰質(zhì)炎病毒，鼻病毒)，皰疹病毒(水痘帶狀皰疹病毒等)，李斯特菌，沙門氏菌，志賀菌，奈瑟球菌，卡介苗。這些病毒和細(xì)菌可以是有毒性的，或者是為了獲得活疫苗的各種方法減毒的。這些活的疫苗構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。
診斷，預(yù)測，血清型和突變分析本發(fā)明也涉及把本發(fā)明BASB033多核苷酸和多肽作為診斷試劑的用途。真核細(xì)胞中，特別是哺乳動物中，尤其是人體中，BASB033多核苷酸和/或多肽的檢測，提供了一種診斷方法來診斷這種疾病，診斷疾病病期或者診斷感染生物體對藥劑的反應(yīng)。可以用各種各樣熟知的技術(shù)以及此處提供的方法，可以在核酸或者氨基酸水平上診斷真核細(xì)胞，特別是哺乳動物，尤其是人體，特別是那些被包含BASB033基因或者蛋白質(zhì)的生物體感染了或者懷疑被其感染了的那些。
用于預(yù)測、診斷或者其他分析的多肽和多核苷酸，可以從推定被感染了的和/或已經(jīng)被感染了的個體身體材料中獲取。這些來源的多核苷酸，特別是DNA或RNA，可以直接用于檢測或者可以在分析之前先用PCR或其他擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行酶促擴(kuò)增。RNA，尤其是mRNA，cDNA和基因組DNA也可以用同樣的方式使用。使用擴(kuò)增，通過分析生物所選多核苷酸的基因型，可以獲得出現(xiàn)在個體中的感染生物體或者常駐生物體的物種和菌株的表征。通過改變擴(kuò)增產(chǎn)物的大小可以檢測出缺失或者插入，這種擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是相對于相關(guān)生物體的，優(yōu)選同屬不同種的或者是同種不同株的生物的，所選對照序列的基因型來說的。通過擴(kuò)增的DNA與標(biāo)記BASB033多核苷酸序列的雜交，可以鑒定點(diǎn)突變。對于DNA或者RNA，分別用DNase或者RNase酶解，或者通過檢測熔融溫度或復(fù)性動力學(xué)差異，可以把完美匹配或者較好匹配的序列與不是完美匹配或者更顯著錯配的雙鏈區(qū)分開來。也可以通過比較多核苷酸片段與對照序列在凝膠中電泳遷移率的變化，來檢測多核苷酸序列的差別。這可以通過使用變性試劑進(jìn)行，或者也可以不使用變性試劑進(jìn)行。多核苷酸的差別也可以通過直接DNA或者RNA測序來檢測。例如參見Myers等，Scierce，2301242(1985)。在特殊位置的序列改變，也可以通過核酸酶保護(hù)分析來揭示，例如RNase，V1和S1保護(hù)分析，或者化學(xué)裂解方法。例如參見，Cotton等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，854397-4401(1985)。
在另一個實(shí)施方案中，可以構(gòu)建一種包含BASB033核苷酸序列或者其片段的寡聚核苷酸探針的排列，以便對例如遺傳突變、血清型、分類學(xué)分類或者鑒定進(jìn)行有效的篩選。排列技術(shù)的方法是熟知的，有廣泛的適用性，可用于處理分子遺傳學(xué)的包括基因表達(dá)、遺傳連鎖和遺傳多樣性的各種各樣的問題(例如參見，Chee等，Science，274610(1996))。
因此，在另一方面，本發(fā)明涉及一種診斷試劑盒，它包括(a)一種本發(fā)明的多核苷酸，優(yōu)選SEQ ID NO1，3的核酸序列或者其片段；(b)與(a)的多核酸序列互補(bǔ)的多核酸序列；(c)一種本發(fā)明的多肽，優(yōu)選SEQ ID NO2，4的多肽或者其片段；或者(d)一種抗本發(fā)明多肽的抗體，優(yōu)選抗SEQ ID NO2，4的多肽的抗體。
應(yīng)當(dāng)意識到，在任何這樣的試劑盒中，(a)，(b)，(c)或者(d)可以包含一種基本組分。這樣的試劑盒可用于其中包括診斷疾病或者診斷疾病的易感性。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明多核苷酸作為診斷試劑的用途。本發(fā)明多核苷酸突變型，優(yōu)選SEQ ID NO1，3的突變型，是與疾病或者致病性相關(guān)聯(lián)的，對于這種突變型的檢測提供了一種診斷工具，它可以增加或者確定由于多核苷酸不足表達(dá)、過量表達(dá)或者變化的表達(dá)引起的疾病的診斷、疾病過程預(yù)測、疾病階段確定、或者疾病易感性。攜帶有這種多核苷酸的突變的生物體，尤其是傳染性生物體，可以通過各種技術(shù)在多核苷酸水平上檢測，例如在本文其他地方描述的技術(shù)。
攜帶有本發(fā)明多核苷酸和/或多肽的突變或者多態(tài)性(等位基因變體)的生物體的細(xì)胞，也可以通過各種技術(shù)在多核苷酸水平或者多肽水平上檢測，例如使用于血清型。例如，RT-PCR可用于檢測RNA突變。結(jié)合象GeneScan這樣的自動監(jiān)測系統(tǒng)使用RT-PCR是特別優(yōu)選的。RNA，cDNA或者基因組DNA也可用于同樣的目的，PCR。作為例子，與編碼BASB033多肽的多核苷酸互補(bǔ)的PCR引物可以用來鑒定和分析突變。
此外，本發(fā)明提供了從5’端和/或3’端去掉1，2，3或4個核苷酸的引物。這些引物可以用于擴(kuò)增從個體樣本中，例如身體材料中，分離出的BASB033 DNA和/或RNA，以及其他用途。這些引物可以用于擴(kuò)增從受感染個體中分離出的多核苷酸，以至于這些多核苷酸可以接著適用于各種闡明多核苷酸序列的技術(shù)。以這種方式，可以檢測多核苷酸序列中的突變，并且可以使用這些多核苷酸序列中的突變來診斷和/或預(yù)測感染或者感染的階段或過程，或者血清型和/或分類感染物質(zhì)。
此外，本發(fā)明提供了一種診斷疾病的方法，優(yōu)選診斷細(xì)菌感染，更優(yōu)選診斷由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的感染，該方法包括測定個體樣品中，例如身體材料中，具有SEQ ID NO1，3序列的多核苷酸增高的表達(dá)水平。BASB033多核苷酸增加的或者降低的表達(dá)，可以使用本領(lǐng)域熟知的多核苷酸定量測定方法進(jìn)行測定，例如，擴(kuò)增，PCR，RT-PCR，RNase保護(hù)，Northern印跡，光譜測定法和其他雜交方法。
另外，一種依照本發(fā)明的用于檢測BASB033多肽相對于正?？刂平M織樣品過量表達(dá)的診斷分析，可以用于例如檢測感染的存在。用于確定身體材料這樣的宿主樣品中BASB033多肽水平的分析技術(shù)，對于本領(lǐng)域技術(shù)熟練者是熟知的。這種分析方法包括放射免疫分析，競爭性結(jié)合分析，Western印跡分析，抗體夾層分析，抗體檢測和ELISA測定。
本發(fā)明的多核苷酸可以用作多核苷酸排列的組分，優(yōu)選高密度排列或者網(wǎng)格。這些高密度排列用于診斷和預(yù)測特別有效。例如，各自包含不同基因的，此外包含本發(fā)明多核苷酸的一系列點(diǎn)，可以用于探測，例如使用雜交或者核酸擴(kuò)增，使用從身體樣品獲得的探針，來確定在個體中特殊多核苷酸序列或者相關(guān)序列的存在。這種存在可以表明病原體的存在，特別是腦膜炎奈瑟氏球菌的存在，并且在診斷和/或預(yù)測疾病或疾病過程中是有用的。包含大量SEQ ID NO1，3的多核苷酸序列的變體的載網(wǎng)是優(yōu)選的。包含大量編碼SEQ ID NO2，4多肽序列的多核苷酸序列的變體的載網(wǎng)也是優(yōu)選的。
抗體本發(fā)明的多肽和多核苷酸或者其變體，或者表達(dá)它們的細(xì)胞，可以作為免疫原以產(chǎn)生分別對這些多肽或者多核苷酸具有免疫特異的抗體。
在本發(fā)明特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了抗BASB033多肽或者多核苷酸的抗體。
產(chǎn)生的抗本發(fā)明多肽或者多核苷酸的抗體，可以對動物，優(yōu)選不是人類，使用常規(guī)方案，施用本發(fā)明多肽和/或多核苷酸，或者其一或兩者的帶有抗原決定簇的片段，其一或兩者的類似物，或者表達(dá)其一或兩者的細(xì)胞，而獲得。為了制備單克隆抗體，任何本領(lǐng)域公知的通過連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)抗體的技術(shù)都是可以使用的。實(shí)例包括各種技術(shù)，例如Kohler，G.和Milstein，C.，Nature 256495-497(1975)；Kozbor等，今日免疫學(xué)(Immunology Today)472(1983)；Cole等，pg.77-96，單克隆抗體和癌癥治療(MONOCLONAL ANTIBODIES ANDCANCER THERAPY)，Alan R.Liss，Inc.(1985)中的那些技術(shù)。
生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利No.4,946,778)適合生產(chǎn)針對本發(fā)明多肽或者多核苷酸的單鏈抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠，或者其他生物或動物，例如其他哺乳動物，也可以用于表達(dá)對本發(fā)明多肽或者多核苷酸有免疫特異性的人源化抗體。
另一種選擇，從篩選出的包含抗-BASB033的PCR擴(kuò)增的人體淋巴細(xì)胞v-基因庫中，或者從天然文庫中，可以使用噬菌體展示技術(shù)選擇對本發(fā)明多肽有結(jié)合活性的抗體基因(McCafferty，等，(1990)，Nature 348，552-554；Marks，等，(1992)生物技術(shù)(Biotechnology)10，779-783)。可以增進(jìn)這些抗體的親和性，例如，通過鏈改組(Clackson等，(1991)Nature 352628)。
上述抗體可以用于分離或者鑒定表達(dá)本發(fā)明多肽或者多核苷酸的克隆，用于純化多肽或者多核苷酸，例如，使用親和層析。
因此，抗BASB033-多肽或者BASB033-多核苷酸的抗體，可以用于治療感染，尤其是細(xì)菌感染，以及其他用途。
多肽變體包括抗原等價的、抗原決定簇等價的或者免疫等價的變體，這組成了本發(fā)明的一個特殊方面。
改變抗體或者其變體，使其在個體中免疫原性更低是優(yōu)選的。例如，如果個體是人類，則抗體最優(yōu)選被“人源化”，該互補(bǔ)決定區(qū)或雜交瘤來源抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)已經(jīng)被移植到人類單克隆抗體中，正如在Jones等，(1986)，Nature 321，522-525或者Tempest等，(1991)生物技術(shù)(Biotechnology)9，266-273中描述的。
拮抗劑和激動劑-分析和分子本發(fā)明多肽和多核苷酸也可以用于確定小分子底物和配體的結(jié)合，例如在細(xì)胞中，在無細(xì)胞制劑中，化學(xué)庫中，以及天然產(chǎn)物混合物中。這些底物和配體可以是天然底物和配體，也可以是結(jié)構(gòu)或者功能模擬物。參見，例如，Coligan等，免疫學(xué)常規(guī)方法(CurrentProtocols in Immunology)1(2)第5章(1991)。
通過把標(biāo)記直接或者間接地連接到候選化合物上，篩選方法可以簡單地測定候選化合物與多肽或者多核苷酸的結(jié)合，或者與攜帶有多肽或者多核苷酸的細(xì)胞或膜的結(jié)合，或者與多肽的融合蛋白質(zhì)的結(jié)合。另一方面，篩選方法可能涉及與標(biāo)記競爭物的競爭。此外，使用對包含多肽或者多核苷酸的細(xì)胞合適的檢測系統(tǒng)，這些篩選方法就可以檢測，是否候選化合物導(dǎo)致了通過激活或者抑制多肽或者多核苷酸而產(chǎn)生信號。通常在存在已知激動劑的情況下分析激活抑制劑，并且觀察候選化合物的存在對于激動劑激活的作用。構(gòu)成型活性多肽和/或構(gòu)成型表達(dá)多肽和多核苷酸，可用在針對相反激動劑或抑制劑的篩選方法中，當(dāng)不存在激動劑或抑制劑時，檢測是否候選化合物導(dǎo)致了對多肽或者多核苷酸激活的抑制，視具體情況而定。此外，篩選方法可以簡單的包括以下步驟把候選化合物與包含本發(fā)明多肽或者多核苷酸的溶液混合形成一種混合物，測定混合物中的BASB033多肽和/或多核苷酸的活性，以及把該混合物的BASBOSS多肽和/或多核苷酸活性與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。融合蛋白質(zhì)，例如那些由Fc部分與BASB033多肽制得的融合蛋白質(zhì)，如前所述，也可以用于高容量篩選分析，這種篩選分析可以用于鑒定本發(fā)明多肽的拮抗劑，以及鑒定系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)多肽和/或功能相關(guān)多肽的拮抗劑(參見D.Bennett等，分子識別雜志(J Mol Recognition)，852-58(1995)；和K.Johanson等，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)，270(16)9459-9471(1995))。
多核苷酸，多肽以及與本發(fā)明多肽結(jié)合和/或相互作用的抗體，也可以用于配置篩選方法，該篩選方法是用于檢測加入的化合物對于細(xì)胞內(nèi)mRNA和/或多肽產(chǎn)生的作用。例如，根據(jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，使用單克隆或者多克隆抗體，可以構(gòu)建ELISA測定來測定多肽的分泌水平或者細(xì)胞結(jié)合水平。這可以用于發(fā)現(xiàn)這樣的物質(zhì)，這種物質(zhì)可以抑制或者增強(qiáng)適當(dāng)操作的細(xì)胞或者組織中的多肽的產(chǎn)生(也分別稱作拮抗劑或者激動劑)。
本發(fā)明也提供篩選化合物的方法，以用于鑒定那些增強(qiáng)(激動劑)或者阻斷(拮抗劑)BASB033多肽或者多核苷酸的作用的化合物，特別是那些抑制菌的和/或殺菌的化合物。該篩選方法可以涉及高流通量技術(shù)。例如，為了篩選激動劑或者拮抗劑，在可能是BASB033激動劑或者拮抗劑的候選分子存在或者不存在的情況下，把包含BASB033多肽的合成反應(yīng)混合物，細(xì)胞區(qū)室，例如膜，細(xì)胞質(zhì)膜或者細(xì)胞壁，或者它們的制劑，與這種多肽的標(biāo)記底物或者配體共同孵育。標(biāo)記配體結(jié)合的減少，或者這種底物的產(chǎn)物產(chǎn)量的減少，反映了候選分子促進(jìn)或者拮抗BASB033多肽的能力。義務(wù)結(jié)合的分子，即，無需誘導(dǎo)BASB033多肽的效應(yīng)，很可能是好的拮抗劑。結(jié)合較好的分子，視具體情況而定，也增加從底物到產(chǎn)物的產(chǎn)率，增加信號傳導(dǎo)或者增強(qiáng)化學(xué)通道活性，這種分子是激動劑。通過使用報(bào)告基因系統(tǒng)，視具體情況而定，可以增強(qiáng)從底物到產(chǎn)物的產(chǎn)量，信號傳導(dǎo)，或者化學(xué)通道活性的比率或者水平的檢測。在這點(diǎn)上有效的報(bào)告基因系統(tǒng)，包括但不局限于轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的顯色的標(biāo)記底物，對BASB033多核苷酸和/或多肽的活性改變有反應(yīng)的報(bào)告基因，以及本領(lǐng)域已知的結(jié)合分析。
分析BASB033激動劑的另一個實(shí)例是一種競爭性分析，該分析在競爭性抑制分析的合適條件下，把BASB033和一種潛在的激動劑與下列分子結(jié)合BASB033結(jié)合分子，重組BASB033結(jié)合分子，天然底物或者配體，或者底物或者配體模擬物?？梢詷?biāo)記BASB033，例如用放射活性的或者顯色的化合物標(biāo)記，于是可以準(zhǔn)確的確定結(jié)合到結(jié)合分子上的或者轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的BASB033分子的數(shù)目，從而確定潛在拮抗劑的有效性。
潛在的拮抗劑，其中包括，結(jié)合到本發(fā)明多核苷酸和/或多肽上并從而抑制或者壓制其活性或者表達(dá)的小有機(jī)分子，肽，多肽和抗體。潛在的拮抗劑也可以是小有機(jī)分子，肽，多肽，例如在結(jié)合分子上結(jié)合相同位點(diǎn)的緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)或者抗體，例如結(jié)合分子，該分子不引起B(yǎng)ASB033誘導(dǎo)的活性，它通過排斥BASB033多肽和/或多核苷酸的結(jié)合，從而阻止BASB033多肽和/或多核苷酸的活性或者表達(dá)。
潛在的拮抗劑包括一種小分子，該小分子結(jié)合或者占據(jù)了多肽的結(jié)合位點(diǎn)，因而阻止了與細(xì)胞結(jié)合分子的結(jié)合，于是阻止了正常的生物活性。小分子的實(shí)例包括但不局限于小有機(jī)分子，肽或者肽類似分子。其他潛在的拮抗劑包括反義分子(參見Okano，J.Neurochem，56560(1991)；作為基因表達(dá)的反義抑制劑的寡脫氧核苷酸(OLIGODEOXYNUCLEOOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENEEXPRESSION)，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1998)，有對這些分子的描述)。優(yōu)選的潛在拮抗劑包括與BASB033相關(guān)的化合物和BASB033變體。
另一方面，本發(fā)明涉及遺傳工程設(shè)計(jì)的包含本發(fā)明多肽或者其片段的可溶性融合蛋白，以及各種免疫球蛋白亞類(IgG，IgM，IgA，IgE)重鏈或者輕鏈恒定區(qū)的各部分。優(yōu)選的免疫球蛋白是人類IgG的重鏈恒定部分，特別是IgG1的重鏈恒定部分，融合發(fā)生在鉸鏈區(qū)。在一個特殊的實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分可以通過結(jié)合一段切割序列而簡單地除去，這段切割序列可以被血液凝結(jié)因子Xa切開。另外，本發(fā)明涉及通過遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，以及其在藥物篩選、診斷和治療中的用途。本發(fā)明更深層的方面也涉及編碼這些融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白質(zhì)技術(shù)的實(shí)例可以在國際專利申請WO94/29458和WO94/22914中找到。
此處提供的每一條多核苷酸序列都可以用于發(fā)現(xiàn)和開發(fā)抗細(xì)菌化合物。編碼的蛋白質(zhì)，一經(jīng)表達(dá)，都可以用作篩選抗細(xì)菌藥物的目標(biāo)對象。另外，編碼編碼蛋白質(zhì)氨基端區(qū)域的多核苷酸序列，或者相應(yīng)mRNA的Shine-Delgarno序列或其他促進(jìn)翻譯的序列，可用于構(gòu)建反義鏈，該反義鏈可以控制感興趣的編碼序列的表達(dá)。
本發(fā)明也提供了本發(fā)明的多肽、多核苷酸、激動劑或者拮抗劑的用途，該用途是干擾病原體與真核的，優(yōu)選哺乳動物的，具有感染后遺癥的宿主之間原始的物理相互作用。尤其是，本發(fā)明的分子也可以用于阻止細(xì)菌，特別是革蘭氏陽性菌和/或革蘭氏陰性菌，與埋植裝置上的真核的，優(yōu)選哺乳動物的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)之間的粘附，或者與傷口上的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)之間的粘附；阻止真核的，優(yōu)選哺乳動物的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)與介導(dǎo)組織損傷的細(xì)菌BASB033蛋白質(zhì)之間的細(xì)菌粘附，和/或；阻止感染發(fā)病機(jī)理的正常進(jìn)展，這種進(jìn)展不是由植入埋植裝置或者其他手術(shù)技術(shù)引起的。
依據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了BASB033激動劑和拮抗劑，優(yōu)選是抑菌的和/或殺菌的激動劑或者拮抗劑。
本發(fā)明的激動劑和拮抗劑，可以用于例如防止、抑制和/或治療疾病。
另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明多肽的模擬型(mimotope)。模擬型是一段與天然多肽(序列上或者結(jié)構(gòu)上)十分相似的多肽序列，它能夠被可以識別天然多肽的抗體識別；或者當(dāng)與合適的載體偶聯(lián)時，它能夠產(chǎn)生可以識別天然多肽的抗體。
為了特殊的目的，可以通過添加、缺失或者置換所選的氨基酸來設(shè)計(jì)多肽模擬型。因此，可以為了易于同蛋白質(zhì)載體結(jié)合的目的而修飾多肽。例如，用一些化學(xué)結(jié)合方法來包含一個末端半胱氨酸是值得做的。另外，在結(jié)合到載體蛋白質(zhì)上的多肽的結(jié)合端遠(yuǎn)端，結(jié)合一段疏水末端也是值得做的，于是多肽游離的未結(jié)合末端保持與載體蛋白質(zhì)的表面結(jié)合。因此，提供了這種多肽，該多肽的構(gòu)象與上下文中出現(xiàn)的多肽的整個天然分子的構(gòu)象非常相似。例如，可以改變多肽，使其具有N-末端半胱氨酸和C-末端疏水酰胺化尾部。另一種選擇，可以進(jìn)行一個或幾個氨基酸的D-立體異構(gòu)體形式的添加或取代來產(chǎn)生有益的衍生物，例如來提高肽的穩(wěn)定性。
另一種選擇，可以利用本身能結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體，使用例如噬菌體展示技術(shù)(EP0 552 267 B1)的技術(shù)來鑒定多肽模擬型。該技術(shù)可以產(chǎn)生大量模擬天然多肽結(jié)構(gòu)的多肽序列，因此，該多肽序列能夠與抗天然多肽的抗體結(jié)合，但是該多肽本身可以不必要與天然多肽有顯著的序列同源性。
疫苗本發(fā)明的另一方面涉及一種方法，該方法可以在個體中，特別是哺乳動物，優(yōu)選在人體中，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，該方法包括給個體接種足夠引起抗體和/或T細(xì)胞免疫反應(yīng)的BASB033多核苷酸和/或多肽，或者其片斷或其變體，引起的抗體和/或T細(xì)胞免疫反應(yīng)可以保護(hù)該個體免于感染，特別是細(xì)菌感染，尤其是腦膜炎奈瑟氏球菌感染。由此，也提供了這樣的方法，這種免疫反應(yīng)減慢細(xì)菌的復(fù)制。然而，本發(fā)明的另一方面涉及一種方法，該方法可以在個體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，該方法包括傳遞給該個體一種核酸載體，指導(dǎo)BASB033多核苷酸和/或多肽或者其片斷或變體表達(dá)的序列或者核酶，為了在體內(nèi)表達(dá)BASB033多核苷酸和/或多肽或者其片斷或變體，以便誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，例如，產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞免疫反應(yīng)，例如包括產(chǎn)細(xì)胞因子T細(xì)胞或者細(xì)胞毒性T細(xì)胞，該免疫反應(yīng)可以保護(hù)所說的個體，優(yōu)選人體免于疾病，無論該疾病是否已經(jīng)存在于該個體中。施用基因的一個實(shí)例是，將其作為微粒的包被或類似物，促進(jìn)其進(jìn)入目的細(xì)胞。這種核酸載體可以包括DNA，RNA，核酶，經(jīng)修飾的核酸，DNA/RNA雜交體，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物或者RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。
本發(fā)明另一方面涉及一種免疫組合物，該組合物能夠在個體中引起免疫反應(yīng)，當(dāng)該組合物被引入個體，特別是人體中時，它便在該個體中引起針對BASB033多核苷酸和/或其編碼的多肽的免疫反應(yīng)，其中，該組合物包括重組的BASB033多核苷酸和/或其編碼的多肽，和/或包括編碼和表達(dá)所說的BASB033多核苷酸、其編碼的多肽或者本發(fā)明的其它多肽的抗原的DNA和/或RNA。免疫反應(yīng)可以用于治療和預(yù)防，免疫反應(yīng)的形式有抗體免疫和/或細(xì)胞免疫，例如CTL或者CD4＋T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞免疫。
BASB033多肽或者其片斷，可以與輔蛋白質(zhì)或者化學(xué)部分融合，這種輔蛋白質(zhì)或者化學(xué)部分可以或者不可以自身產(chǎn)生抗體，但是能夠穩(wěn)定第一蛋白質(zhì)，并且能夠產(chǎn)生融合的或者修飾的蛋白質(zhì)，而后者具有抗原和/或免疫原特性，以及優(yōu)選保護(hù)特性。因此，融合重組蛋白質(zhì)，優(yōu)選還包含一種抗原輔蛋白質(zhì)，例如來自流感嗜血桿菌的脂蛋白D，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或者β-半乳糖苷酶，或者其他相關(guān)的穩(wěn)定蛋白質(zhì)并且有利于其制備和純化的大的輔蛋白質(zhì)。另外，在給接受該蛋白質(zhì)的有機(jī)體的免疫系統(tǒng)提供普遍性刺激方面，輔蛋白質(zhì)可以作為佐劑。輔蛋白質(zhì)可以結(jié)合在第一蛋白質(zhì)的氨基-或者羧基-末端。
本發(fā)明提供了組合物，特別是疫苗組合物，以及包含本發(fā)明多肽和/或多核苷酸和免疫刺激DNA序列的方法，例如在Sato，Y.等，Science 273352(1996)中描述的。
本發(fā)明也提供了這樣的方法，該方法在遺傳免疫試驗(yàn)里使用的多核苷酸構(gòu)建體中使用所述的多核苷酸或者其特殊片斷，該多核苷酸或者其特殊片斷已表明是編碼細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白質(zhì)不變區(qū)的，而該遺傳免疫試驗(yàn)是在感染了腦膜炎奈瑟氏球菌的動物模型中進(jìn)行的。這種試驗(yàn)特別有助于鑒定能夠引起預(yù)防或者治療免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)抗原決定簇。相信，該方法允許隨后制備有特殊價值的單克隆抗體，該抗體得自成功抵抗感染或者完全沒有被感染的動物的必需器官，該抗體的特殊價值在于開發(fā)哺乳動物，特別是人體中細(xì)菌感染，特別是腦膜炎奈瑟氏球菌感染的預(yù)防試劑或者治療療法。
本發(fā)明也包括疫苗制劑，該疫苗制劑包含一種與適當(dāng)載體，例如藥物接受載體組合的本發(fā)明免疫原性重組多肽和/或多核苷酸。因?yàn)槎嚯暮投嗪塑账峥梢栽谖钢薪到?，所以它們?yōu)選進(jìn)行腸胃外用藥，例如包括皮下用藥、肌肉內(nèi)用藥、靜脈內(nèi)用藥或者皮內(nèi)用藥。適合腸胃外用藥的制劑包括，水性的和非水性的無菌注射溶液，該溶液可以包含抗氧化劑、緩沖液、抑制細(xì)菌化合物和溶質(zhì)，該溶質(zhì)使得制劑與個體的體液，特別是血液等滲；以及水性的和非水性的無菌懸浮液，該懸浮液可以包含懸浮劑或者增稠劑。制劑可以存放于單位劑量容器或者多劑量容器中，例如封裝的安瓿和小瓶，也可以在冷凍干燥情況下貯存，只是在使用前需要另外的無菌液體載體。
本發(fā)明疫苗制劑也可以包含用于增強(qiáng)制劑免疫原性的佐劑系統(tǒng)。優(yōu)選的佐劑系統(tǒng)優(yōu)先引起TH1型反應(yīng)。
免疫反應(yīng)可以在廣義上分為兩種極端的類型，即體液免疫反應(yīng)或者細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(其傳統(tǒng)特征分別是抗體和保護(hù)的細(xì)胞效應(yīng)物機(jī)制)。這些反應(yīng)類型被稱作TH1-型反應(yīng)(細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng))，和TH2-型免疫反應(yīng)(體液反應(yīng))。
極端TH1-型免疫反應(yīng)的特征是，產(chǎn)生抗原特異的單倍型限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，以及產(chǎn)生天然殺傷細(xì)胞反應(yīng)。在小鼠中，TH1-型免疫反應(yīng)的經(jīng)常特征是，產(chǎn)生IgG2a亞型抗體，該抗體相應(yīng)于人體中的IgG1型抗體。TH2-型免疫反應(yīng)的特征是，產(chǎn)生廣譜的免疫球蛋白同種型，包括小鼠的IgGI，IgA和IgM。
可以認(rèn)為，開發(fā)這兩種類型的免疫反應(yīng)背后的驅(qū)動力是細(xì)胞因子。TH1-型細(xì)胞因子的高水平，有助于促進(jìn)針對所給抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)，同時，TH2-型細(xì)胞因子的高水平，有助于促進(jìn)針對所給抗原的體液免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)。
TH1-型和TH2-型免疫反應(yīng)的區(qū)別不是絕對的。實(shí)際上，個體會維持一種免疫反應(yīng)，該反應(yīng)被描述為TH1占優(yōu)勢或者TH2占優(yōu)勢。然而，按照Mosmann和Coffman在鼠類CD4＋ve細(xì)胞克隆中所描述的那樣考慮細(xì)胞因子家族，通常是很合適的(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2細(xì)胞導(dǎo)致不同功能性質(zhì)的淋巴因子分泌的不同模式(TH1 and TH2 cellsdifferent patterns of lymphokinesecretion lead to different functional properties).免疫學(xué)年鑒(Annual Review of Immunology)，7，p145-173)。TH1-型反應(yīng)傳統(tǒng)上是與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ細(xì)胞因子和IL-2細(xì)胞因子聯(lián)系在一起的。經(jīng)常直接與誘導(dǎo)TH1-型免疫反應(yīng)相聯(lián)系的其他細(xì)胞因子，例如IL-12，不是由T-細(xì)胞產(chǎn)生的。相反的，TH2-型免疫反應(yīng)是與IL-4，IL-5，IL-6和IL-13的分泌相聯(lián)系的。
已知特定的疫苗佐劑特別適合于刺激TH1或者TH2-型細(xì)胞因子反應(yīng)。傳統(tǒng)上，接種或者感染之后的免疫反應(yīng)中的TH1TH2平衡最好的指標(biāo)包括，在用抗原再次刺激之后在體外直接測定T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的TH1或者TH2-型細(xì)胞因子，和/或測定抗原特異性抗體反應(yīng)的IgG1IgG2a的比率。
因此，TH1-型佐劑可以在體外用抗原再次刺激時，優(yōu)先刺激分離出的T細(xì)胞群體產(chǎn)生高水平的TH1-型細(xì)胞因子，并且可以促進(jìn)與TH1-型同種型相關(guān)的CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的發(fā)育和抗原特異的免疫球蛋白反應(yīng)的發(fā)生。
能夠優(yōu)先刺激TH1細(xì)胞反應(yīng)的佐劑，在國際專利申請.WO94/00153和WO95/17209中有描述。
3De-O-?；瘑瘟柞Ｖ珹(3D-MPL)是一種這樣的佐劑。這在GB2220211(Ribi)中可知。在化學(xué)上，它是一種具有4，5或6?；湹?De-O-?；瘑瘟柞Ｖ珹的混合物，是Ribi Immunochem，Montana生產(chǎn)的。3De-O-?；瘑瘟柞Ｖ珹的優(yōu)選形式在歐洲專利0 689 454 B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)中有描述。
優(yōu)選地，3D-MPL粒子應(yīng)當(dāng)足夠小，以便通過0.22微米的膜進(jìn)行無菌過濾(歐洲專利號0 689 454)。
每劑量的3D-MPL在10μg-100μg范圍內(nèi)，尤其是25-50μg，其中典型的抗原劑量在2-50μg范圍內(nèi)。
另一種優(yōu)選的佐劑包括QS21，用Hplc從Quillaja SaponariaMolina的樹皮中純化出的一種無毒組分。任選地它可以與3De-O-?；瘑瘟柞Ｖ珹(3D-MPL)混合，任選擇地與載體混合。
生產(chǎn)QS21的方法公開在美國專利No.5，057，540中。
包含QS21的無反應(yīng)原性制劑以前有描述(WO96/33739)。包含QS21和膽固醇的這種制劑，當(dāng)與一種抗原一起配制時，是一種成功的TH1刺激佐劑。
TH1細(xì)胞反應(yīng)優(yōu)先刺激劑的其他佐劑，包括免疫調(diào)節(jié)寡聚核苷酸，例如在WO96/02555中公布的未甲基化的CpG序列。
不同的TH1刺激佐劑的組合物，例如在上文描述的那些組合物，也可以預(yù)期提供一種是TH1細(xì)胞反應(yīng)優(yōu)先刺激劑的佐劑。例如，QS21可以與3D-MPL一起配制。QS213D-MPL的典型比率在1∶10到10∶1等級之間；優(yōu)選1∶5到5∶1，基本上經(jīng)常是1∶1。3D-MPLQS21對于最佳協(xié)同作用的范圍是2.5∶1到1∶1。
依據(jù)本發(fā)明，載體優(yōu)選也出現(xiàn)在疫苗組合物中。載體可以是水包油乳狀液，或者鋁鹽，例如磷酸鋁或者氫氧化鋁。
優(yōu)選的水包油乳狀劑包含一種可代謝的油，例如鯊烯，α生育酚和吐溫80。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的方面，疫苗組合物中的抗原在這種乳狀劑中與QS21和3D-MPL混合在一起。
對于典型的人類用藥，疫苗中的QS21和3D-MPL在每劑量1μg-200μg范圍內(nèi)，例如每劑量10μg-100μg，優(yōu)選每劑量10μg-50μg。典型的水包油包含2-10％的鯊烯，2-10％的α生育酚和0.3-3％的吐溫80。鯊烯α生育酚的比率優(yōu)選是等于或者小于1，這可以提供一種更穩(wěn)定的乳狀劑。Span85也可以以1％的水平出現(xiàn)。在有的情況下，本發(fā)明的疫苗中另外包含一種穩(wěn)定劑可能是有利的。
無毒的水包油乳狀劑優(yōu)選在水性載體中包含一種無毒的油，例如鯊?fù)榛蛘啧徬?，一種乳化劑，例如吐溫80。水性載體可以是例如磷酸緩沖液。
WO95/17210中描述了水包油乳狀液中含有QS21，3D-MPL和生育酚的特別有效的佐劑制劑。
本發(fā)明也提供了一種多價疫苗組合物，該疫苗組合物包含一種與其它抗原結(jié)合的本發(fā)明的疫苗制劑，特別是用于治療癌癥、自身免疫疾病和相關(guān)疾病的抗原。這樣的多價疫苗組合物，可以包含一種在上文描述的TH-1誘導(dǎo)佐劑。
當(dāng)本發(fā)明被描述為與特定的BASB033多肽和多核苷酸有關(guān)時，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為這包括了天然存在的多肽和多核苷酸的片段，以及經(jīng)過添加、缺失或者置換的相似多肽和多核苷酸，這些添加、缺失或者置換基本上不影響重組多肽或者多核苷酸的免疫原性。
抗原也可以以完整細(xì)菌(活的或者死的)或者亞細(xì)胞成分的形式送遞，這些可能性包括腦膜炎奈瑟氏球菌本身。
組合物，試劑盒和用藥本發(fā)明的另一方面也提供了這樣的組合物，該組合物包含給細(xì)胞或者多細(xì)胞生物體用藥的BASB033多核苷酸和/或BASB033多肽。
本發(fā)明也涉及這樣的組合物，該組合物包含此處討論的多核苷酸和/或多肽或者它們的激動劑和拮抗劑。本發(fā)明的多肽和多核苷酸可以與有菌或者無菌的載體一起使用，這種載體是用于細(xì)胞、組織或者生物體的，例如適用于給個體用藥的藥物載體。例如，這種組合物包括，介質(zhì)添加數(shù)量或者治療有效量的本發(fā)明多肽和/或多核苷酸以及藥物可接受載體或者賦形劑。這種載體可以包括但是不局限于鹽水，緩沖液，葡萄糖，水，甘油，乙醇和它們的混合物。制劑應(yīng)當(dāng)適合用藥的方式。此外，本發(fā)明涉及診斷的和藥物的包和試劑盒，這種包和試劑盒包括一個或者多個容器，其中裝有一種或者多種本發(fā)明前述組合物的成分。
本發(fā)明藥物組合物可以以任何有效方便的方式給藥，例如其中包括局部用藥，口服，肛門用藥，陰道用藥，靜脈內(nèi)用藥，腹膜內(nèi)用藥，肌內(nèi)用藥，皮下用藥，鼻內(nèi)用藥或皮內(nèi)用藥途徑。
在治療中或者作為預(yù)防，活性藥劑可以作為注射組合物給個體使用，例如以無菌的水性分散形式，優(yōu)選等滲形式。
另一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，該組合物包括治療有效量的多肽和/或多核苷酸，例如本發(fā)明多肽和/或多核苷酸的可溶性形式，激動劑或者拮抗劑肽或者小分子化合物，結(jié)合以藥物可接受載體或者賦形劑。這種載體包括但是不局限于鹽水，緩沖液，葡萄糖，水，甘油，乙醇和它們的混合物。此外，本發(fā)明涉及藥物包和試劑盒，這種包和試劑盒包括一個或者多個容器，其中裝有一種或者多種本發(fā)明前述組合物的成分。本發(fā)明的多肽，多核苷酸和其它化合物，可以單獨(dú)使用，或者與其它化合物聯(lián)合使用，例如治療化合物。
該組合物應(yīng)適合于用藥途徑，例如全身途徑或者口服途徑。優(yōu)選的全身給藥形式包括注射，典型的是靜脈注射。其他注射方式也可以使用，例如皮下注射、肌肉內(nèi)注射或者腹膜下注射?？晒┻x擇的全身用藥方式包括，使用滲透劑的跨粘膜用藥和跨皮膚用藥，滲透劑例如膽鹽或者梭鏈孢酸或者其他去垢劑。另外，如果本發(fā)明的多肽或者其他化合物可以配制成腸溶性劑型或者膠囊劑型，口服用藥也是可行的。這些化合物的用藥可以是局部和/或定位的，其形式可以是藥膏，糊膏劑，凝膠，溶液，粉末等等。
給哺乳動物特別是人類用藥，預(yù)期的活性藥劑的日劑量水平是從0.01mg/kg到10mg/kg，典型的是大約1mg/kg。在任何情況下，個體最適合的實(shí)際劑量要由醫(yī)生確定，該實(shí)際劑量根據(jù)具體個體的年齡、體重和反應(yīng)而有所變化。以上劑量是對于普通病例是典型的。當(dāng)然，可以有一些個體實(shí)例，更高或者更低的劑量范圍對其是適合的，這也在本發(fā)明的范疇內(nèi)。
必需的劑量范圍依賴于肽的選擇，用藥途徑，制劑性質(zhì)，患者病情的特征，以及主治醫(yī)生的判斷。然而，適當(dāng)?shù)膭┝吭?.1-100μg/kg患者范圍內(nèi)。
疫苗組合物以注射形式存在是方便的。傳統(tǒng)的佐劑可以用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)。用于接種的合適的單位劑量是05.-5微克/kg抗原，這種劑量優(yōu)選施用1-3次，間隔1-3周。使用指出的劑量范圍，觀察不到本發(fā)明化合物不利的毒副作用，該毒性作用會阻止對合適個體的服藥。
然而，考慮到可用化合物的多樣性和各種用藥途徑的不同效果，可以預(yù)期所需劑量有廣闊的變化程度。例如，口服用藥預(yù)期需要比靜脈注射用藥更高的劑量?？梢酝ㄟ^使用用于最佳化的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)程序來調(diào)整這些劑量水平的變化，該程序在本領(lǐng)域中熟知。
序列數(shù)據(jù)庫，有形媒介中的序列，以及算法多核苷酸和多肽的序列構(gòu)成了一種有價值的信息資源，用該信息可以確定它們的2-維和3-維結(jié)構(gòu)，以及鑒定更多的類似同源性的序列。通過把這些序列存儲在計(jì)算機(jī)可讀媒介中，然后使用在已知大分子結(jié)構(gòu)程序中儲存的數(shù)據(jù)，或者使用已知搜索工具，例如GCG程序包搜索序列數(shù)據(jù)庫，可以最容易地易化這些方法。
本發(fā)明也提供了分析特征序列或者鏈的方法，特別是遺傳序列或者編碼的蛋白質(zhì)的序列。優(yōu)選的序列分析方法包括，例如，分析序列同源性的方法，例如同一性和相似性分析，DNA，RNA和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，序列組裝，分支分析，序列基元分析，開放閱讀框架確定，核酸堿基調(diào)用，密碼子使用分析，核酸堿基修飾，以及測序色譜峰分析。
提供了一種基于計(jì)算機(jī)的方法以進(jìn)行同源性鑒定。該方法包括這些步驟在計(jì)算機(jī)可讀媒介中，提供包含本發(fā)明多核苷酸序列的第一多核苷酸序列；以及比較該第一多核苷酸序列與至少一種第二多核苷酸或多肽序列，以鑒定同源性。
也提供了一種基于計(jì)算機(jī)的方法以進(jìn)行同源性鑒定，該方法包括這些步驟在計(jì)算機(jī)可讀媒介中，提供包含本發(fā)明多肽序列的第一多肽序列；以及比較該第一多肽序列與至少一種第二多核苷酸或多肽序列，以鑒定同源性。
在本說明書中引用的所有的出版物和參考文獻(xiàn)，包括但是不局限于專利和專利申請，在此引入作為參考，好像每一篇出版物或者參考文獻(xiàn)都是特異地和單獨(dú)地作為全面陳述而在此引入作為參考的。本申請聲稱對其擁有優(yōu)先權(quán)的任何專利申請，也通過上述對出版物和參考文獻(xiàn)的方式在此引入作為參考。
定義“同一性”，正如本領(lǐng)域已知的，是指兩條或者多條多肽序列或者兩條或者多條多核苷酸序列之間的關(guān)系，視具體情況而定，該關(guān)系是通過比較序列確定的。在本領(lǐng)域，“同一性”也意味著多肽或者多核苷酸序列之間序列相關(guān)性的程度，視具體情況而定，該關(guān)系是通過這些序列的鏈之間的匹配確定的?！巴恍浴笨梢匀菀椎赝ㄟ^已知的方法計(jì)算，包括但是不局限于描述在(計(jì)算分子生物學(xué)(Computational Molecular Biology)Lesk.A.M.，編.，OxfordUniversity Press，紐約，1988；生物計(jì)算信息和基因組課題(BiocomputingInformatics and Genome Projects)，Smith.D.W.，編.，科學(xué)出版社，紐約，1993；序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析，I部(ComputerAnalysis of Sequence Data，Part I)，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，編.，Humana Press，新澤西，1994；分子生物學(xué)中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)，yonHeine，G.，科學(xué)出版社，1987；和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.和Devereux，J.，編.，M Stockton Press，紐約，1991；和Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1998)中的那些方法。設(shè)計(jì)確定同一性的方法，以給出被測序列之間最大的匹配。另外，確定同一性的方法被編碼到公開可用的計(jì)算機(jī)程序中。確定兩條序列之間同一性的計(jì)算機(jī)程序方法，包括但是不局限于，GCG程序包中的GAP程序(Devereux，J.，等，核酸研究(Necleic Acids Research)12(1)387(1984)).BLASTP.BLASTN(Altschul.S.F.等。，分子生物學(xué)雜志(J.Molec.Biol.)215403-410(1990).和FASTA(Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444-2448(1988).從NCBI和其它來源、公眾可獲得程序的BLAST族(BLAST Manual Altschul，S.，等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD20894Altschul，S.，et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1990)。熟知的Smith Waterman算法也可以用于確定同一性。
多肽序列比較的參數(shù)包括以下各項(xiàng)算法Needleman和Wunsch，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48443-453(1970)比較矩陣來自Henikoff和Henikoff的BLOSSUM62美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，8910915-10919(1992)Gap Penalty8Gap Length Penalty2一種公開提供的可以使用這些參數(shù)的程序是Genetics ComputerGroup，Madison WI的“gap”程序。上述參數(shù)是多肽比較的缺省參數(shù)(對于末端缺口沒有損失)。
多核苷酸序列比較的參數(shù)包括以下算法Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443-453(1970)比較母式矩陣匹配＝+10，不匹配＝0
Gap Penalty50Gap Length Penalty3提供為Genetics Computer Group，Madison WI的“gap”程序。這些是核酸比較的缺省參數(shù)。
多核苷酸和多肽“同一性”優(yōu)選意思，視具體情況而定，提供在下面的(1)和(2)中。
(1)多核苷酸實(shí)施方案此外還包括分離出的多核苷酸，該多核苷酸包含一段多核苷酸序列，該序列與SEQ ID NO1的對照序列有至少50，60，70，80，85，90，95，97或者100％的同一性，其中該多核苷酸序列可以與SEQ ID NO1對照序列完全同一，或者與對照序列比較可以包含一定整數(shù)個數(shù)的核苷酸改變，其中所說的改變選自至少一個核苷酸的缺失，置換，包括轉(zhuǎn)位和顛換，或者插入，并且其中該改變可以發(fā)生在對照核苷酸序列的5’或者3’末端位置，或者那些末端位置之間的任何位置，這些改變單個地可以分布在對照序列的核苷酸中，或者以一個或者多個連續(xù)群體分布在對照序列中，而且其中所說的核苷酸改變的數(shù)目通過以下方法確定把SEQ ID NO1中全部核苷酸數(shù)目乘以定義百分同一性的整數(shù)除以100，然后從該SEQ IDNO1中全部核苷酸數(shù)目中減去該乘積，或者nn＜xn-(xn·y)，其中nn是核苷酸改變的數(shù)目，xn是SEQ ID NO1中全部核苷酸數(shù)目，y對于50％是0.50，對于60％是0.60，對于70％是0.70，對于80％是0.80，對于85％是0.85，對于90％是0.90，對于95％是0.95，對于97％是0.97或者對于100％是1.00，·是乘法算符的符號，而且其中xn和y的非整數(shù)乘積，在被從xn中減去之前四舍五入為最接近的整數(shù)。編碼SEQ ID NO2多肽的多核苷酸序列的改變，可能在該編碼序列中產(chǎn)生無義、錯義或者移碼突變，因此改變經(jīng)過這種改變的多核苷酸編碼的多肽。
作為實(shí)例，本發(fā)明的多核苷酸序列可以與SEQ ID NO1對照序列完全同一，即可以是100％的同一，或者與對照序列比較，它可以包含一定整數(shù)數(shù)目的核酸改變，例如百分同一性小于100％同一性。這種改變選自至少一個核酸的缺失，置換，包括轉(zhuǎn)位和顛換，或者插入，并且其中該改變可以發(fā)生在對照多核苷酸序列的5’或者3’末端位置，或者那些末端位置之間的任何位置，這些改變單個地可以分布在對照序列的核酸中，或者以一個或者多個連續(xù)群體分布在對照序列中。所給百分同一性的核酸改變數(shù)目通過以下方法確定把SEQ ID NO1中全部核酸數(shù)目乘以定義百分同一性的整數(shù)除以100，然后從該SEQID NO1中全部核酸數(shù)目中減去該乘積，或者nn＜xn-(xn·y)，其中nn是核酸改變的數(shù)目，xn是SEQ ID NO1中全部核酸數(shù)目，y是，例如對于70％是0.70，對于80％是0.80，對于85％是0.85等等，·是乘法算符的符號，而且其中xn和y的非整數(shù)乘積，在被從xn中減去之前四舍五入為最接近的整數(shù)。
(2)多肽實(shí)施方案此外還包括分離出的多肽，該多肽包含一段與SEQ ID NO2對照序列有至少50，60，70，80，85，90，95，97或者100％的同一性的多肽，其中該多肽序列可以與SEQ ID NO2對照序列完全同一，或者與對照序列比較可以包含一定整數(shù)個數(shù)的氨基酸改變，其中所說的改變選自至少一個氨基酸的缺失，置換，包括保守和非保守置換，或者插入，并且其中該改變可以發(fā)生在對照多肽序列的氨基-或者羧基-末端位置，或者那些末端位置之間的任何位置，這些改變單個地可以分布在對照序列的氨基酸中，或者以一個或者多個連續(xù)群體分布在對照序列中，而且其中所說的氨基酸改變的數(shù)目通過以下方法確定把SEQ ID NO2中全部氨基酸數(shù)目乘以定義百分同一性的整數(shù)除以100，然后從該SEQ ID NO2中全部氨基酸數(shù)目中減去該乘積，或者na＜xa-(xa·y)，其中na是氨基酸改變的數(shù)目，xa是SEQ ID NO2中全部氨基酸數(shù)目，y對于50％是0.50，對于60％是0.60，對于70％是0.70，對于80％是0.80，對于85％是0.85，對于90％是0.90，對于95％是0.95，對于97％是0.97或者對于100％是1.00，·是乘法算符的符號，而且其中xa和y的非整數(shù)乘積，在被從xa中減去之前四舍五入為最接近的整數(shù)。
作為實(shí)例，本發(fā)明的多肽序列可以與SEQ ID NO2對照序列完全同一，即可以是100％的同一，或者與對照序列比較，它可以包含一定整數(shù)數(shù)目的氨基酸改變，例如百分同一性小于100％同一性。這種改變選自至少一個氨基酸的缺失，置換，包括保守和非保守置換，或者插入，并且其中該改變可以發(fā)生在對照多肽序列的氨基-或者羧基-末端位置，或者那些末端位置之間的任何位置，這些改變單個地可以分布在對照序列的氨基酸中，或者以一個或者多個連續(xù)群體分布在對照序列中。所給％同一性的氨基酸改變數(shù)目通過以下方法確定把SEQ IDNO2中全部氨基酸數(shù)目乘以定義百分同一性的整數(shù)除以100，然后從該SEQ ID NO2中全部氨基酸數(shù)目中減去該乘積，或者na＜xa-(xa·y)，其中na是氨基酸改變的數(shù)目，xa是SEQ ID NO2中全部氨基酸數(shù)目，y是，例如對于70％是0.70，對于80％是0.80，對于85％是0.85等等，·是乘法算符的符號，而且其中xa和y的非整數(shù)乘積，在被從xa中減去之前四舍五入為最接近的整數(shù)。
“個體”，在此處使用時是關(guān)于生物體的，意味著多細(xì)胞真核生物，包括但是不局限于包括后生動物，哺乳動物，ovid，?？苿游?，猿，靈長類，和人類。
“分離出的”意味著被從其天然狀態(tài)中“通過人手”而改變，即，如果它存在于天然狀態(tài)中，它被從其初始環(huán)境中改變或者移動，或者既改變也移動。例如，天然存在于活的生物體中的多核苷酸或者多肽不是“分離出的”，但是從其天然狀態(tài)共存的材料中分離出的同樣的多核苷酸或者多肽是“分離出的”，正如此處使用的該術(shù)語。此外，通過轉(zhuǎn)化，遺傳操作或者其他重組方法引入到生物體中的多核苷酸或者多肽是“分離出的”，即使它仍然出現(xiàn)在該生物體中，該生物體可以是活的或者死的。
“多核苷酸”通常指的是多核糖核苷酸或者多脫氧核糖核苷酸，可以是未經(jīng)修飾的RNA或DNA或者經(jīng)過修飾的RNA或DNA，包括單鏈和雙鏈區(qū)域。
“變體”指的是與對照多核苷酸或者多肽不同但是保留了基本性質(zhì)的多核苷酸或者多肽。典型的多核苷酸變體與另一條多核苷酸，對照多核苷酸在核苷酸序列上不同。變體核苷酸序列的改變，可以改變或者也可以不改變對照多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。核苷酸改變，可以導(dǎo)致如下所述的，對照多核苷酸編碼的多肽的氨基酸置換、添加、缺失、融合和平截。典型的多肽變體與另一條多肽，對照多肽在氨基酸序列上不同。通常，不同是有限的，于是對照多肽序列和變體總體上是非常相似的，并且在許多區(qū)域是同一的。通過任意組合的一個或者多個置換、添加、缺失，變體和對照多肽可以在氨基酸序列上不同。一個置換或者插入的氨基酸殘基可以是也可以不是遺傳密碼子編碼的。多核苷酸或者多肽的變體，可以是天然存在的，例如等位基因變體，或者它可能是一種不是已知天然存在的變體。非天然存在的多核苷酸或者多肽變體，可以通過誘變技術(shù)或者通過直接合成產(chǎn)生。
“疾病”指任何由細(xì)菌感染引起的或者與之相關(guān)的疾病，例如包括，上呼吸道感染，侵襲性細(xì)菌疾病，例如菌血癥和腦膜炎。
實(shí)例以下實(shí)例是用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行的，這些技術(shù)，除了另外詳細(xì)描述的以外，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是熟知的和常規(guī)的。實(shí)施例是說明性的，但是不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1兩株腦膜炎奈瑟氏球菌菌株中的BASB033基因的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)性DNA測序。
A腦膜炎奈瑟氏球菌血清型B菌株ATCC13090中的BASB033SEQ ID NO1的BASB033基因最早發(fā)現(xiàn)于Incyte PathoSeq數(shù)據(jù)庫，其中包含腦膜炎奈瑟氏球菌ATCC13090菌株的未完成基因組DNA序列。顯示在SEQ ID NO2中的BASB033多核苷酸序列的翻譯，顯示了與肺炎克氏桿菌外膜磷脂酶A蛋白質(zhì)顯著的相似性(292個重疊氨基酸中35％的同一性)。BASB033基因的序列被進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。為此目的，使用QIAGEN基因組DNA提取試劑盒(Qiagen Gmbh)，從1010個腦膜炎奈瑟氏球菌細(xì)胞(ATCC13090菌株)中提取基因組DNA，1μg這種材料用于聚合酶鏈反應(yīng)DNA擴(kuò)增，引物使用的是包含NdeI內(nèi)切酶位點(diǎn)(下劃線標(biāo)出)的Pla-01(5’-GGT CGA CCA TAT GAA TATACG GAA TAT GCG CTA-3’)[SEQ ID NO5]和包含XhoI內(nèi)切酶位點(diǎn)(下劃線標(biāo)出)的Pla-02(5’-CGC CGC TCG AGG ATG CCG TCC AAG TCGTTG-3’)[SEQ ID NO6]。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化，用于DNA測序，測序使用的是Big Dye Cycle測序試劑盒(Perkin-Elmer)和ABI373A/PRISM DNA測序儀。DNA測序在兩條鏈進(jìn)行，冗余度為2，全長序列通過DNASTAR Lasergene軟件包中的SeqMan程序裝配。最后得到的DNA序列證明與SEQ ID NO1 100％同一。
B腦膜炎奈瑟氏球菌血清型B菌株H44/76中的BASB033BASB033基因的序列在另一種腦膜炎奈瑟氏球菌血清型B菌株，H44/76菌株中也得到確定。為此目的，使用實(shí)施例1中給出的實(shí)驗(yàn)條件，從腦膜炎奈瑟氏球菌H44/76菌株中提取基因組DNA。然后，這種材料(1μg)被用于聚合酶鏈反應(yīng)DNA擴(kuò)增，擴(kuò)增使用了對BASB033基因特異的引物Pla-01和Pla-02。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(Molecular Cloning，a Laboratory Manual)，第二版，編者Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，冷泉港出版社1989)，得到一段-1100bp的DNA片段，用NdeI/XhoI限制性內(nèi)切酶酶解，并插入到pE7-24b克隆/表達(dá)載體(Novagen)的相應(yīng)位點(diǎn)。然后，使用Big Dye試劑盒(Applied biosystems)對重組體pE7-24b/BASB033進(jìn)行DNA測序，并使用ABI373/A DNA測序儀在供應(yīng)商所述的條件下進(jìn)行分析。從而得到多核苷酸和推導(dǎo)出的多肽序列，分別被稱為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。使用DNAST AR Lasergene package中的MegAlign程序完成了SEQ ID NO1和3多核苷酸序列的序列對比，并顯示在

圖1中；如程序確定的，它們的同一性水平等于99.3％。使用相同的Meg Align程序，完成了SEQ ID NO2和4的多肽序列的序列對比，并顯示在圖2中；如該程序確定的，它們的同一性水平等于98.9％。
總之，這些數(shù)據(jù)表明，這兩種腦膜炎奈瑟氏球菌血清型B菌株中的BASB033基因具有強(qiáng)烈的序列保守性。
實(shí)例2重組BASB033蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)和純化pE7-24b/BASB033克隆/表達(dá)載體的構(gòu)建體描述在實(shí)施例1B中。該載體接入從H44/76菌株中分離出的BASB033基因，該基因融合了一段6個組氨酸殘基的序列，并被置于噬菌體T7基因10強(qiáng)啟動子的控制之下。為了研究表達(dá)，該載體被引入大腸桿菌菌株Novablue(DE3)(Novagen)中，其中，T7聚合酶基因被置于異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)-調(diào)節(jié)的lac啟動子控制之下。Novablue(DE3)[pET-24b/BASB033]大腸桿菌重組菌株的液體培養(yǎng)物(100ml)在37℃搖動培養(yǎng)，直至600nm光密度(OD600)達(dá)到0.6。在這一時間點(diǎn)，加入IPTG至終濃度1mM，然后培養(yǎng)物再生長4個小時。然后，以10,000rpm離心培養(yǎng)物，沉淀在-20℃冷凍至少10小時。
融化后，沉淀(3升培養(yǎng)物)在pH8.0每毫升包含20單位benzonase的20mM磷酸緩沖液中重懸，在22℃孵育30分鐘。裂解的細(xì)胞在4℃，15,000rpm離心30分鐘得沉淀(Beckman J2-HS離心機(jī)，JA-20轉(zhuǎn)頭)。重組蛋白質(zhì)BASB033/His6在4℃用pH8.0的8M脲，20mM磷酸鹽溶解過夜。細(xì)胞碎片在4℃，用JA-20轉(zhuǎn)頭15,000rpm離心30分鐘得沉淀。樣品以1ml/min流速加樣到4ml的Fractogel EMD S03 650S柱子(Merck)上。柱子用pH8.0的8M脲，20mM磷酸鹽平衡。流通通過之后，柱子用平衡緩沖液清洗，直至達(dá)到基線。用pH8.0的100mM NaCl，8M脲，20mM磷酸鹽以1ml/min從柱子上洗脫重組蛋白質(zhì)。洗脫的樣品在4℃用含0.5M精氨酸的PBS透析。如顯示在圖3(6道)中的，濃縮的(在CBB染色的SDS-PAGE上，估計(jì)的純度是50％純)BASB033/His6蛋白質(zhì)被從柱子上洗脫下來，它遷移到43kDa(估計(jì)的相對分子量)。該多肽對于抗5-組氨酸基元的小鼠單克隆抗體是有活性的(參見圖4，6道)。總之，這些數(shù)據(jù)表明，BASB033基因可以以重組形式(BASB033/His6)在大腸桿菌中的表達(dá)和純化。
實(shí)例3用重組BASB033免疫小鼠部分純化的在大腸桿菌中表達(dá)的重組BASB033，在第0，14，28天分3次注射到Balb/C小鼠中(10只動物/組)。通過皮下途徑給動物注射吸附到100μg AlPO4上的5μg抗原。包括只用SBAS2佐劑免疫小鼠的陰性對照組也被增加到試驗(yàn)中。為了檢測抗-BASB033的特異抗體，小鼠在第28天(Post II 14天)和第35天(Post III 7天)取血。對于重組BASB033蛋白質(zhì)和大腸桿菌蛋白質(zhì)用混合血清Elisa來測定抗-BASB033的特異抗體。使用重組抗原通過蛋白質(zhì)印跡也評價了抗-BASB033反應(yīng)。
對包被有BASB033的Elisa結(jié)果顯示在下面，表明BASB033抗原盡管是部分純化的，它在小鼠內(nèi)有明顯的免疫原性，雖然比較弱(圖5)。特異的BASB033反應(yīng)和大腸桿菌反應(yīng)之間可觀察到的不同，是由于抗-BASB033的特異抗體。陰性對照組的小鼠沒有特異的BASB033反應(yīng)。這也清楚地證明在圖6中，其中有在大約43kD檢測到的清楚的BASB033泳帶。Post II或者Post III取血得到的血清用于這些分析。
通過蛋白質(zhì)印跡識別不同NmB菌株中的BASB033抗原決定簇在檢測中，經(jīng)免疫的小鼠血清(混合的)用蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行檢測，以識別六種不同腦膜炎奈瑟氏球菌B菌株中的BASB033抗原決定簇H44/76(B15P1.7，16，譜系ET-5)，M97 250687(B4P1.15)，BZ10(B2bP1.2，譜系A(chǔ)4)，BZ198(BNT*-，譜系3)，和EG328(BNT*，譜系ST-18)，以及部分純化的重組BASB033蛋白質(zhì)。(*NT未定型(Not Typed))。
簡而言之，每種樣品15μl(＞108個細(xì)胞/道)經(jīng)用樣品緩沖液處理后(95℃10分鐘)，加樣到SDS-PAGE梯度凝膠(Tris-甘氨酸4-20％，Novex，code n°EC6028)。電泳遷移發(fā)生在35mA/凝膠90分鐘。然后，在100伏使用Bio-rad Trans-blot系統(tǒng)(code n°170-3930)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(0.45μm，Bio-rad coden°162-0114)。在與包含抗-BASB033抗體的小鼠血清一起孵育前，濾膜在室溫用PBS-0.05％吐溫20封閉過夜。這些血清在PBS-0.05％吐溫20中稀釋100倍，使用mini-blotter系統(tǒng)(Miniprotean，Bio-rad code n°170-4017)將血清在硝酸纖維素膜上室溫下孵育兩小時，輕輕搖動。重復(fù)3次清洗步驟，每次在PBS-0.05％吐溫20中清洗5分鐘，然后，硝酸纖維素膜在室溫下與合適的偶聯(lián)物(來自綿羊的生物素化的抗小鼠Ig抗體，Amersham code n°RPN1001)孵育1小時，輕輕搖動，該偶聯(lián)物在相同的清洗緩沖液中稀釋到1/500。再象前面那樣把膜清洗3次，使用鏈霉抗生物素蛋白質(zhì)-過氧化物酶復(fù)合物(Amersham code n°1051)搖動孵育30分鐘，鏈霉抗生物素蛋白質(zhì)-過氧化物酶復(fù)合物需要在清洗緩沖液中稀釋到1/1000。在最后3次重復(fù)清洗步驟之后，在50ml包含30mg 4-氯-1-萘酚(Sigma)，10ml甲醇，40ml PBS，以及30μl H2O2的溶液中進(jìn)行孵育，顯色發(fā)生在20分鐘孵育時間里。在蒸餾水中清洗薄膜幾次，終止染色。
圖解在圖7和圖8中的結(jié)果表明，幾乎所有的被試菌株都呈現(xiàn)出一條大約43kD的條帶，意味著抗重組BASB033蛋白質(zhì)的抗體識別腦膜炎奈瑟氏球菌B細(xì)胞表面的天然蛋白質(zhì)(此情況下，6/7菌株被識別)。于是，BASB033蛋白質(zhì)可能在大多數(shù)腦膜炎奈瑟氏球菌B菌株中表達(dá)。所有其它條帶可能是由于抗BASB033聚合產(chǎn)物抗體(如在大約90-100kD觀察到的產(chǎn)物)，相關(guān)產(chǎn)物，或者大腸桿菌與腦膜炎奈瑟氏球菌B細(xì)菌之間的交叉反應(yīng)抗原，因?yàn)橛糜诿庖叩闹苿┤园竽c桿菌的雜質(zhì)。在大腸桿菌蛋白質(zhì)中，觀察不到43kD的反應(yīng)條帶，意味著抗原不存在于大腸桿菌中。
實(shí)例4恢復(fù)期患者血清中出現(xiàn)抗-BASB033抗體在檢測中，通過識別純化的重組BASB033蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡檢測幾種恢復(fù)期血清。
簡而言之，24μg部分純化的BASB033蛋白質(zhì)被加樣到用于電泳遷移的SDS-PAGE梯度凝膠上(4-20％，Novex，code n°EC6029)。在100伏使用Bio-rad Trans-blot系統(tǒng)(code n°170-3930)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(0.45μm，Bio-rad code n°162-0114)。此后，在與人血清一起孵育前，濾膜在室溫用PBS-0.05％吐溫20封閉過夜。這些血清在PBS-0.05％吐溫20中稀釋至1/50，使用mini-blotter系統(tǒng)(Miniprotean，Bio-rad code n°170-4017)將血清在硝酸纖維素膜上室溫下孵育兩小時，輕輕搖動。重復(fù)3次在PBS-0.05％吐溫20中清洗5分鐘清洗步驟之后，硝酸纖維素膜在室溫下與合適的偶聯(lián)物(來自綿羊的生物素化的抗人Ig抗體，Amershamcode n°RPN1003)孵育1小時，輕輕搖動，該偶聯(lián)物在相同的清洗緩沖液中稀釋到1/500。再象前面那樣把膜清洗3次，使用鏈霉抗生物素蛋白質(zhì)-過氧化物酶復(fù)合物(Amersham code n°1051)搖動孵育30分鐘，鏈霉抗生物素蛋白質(zhì)-過氧化物酶復(fù)合物需要在清洗緩沖液中稀釋到1/1000。在最后3次重復(fù)清洗步驟之后，在50ml包含30mg4-氯-1-萘酚(Sigma)，10ml甲醇，40ml PBS，以及30μl H2O2的溶液中進(jìn)行孵育，顯色發(fā)生在20分鐘孵育時間里。在蒸餾水中清洗薄膜幾次，終止染色。
圖解在圖9(B部分)中的結(jié)果表明，所有的被試恢復(fù)期血清都在大約43kD與BASB033重組蛋白質(zhì)反應(yīng)，BASB033條帶清楚可見。260601恢復(fù)期血清反應(yīng)最弱。這種反應(yīng)支持了BASB033抗原作為疫苗成分的潛在用途。在蛋白質(zhì)印跡的A部分，如前所述，我們證實(shí)小鼠血清對于完整的重組BASB033蛋白質(zhì)的識別非常好。
實(shí)例5BASB033基因非編碼側(cè)翼區(qū)的分析，及其調(diào)節(jié)BASB033基因表達(dá)的利用BASB033基因非編碼側(cè)翼區(qū)包含對基因表達(dá)重要的調(diào)節(jié)元件。這種調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平。這些區(qū)域位于基因開放閱讀框架的上游或者下游，其序列可以通過DNA測序得到。這些序列信息允許確定潛在的調(diào)節(jié)基元，例如不同的啟動子元件，終止子序列，誘導(dǎo)序列元件，阻抑物，負(fù)責(zé)相轉(zhuǎn)變的元件，shine-delgarno序列，具有與調(diào)節(jié)有關(guān)的潛在二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域，以及其它類型的調(diào)節(jié)基元或者序列。
這些序列信息允許調(diào)節(jié)BASB033基因的天然表達(dá)。通過改變啟動子，shine-delgarno序列，潛在阻抑物或者操縱基因元件，或者其他任何有關(guān)元件，可以實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的正調(diào)節(jié)。同樣的，通過相似類型的改變，可以實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)。作為選擇，通過改變相轉(zhuǎn)變序列，基因表達(dá)可以置于相轉(zhuǎn)變的控制之下，或者可以與這種調(diào)節(jié)分離。用另一種方法，基因表達(dá)可以置于一種或者多種調(diào)節(jié)表達(dá)的誘導(dǎo)型元件控制之下。這種調(diào)節(jié)表達(dá)的實(shí)例，包括但是不局限于，通過溫度改變誘導(dǎo)，加入象是挑選的糖類或者其衍生物那樣的誘導(dǎo)物質(zhì)，微量元素，維生素，輔因子，金屬離子，等等。
上述這樣的改變可以通過若干不同的方式引入。涉及基因表達(dá)的序列改變，可以通過體內(nèi)隨機(jī)誘變實(shí)現(xiàn)，誘變之后要對期望表型進(jìn)行選擇。另一種方法是分離出感興趣的區(qū)域，通過隨機(jī)誘變，或者定點(diǎn)誘變，插入或者缺失誘變對其進(jìn)行修改。然后，經(jīng)改變的區(qū)域可通過同源重組重新引入細(xì)菌基因組，并且可以估計(jì)其對于基因表達(dá)的效果。用另一種方法，感興趣區(qū)域的序列知識可用于置換或者缺失全部或者部分的天然調(diào)節(jié)序列。這樣的話，目標(biāo)調(diào)節(jié)區(qū)域被分離和修改，使得它包含來自其他基因的調(diào)節(jié)元件，來自不同基因的調(diào)節(jié)元件的組合，合成的調(diào)節(jié)區(qū)域，或者任何其他調(diào)節(jié)區(qū)域，或者使其缺失野生型調(diào)節(jié)序列中挑選的部分。這些經(jīng)改變的序列可通過同源重組重新引入細(xì)菌基因組。可用于基因表達(dá)正調(diào)節(jié)的優(yōu)選啟動子的一份不完全列表包括，來自腦膜炎奈瑟氏球菌或者淋病奈瑟氏球菌的啟動子porA，porB，lbpB，tbpB，p110，lst，hpuAB。
在另一個實(shí)施例中，可以通過將其啟動子換為一種更強(qiáng)的啟動子而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)(通過分離基因的上游序列，在體外修改該序列，并通過同源重組重新引入基因組)。在細(xì)菌中以及從細(xì)菌脫落(或者制備)的外膜囊泡中可以得到正調(diào)節(jié)的表達(dá)。在其他實(shí)施例中，所說的方法可用于產(chǎn)生重組細(xì)菌菌株，該菌株對于疫苗應(yīng)用具有改良的特性。這些可以是，但是不局限于，減毒菌株，增加表達(dá)所選抗原的菌株，敲除(或者降低表達(dá))涉及免疫反應(yīng)的基因的菌株，免疫顯性蛋白表達(dá)經(jīng)過調(diào)節(jié)的菌株，外膜囊泡脫落經(jīng)過調(diào)節(jié)的菌株。
直接位于BASB033基因上游的一段區(qū)域在SEQ ID NO7的序列中給出。該序列是本發(fā)明的另一個方面。
圖例圖3基本上純化的(估計(jì)50％)BASB033蛋白質(zhì)級分在SDS-PAGE條件下在4-20％梯度聚丙烯酰胺凝膠(NOVEX)中得以分離，與之平行的是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(1道)，然后用考馬斯藍(lán)染色。6道清楚地顯示了在大約43kD濃縮的BASB033(2道和3道是全部細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物，4道是流通(flowthrough)，5至10道是洗脫分布圖)。
圖4基本上純化的(估計(jì)50％)BASB033蛋白質(zhì)級分在SDS-PAGE條件下在4-20％梯度聚丙烯酰胺凝膠(NOVEX)中得以分離，與之平行的是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(1道)，然后使用抗-His5小鼠單克隆抗體通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行分析。6道清楚地顯示了大約43kD的BASB033多肽(2道和3道是全部細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物，4道是流通，5至10道是洗脫分布圖)。
BASB033多核苷酸和多肽序列SEQ ID NO1腦膜炎奈瑟氏球菌BASB033多核苷酸序列ATGAATATACGGAATATGCGCTATATCCTTTTGACAGGACTGTTGCCGACGGCATCCGCTTTTGGAGAGACCGCGCTGCAATGCGCCGCTTTGACGGACAATGTTACGCGTTTGGTGTGTTACGACAGGATTTTTGCGGCACAGCTTCCGTCTTCGGCAGGGCAGGAAGGGCAGGAGTCGAAAGCCGTACTCAATCTGACGGAAACCGTCCGCAGCAGCGTGGATAAGGGCGAGGCGGTCATTGTTGTTGAAAAAGGCGGGGATGCGCTTCCTGCCGACAGTGCGGGCGAAACCGCCGACATCTATACGCCTTTGAGCCTGATGTACGACTTGGACAAAAACGATTTGCGCGGGCTGTTGGGCGTACGCGAACACAATCCGATGTACCTTATGCCGCTCTGGTACAACAATTCGCCCAACTATGCCCCGAGTTCGCCGACGCGCGGTACAACTGTACAGGAAAAATTCGGACAGCAGAAACGTGCGGAAACCAAATTGCAGGTTTCGTTCAAAAGCAAAATTGCCGAAGATTTGTTTAAAACCCGCGCGGATCTGTGGTTCGGCTACACCCAAAGATCCGATTGGCAGATTTACAACCAAGGCAGGAAATCCGCGCCGTTCCGCAATACGGATTACAAACCTGAAATTTTCCTGACCCAGCCTGTGAAGGCGGATTTGCCGTTCGGCGGCAGGCTGCGTATGCTCGGTGCGGGTTTTGTCCACCAGTCCAACGGACAGAGCCGTCCCGAATCGCGTTCGTGGAACAGGATTTACGCCATGGCAGGCATGGAATGGGGCAAATTGACGGTGATTCCGCGCGTGTGGGTGCGTGCGTTCGATCAGAGCGGCGATAAAAACGACAATCCCGATATTGCCGACTATATGGGGTATGGCGACGTGAAGCTGCAGTACCGCCTGAACGACAGGCAGAATGTGTATTCCGTATTGCGCTACAACCCCAAAACGGGCTACGGCGCGATTGAAGCCGCCTACACGTTTCCGATTAAGGGCAAACTCAAAGGCGTGGTACGCGGATTCCACGGTTACGGCGAGAGCCTGATCGACTACAACCACAAGCAGAACGGTATCGGTATCGGGTTGATGTTCAACGACTTGGACGGCATCTGASEQ ID NO2從SEQ ID NO1的多核苷酸序列推導(dǎo)出的腦膜炎奈瑟氏球菌BASB033多肽序列MNIRNMRYILLTGLLPTASAFGETALQCAALTDNVTRLVCYDRIFAAQLPSSAGQEGQESKAVLNLTETVRSSLDKGEAVIVVEKGGDALPADSAGETADIYTPLSLMYDLDKNDLRGLLGVREHNPMYLMPLWYNNSPNYAPSSPTRGTTVQEKFGQQKRAETKLQVSFKSKIAEDLFKTRADLWFGYTQRSDWQIYNQGRKSAPFRNTDYKPEIFLTQPVKADLPFGGRLRMLGAGFVHQSNGQSRPESRSWNRIYAMAGMEWGKLTVIPRVWVRAFDQSGDKNDNPDIADYMGYGDVKLQYRLNDRQNVYSVLRYNPKTGYGAIFAAYTFPIKGKLKGVVRGFHGYGESLIDYNHKQNGIGIGLMFNDLDGISEQ ID NO3來自H44/76菌株的腦膜炎奈瑟氏球菌BASB033多核苷酸序列ATGAATATACGGAATCGCTATATTCTTTTGACAGGACTGTTGCCGATGGCATCCGCTTTTGGAGAGACCGCGCTGCAATGCGCCGCTTTGACGGACAATGTTACGCGTTTGGCGTGTTACGACAGGATTTTTGCGGCACAGCTTCCGTCTTCGGCAGGGCAGGAAGGGCAGGAGTCGAAAGCCGTACTCAATCTGACGGAAACCGTCCGCAGCAGCCTGGATAAGGGCGAGGCGGTCATTGTTGTTGAAAAAGGCGGGGATGCGCTTCCTGCCGACAGTGCGGGCGAAACCGCCGACATCTATACGCCTTTGAGCCTGATGTACGACTTGGACAAAAACGATTTGCGCGGGCTGTTGGGCGTACGCGAACACAATCCGATGTACCTTATGCCGCTCTGGTACAACAATTCGCCCAACTATGCCCCGgGTTCGCCGACGCGCGGTACgACTGTACAGGAAAAATTCGGACAGCAGAAACGTGCGGAAACCAAATTGCAGGTTTCGTTCAAAAGCAAAATTGCCGAAGATTTGTTTAAAACCCGCGCGGATCTGTGGTTCGGCTACACCCAAAGATCCGATTGGCAGATTTACAACCAAGGCAGGAAATCCGCGCCGTTCCGCAATACGGATTACAAACCTGAAATTTTCCTGACCCAGCCTGTGAAGGCGGATTTGCCGTTCGGCGGCAGGCTGCGTATGCTCGGTGCGGGTTTTGTCCACCAGTCCAACGGACAGAGCCGTCCCGAATCGCGTTCGTGGAACAGGATTTACGCCATGGCAGGCATGGAATGGGGCAAATTGACGGTGATTCCGCGCGTGTGGGTGCGTGCGTTCGATCAGAGCGGCGATAAAAACGACAATCCCGATATTGCCGACTATATGGGGTATGGCGACGTGAAGCTGCAGTACCGCCTGAACGACAGGCAGAATGTGTATTCCGTATTGCGCTACAACCCCAAAACGGGCTACGGCGCGATTGAAGCCGCCTACACGTTTCCGATTAAGGGCAAACTCAAAGGCGTGGTACGCGGATTCCACGGTTACGGCGAGAGCCTGATCGACTACAACCACAAGCAGAACGGTATCGGTATCGGGTTGATGTTCAACGACTTGGACGGCATCTGASEQ ID NO4從SEQ ID NO3的多核苷酸序列推導(dǎo)出的腦膜炎奈瑟氏球菌BASB033多肽序列MNIRNRYILLTGLLPMASAFGETALQCAALTDNVTRLACYDRIFAAQLPSSAGQEGQESKAVLNLTETVRSSLDKGEAVIVVEKGGDALPADSAGETADIYTPLSLMYDLDKNDLRGLLGVREHNPMYLMPLWYNNSPNYAPGSPTRGTTVQEKFGQQKRAETKLQVSFKSKLAEDLFKTRADLWFGYTQRSDWQIYNQGRKSAPFRNTDYKPEIFLTQPVKADLPFGGRLRMLGAGFVHQSNGQSRPESRSWNRIYAMAGMEWGKLTVIPRVWVRAFDQSGDKNDNPDIADYMGYGDVKLQYRLNDRQNVYSVLRYNPKTGYGAIEAAYTFPIKGKLKGVVRGFHGYGESLIDYNHKQNGIGIGLMFNDLDGISEQ ID NO5GGT CGA CCA TAT GAA TAT ACG GAA TAT GCG CTASEQ ID NO6CGC CGC TCG AGG ATG CCG TCC AAG TCG TTGSEQ ID NO7CGTACCGCATTCCGCACTGCAGTGAAAAAAGTATTGAAAGCAGTCGAAGCAGGCGATAAAGCTGCCGCACAAGCGGTTTACCAAGAGTCCGTCAAAGTCATCGACCGCATCGCCGACAAGGGCGTGTTCCATAAAAACAAAGCGGCTCGCCACAAAACCCGTTTGTCTCAAAAAGTAAAACCTTGGCTTGATTTTTGCAAAACCTGCAATCCGGTTTTCATCGTCGATTCCGAAAACCCCTGAAGCCCGACGGTTTCGGGGTTTTCTGTATTGCGGGGACAAAATCCCGAAATGGCGGAAAGGGTGCGGTTTTTTATCCGAATCCGCTATAAAATGCCGTCTGAAAACCAATATGCCGACAATGGGGGTGGAG保藏的材料包含腦膜炎奈瑟氏球菌血清型B菌株的保藏物，于1997年6月22日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanType CultureCollection)(此處為“ATCC”)登記的保藏號為13090。保藏物被描述為腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)(Albrecht和Ghon)，是從腦膜炎奈瑟氏球菌隔離種群中構(gòu)建的凍干的1.5-2.9kb插入文庫。該保藏物描述于Int.Bull.Bacteriol.Nomencl.Taxon.81-15(1958)。
腦膜炎奈瑟氏球菌菌株保藏物在此處稱為“保藏的菌株”或者“保藏的菌株的DNA”。
保藏的菌株包含全長BASB033基因。如果與此處任何序列的描述發(fā)生沖突的情況下，保藏的菌株中包含的多核苷酸序列，以及其編碼的任何多肽的氨基酸序列是控制的。
根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序目的的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約保藏了保藏的菌株。專利一旦頒布，菌株將不可取消地并且沒有任何限制或者條件對公眾公開。保藏的菌株只是為了方便而提供給那些本領(lǐng)域技術(shù)人員，并不承認(rèn)為了賦予權(quán)利而要求的保藏，例如在35U.S.C.§112中所要求的。
序列表<110>SmithKline Beecham Biologicals S.A.
<120>新化合物<130>BM45331<160>6<170>FastSEQ for Windows Version3.0<210>1<211>1128<212>DNA<213>腦膜炎奈瑟氏球菌<400>1atgaatatac ggaatatgcg ctatatcctt ttgacaggac tgttgccgac ggcatccgct 60tttggagaga ccgcgctgca atgcgccgct ttgacggaca atgttacgcg tttggtgtgt 120tacgacagga tttttgcggc acagcttccg tcttcggcag ggcaggaagg gcaggagtcg 180aaagccgtac tcaatctgac ggaaaccgtc cgcagcagcc tggataaggg cgaggcggtc 240attgttgttg aaaaaggcgg ggatgcgctt cctgccgaca gtgcgggcga aaccgccgac 300atctatacgc ctttgagcct gatgtacgac ttggacaaaa acgatttgcg cgggctgttg 360ggcgtacgcg aacacaatcc gatgtacctt atgccgctct ggtacaacaa ttcgcccaac 420tatgccccga gttcgccgac gcgcggtaca actgtacagg aaaaattcgg acagcagaaa 480cgtgcggaaa ccaaattgca ggtttcgttc aaaagcaaaa ttgccgaaga tttgtttaaa 540acccgcgcgg atctgtggtt cggctacacc caaagatccg attggcagat ttacaaccaa 600ggcaggaaat ccgcgccgtt ccgcaatacg gattacaaac ctgaaatttt cctgacccag 660cctgtgaagg cggatttgcc gttcggcggc aggctgcgta tgctcggtgc gggttttgtc 720caccagtcca acggacagag ccgtcccgaa tcgcgttcgt ggaacaggat ttacgccatg 780gcaggcatgt aatggggcaa attgacggtg attccgcgcg tgtgggtgcg tgcgttcgat 840cagagcggcg ataaaaacga caatcccgat attgccgact atatggggta tggcgacgtg 900aagctgcagt accgcctgaa cgacaggcag aatgtgtatt ccgtattgcg ctacaacccc 960aaaacgggct acggcgcgat tgaagccgcc tacacgtttc cgattaaggg caaactcaaa1020ggcgtggtac gcggattcca cggttacggc gagagcctga tcgactacaa ccacaagcag1080aacggtatcg gtatcgggtt gatgttcaac gacttggacg gcatctga 1128
<210>2<211>375<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌<400>2Met Asn Ile Arg Asn Met Arg Tyr Ile Leu Leu Thr Gly Leu Leu Pro1 5 10 15Thr Ala Ser Ala Phe Gly Glu Thr Ala Leu Gln Cys AIa Ala Leu Thr20 25 30Asp Asn Val Thr Arg Leu Val Cys Tyr Asp Arg Ile Phe Ala Ala Gln35 40 45Leu Pro Ser Ser Ala Gly Gln Glu Gly Gln Glu Ser Lys Ala Val Leu50 55 60Asn Leu Thr Glu Thr Val Arg Ser Ser Leu Asp Lys Gly Glu Ala Val65 70 75 80Ile Val Val Glu Lys Gly Gly Asp Ala Leu Pro Ala Asp Ser Ala Gly85 90 95Glu Thr Ala Asp Ile Tyr Thr Pro Leu Ser Leu Met Tyr Asp Leu Asp100 105 110Lys Asn Asp Leu Arg Gly Leu Leu Gly Val Arg Glu His Asn Pro Met115 120 125Tyr Leu Met Pro Leu Trp Tyr Asn Asn Ser Pro Asn Tyr Ala Pro Ser130 135 140Ser Pro Thr Arg Gly Thr Thr Val Gln Glu Lys Phe Gly Gln Gln Lys145 150 155 160Arg Ala Glu Thr Lys Leu Gln Val Ser Phe Lys Ser Lys Ile Ala Glu165 170 175Asp Leu Phe Lys Thr Arg Ala Asp Leu Trp Phe Gly Tyr Thr Gln Arg180 185 190Ser Asp Trp Gln Ile Tyr Asn Gln Gly Arg Lys Ser Ala Pro Phe Arg195 200 205Asn Thr Asp Tyr Lys Pro Glu Ile Phe Leu Thr Gln Pro Val Lys Ala210 215 220Asp Leu Pro Phe Gly Gly Arg Leu Arg Met Leu Gly Ala Gly Phe Val125 230 235 240Mis Gln Ser Asn Gly Gln Ser Arg Pro Glu Ser Arg Ser Trp Asn Arg245 250 255Ile Tyr Ala Met Ala Gly Met Glu Trp Gly Lys Leu Thr Val Ile Pro260 265 270Arg Val Trp Val Arg Ala Phe Asp Gln Ser Gly Asp Lys Asn Asp Asn275 280 285Pro Asp Ile Ala Asp Tyr Net Gly Tyr Gly Asp Val Lys Leu Gln Tyr290 295 300Arg Leu Asn Asp Arg Gln Asn Val Tyr Ser Val Leu Arg Tyr Asn Pro305 310 315 320Lys Thr Gly Tyr Gly Ala Ile Glu Ala Ala Tyr Thr Phe Pro Ile Lys325 330 335Gly Lys Leu Lys Gly Val Val Arg Gly Phe His Gly Tyr Gly Glu Ser340 345 350Leu Ile Asp Tyr Asn His Lys Gln Asn Gly Ile Gly Ile Gly Leu Met355 360 365Phe Asn Asp Leu Asp Gly Ile370 375<210>3<211>1125<212>DNA<213>腦膜炎奈瑟氏球菌<400>3atgaatatac ggaatcgcta tattcttttg acaggactgt tgccgatggc atccgctttt 60ggagagaccg cgctgcaatg cgccgctttg acggacaatg ttacgcgttt ggcgtgttac 120gacaggattt ttgcggcaca gcttccgtct tcggcagggc aggaagggca ggagtcgaaa 180gccgtactca atctgacgga aaccgtccgc agcagcctgg ataagggcga ggcggtcatt 240gttgttgaaa aaggcgggga tgcgcttcct gccgacagtg cgggcgaaac cgccgacatc 300tatacgcctt tgagcctgat gtacgacttg gacaaaaacg atttgcgcgg gctgttgggc 360gtacgcgaac acaatccgat gtaccttatg ccgctctggt acaacaattc gcccaactat 420gccccgggtt cgccgacgcg cggtacgact gtacaggaaa aattcggaca gcagaaacgt 480gcggaaacca aattgcaggt ttcgttcaaa agcaaaattg ccgaagattt gtttaaaacc 540cgcgcggatc tgtggttcgg ctacacccaa agatccgatt ggcagattta caaccaaggc 600aggaaatccg cgccgttccg caatacggat tacaaacctg aaattttcct gacccagcct 660gtgaaggcgg atttgccgtt cggcggcagg ctgcgtatgc tcggtgcggg ttttgtccac 720cagtccaacg gacagagccg tcccgaatcg cgttcgtgga acaggattta cgccatggca 780ggcatggaat ggggcaaatt gacggtgatt ccgcgcgtgt gggtgcgtgc gttcgatcag 840agcggcgata aaaacgacaa tcccgatatt gccgactata tggggtatgg cgacgtgaag 900ctgcagtacc gcctgaacga caggcagaat gtgtattccg tattgcgcta caaccccaaa 960acgggctacg gcgcgattga agccgcctac acgtttccga ttaagggcaa actcaaaggc 1020gtggtacgcg gattccacgg ttacggcgag agcctgatcg actacaacca caagcagaac1080ggtatcggta tcgggttgat gttcaacgac ttggacggca tctga1123<210>4<211>374<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌<400>4Met Asn Ile Arg Asn Arg Tyr Ile Leu Leu Thr Gly Leu Leu Pro Met1 5 10 15Ala Ser Ala Phe Gly Glu Thr Ala Leu Gln Cys Ala Ala Leu Thr Asp20 25 30Asn Val Thr Arg Leu Ala Cys Tyr Asp Arg Ile Phe Ala Ala Gln Leu35 40 45Pro Ser Ser Ala Gly Gln Glu Gly Gln Glu Ser Lys Ala Val Leu Asn50 55 60Leu Thr Glu Thr Val Arg Ser Ser Leu Asp Lys Gly Glu Ala Val Ile65 70 75 80Val Val Glu Lys Gly Gly Asp Ala Leu Pro Ala Asp Ser Ala Gly Glu85 90 95Thr Ala Asp Ile Tyr Thr Pro Leu Ser Leu Met Tyr Asp Leu Asp Lys100 105 110Asn Asp Leu Arg Gly Leu Leu Gly Val Arg Glu His Asn Pro Met Tyr115 120 125Leu Met Pro Leu Trp Tyr Asn Asn Ser Pro Asn Tyr Ala Pro Gly Ser130 135 140Pro Thr Arg Gly Thr Thr Val Gln Glu Lys Phe Gly Gln Gln Lys Arg145 150 155 160Ala Glu Thr Lys Leu Gln Val Ser Phe Lys Ser Lys Ile Ala Glu Asp165 170 175Leu Phe Lys Thr Arg Ala Asp Leu Trp Phe Gly Tyr Thr Gln Arg Ser180 185 190Asp Trp Gln Ile Tyr Asn Gln Gly Arg Lys Ser Ala Pro Phe Arg Asn195 200 205Thr Asp Tyr Lys Pro Glu Ile Phe Leu Thr Gln Pro Val Lys Ala Asp210 215 220Leu Pro Phe Gly Gly Arg Leu Arg Met Leu Gly Ala Gly Phe Val His225 230 235 240Gln Ser Asn Gly Gln Ser Arg Pro Glu Ser Arg Ser Trp Asn Arg Ile245 250 255Tyr Ala Met Ala Gly Met Glu Trp Gly Lys Leu Thr Val Ile Pro Arg260 265 270Val Trp Val Arg Ala Phe Asp Gln Ser Gly Asp Lys Asn Asp Asn Pro275 280 285Asp Ile Ala Asp Tyr Met Gly Tyr Gly Asp Val Lye Leu Gln Tyr Arg290 295 300Leu Asn Asp Arg Gln Asn val Tyr Ser Val Leu Arg Tyr Asn Pro Lys305 310 315 320Thr Gly Tyr Gly Ala Ile Glu Ala Ala Tyr Thr Phe Pro Ile Lys Gly325 330 335Lys Leu Lys Gly Val Val Arg Gly Phe His Gly Tyr Gly Glu Ser Leu340 345 350Ile Asp Tyr Asn His Lys Gln Asn Gly Ile Gly Ile Gly Leu Met Phe355 360 365Asn Asp Leu Asp Gly Ile370<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物序列<400>5ggtcgaccat atgaatatac ggaatatgcg cta 33<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物序列<400>6cgccgctcga ggatgccgtc caagtcgttg 30<210>7<211>373<212>DNA<213>腦膜炎奈瑟氏球菌<400>7cgtaccgcat tccgcactgc agtgaaaaaa gtattgaaag cagtcgaagc aggcgataaa60gctgccgcac aagcggttta ccaagagtcc gtcaaagtca tcgaccgcat cgccgacaag 120ggcgtgttcc ataaaaacaa agcggctcgc cacaaaaccc gtttgtctca aaaagtaaaa 180ccttggcttg atttttgcaa aacctgcaat ccggttttca tcgtcgattc cgaaaacccc 240tgaagcccga cggtttcggg gttttctgta ttgcggggac aaaatcccga aatggcggaa 300agggtgcggt tttttatccg aatccgctat aaaatgccgt ctgaaaacca atatgccgac 360aatgggggtg gag 37權(quán)利要求
1.一種分離出的多肽，該多肽包含的氨基酸序列與選自SEQ IDNO2，SEQ ID NO4的氨基酸序列有至少85％的同一性。
2.如權(quán)利要求1所述的分離出的多肽，其氨基酸序列與選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4的氨基酸序列有至少95％的同一性。
3.如權(quán)力要求1所述的多肽，該多肽包含選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4的氨基酸序列。
4.分離出的SEQ ID NO2，SEQ ID NO4的多肽。
5.如權(quán)利要求1到4中任一權(quán)利要求所述多肽的免疫原性片段，其中該免疫原性片段的免疫原活性與SEQ ID NO2，SEQ ID NO4的多肽的基本相同。
6.一種分離出的多核苷酸，該多核苷酸包含編碼一種多肽的核苷酸序列，該多肽與SEQ ID NO2，4的氨基酸序列分別就SEQ ID NO2，4而言有至少85％的同一性；或者與該分離出的多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
7.一種分離出的多核苷酸，該多核苷酸包含核苷酸序列，該序列與編碼SEQ ID NO2，4的多肽的核苷酸序列就全部編碼區(qū)域而言有至少85％的同一性；或者與該分離出的多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
8.一種分離出的多核苷酸，該多核苷酸包含核苷酸序列，該序列與SEQ ID NO1，3分別就SEQ ID NO1，3全長而言有至少85％的同一性；或者與該分離出的多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
9.如權(quán)利要求6到8中任一權(quán)利要求所述的分離出的多核苷酸，它與SEQ ID NO1，3有至少95％的同一性。
10.一種分離出的多核苷酸，該多核苷酸包含編碼SEQ ID NO2，SEQ ID NO4的多肽的核苷酸序列。
11.一種分離出的多核苷酸，該多核苷酸包含SEQ ID NO1，SEQID NO3的多核苷酸。
12.一種分離出的多核苷酸，該多核苷酸包含編碼SEQ ID NO2，SEQ ID NO4的多肽的核苷酸序列，該多核苷酸序列是通過在嚴(yán)格雜交條件下，用具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3的序列或者其片段的標(biāo)記探針篩選適當(dāng)?shù)奈膸斓玫降摹?br> 13.一種表達(dá)載體或者活的重組微生物，該載體或者微生物包含依照權(quán)利要求6-12中任一權(quán)利要求的分離出的多核苷酸。
14.包含權(quán)利要求13的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，或者該宿主細(xì)胞表達(dá)分離出的多肽的亞細(xì)胞部分或者膜，所述多肽包含的氨基酸序列與選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4的氨基酸序列有至少85％的同一性。
15.一種生產(chǎn)多肽的方法，所述多肽包含的氨基酸序列與選自SEQID NO2，SEQ ID NO4的氨基酸序列有至少85％的同一性，該方法包括，在足夠該多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞，以及從培養(yǎng)基中回收該多肽。
16.一種表達(dá)權(quán)利要求6-12中任一權(quán)利要求的多核苷酸的方法，該方法包括，用包含至少一種該多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，以及在足夠表達(dá)任一該多核苷酸的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。
17.一種疫苗組合物，該疫苗組合物包含有效量的權(quán)利要求1到5中任一權(quán)利要求的多肽，以及藥物可接受載體。
18.一種疫苗組合物，該疫苗組合物包含有效量的權(quán)利要求6到12中任一權(quán)利要求的多核苷酸，以及藥物有效性載體。
19.按照權(quán)利要求17或者18中任一權(quán)利要求的疫苗組合物，其中該組合物包含至少一種其他的腦膜炎奈瑟氏球菌抗原。
20.一種對如權(quán)利要求1到5中任一權(quán)利要求所述的多肽或者免疫片段有免疫特異性的抗體。
21.一種診斷腦膜炎奈瑟氏球菌感染的方法，包括鑒定出現(xiàn)在生物樣品中的如權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述的多肽，或者對該多肽有免疫特異性的抗體，該樣品來自懷疑具有這種感染的動物。
22.包含免疫有效量的如權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述多肽的組合物在制備用于在動物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的藥物的用途。
23.包含免疫有效量的如權(quán)利要求6-12中任一權(quán)利要求所述多核苷酸的組合物在制備用于在動物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的藥物的用途。
24.一種用于治療有腦膜炎奈瑟氏球菌疾病的人的治療組合物，該組合物包含至少一種抗權(quán)利要求1-5的多肽的抗體，以及合適的藥物載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了BASB033多肽和編碼BASB033多肽的多核苷酸,以及通過重組技術(shù)生產(chǎn)這種多肽的方法。也提供了診斷的、預(yù)防的和治療的用途。
文檔編號A61P31/04GK1326508SQ99813242
公開日2001年12月12日 申請日期1999年9月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月14日
發(fā)明者J·－L·呂勒 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司