專利名稱：一種對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌的its特異的核苷酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)中16S rRNA_23S rRNA基因間區(qū)(Internal transcribed spacer，以下簡(jiǎn)稱ITS)特異的寡核苷酸及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類是腦膜炎奈瑟氏菌的唯一宿主。腦膜炎奈瑟氏菌作為條件致病菌，常存在于患者或帶菌者的鼻咽腔黏膜中，約有5 10%的健康人鼻咽部帶有本菌，流行期高達(dá)20 70%，其排菌時(shí)間可達(dá)數(shù)周至2年。病原菌借飛沫直接由空氣傳播，大部分感染者臨床癥狀不明顯，因此很多感染者成為無(wú)癥狀的攜帶者。在非流行期，發(fā)病率在1/10 3/10萬(wàn)左右， 而在流行期，發(fā)病可高達(dá)500/10萬(wàn)，對(duì)6個(gè)月到2歲的嬰幼兒及青少年危害極大，即使在及時(shí)和適當(dāng)?shù)恼疹櫹?，該病的致死率也?0%到20%甚至超過(guò)50%。大約20%的人群在任何給定時(shí)間都有腦膜炎奈瑟氏菌寄生，無(wú)論是在發(fā)展中國(guó)家或是發(fā)達(dá)國(guó)家均可以引起較高的流腦發(fā)病率和死亡率。流行性腦脊髓膜炎是由腦膜炎奈瑟氏菌引起的急性化膿性腦膜炎，為急性呼吸道傳染病。我國(guó)流腦發(fā)病率有明顯上升的趨勢(shì)，暴發(fā)流行時(shí)有發(fā)生，對(duì)我國(guó)人民的生命健康構(gòu)成極大威脅。主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、嘔吐、皮膚粘膜瘀點(diǎn)、瘀斑及腦膜刺激征，重者可有敗血癥性休克和腦膜腦炎，腦脊液可呈化膿性改變。流行性腦膜炎常見(jiàn)的并發(fā)癥為關(guān)節(jié)炎、硬腦膜下積液或積膿。暴發(fā)性敗血癥的致死率高于流行性腦脊髓膜炎。每年大約有一百萬(wàn)人感染細(xì)菌性腦膜炎，并有20萬(wàn)人因此死亡。54%的幸存者會(huì)留下殘疾，包括失聰， 智力遲鈍、失明、肢體癱瘓、智能及精神改變和腦積水。目前，對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌傳統(tǒng)的診斷主要依靠對(duì)腦脊液的涂片鏡檢、病原體培養(yǎng)、 免疫學(xué)檢查抗原抗體以及從腦脊液、血液中分離培養(yǎng)出腦膜炎奈瑟氏菌。該法確診腦膜炎奈瑟氏菌感染至少需2 3天，其中血清學(xué)鑒定因其靈敏度不夠高，影響因素較多，有時(shí)難于作出可靠診斷，尤其在大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，常因工作量大，檢測(cè)者經(jīng)驗(yàn)不足、情緒波動(dòng)等主觀因素而影響結(jié)果可信度。傳統(tǒng)方法特異性差、靈敏度低且費(fèi)時(shí)。腦膜炎奈瑟菌對(duì)干燥、寒冷、熱、陽(yáng)光等非常敏感，在室溫中3小時(shí)就死亡，同時(shí)受抗生素使用及其他非特異性因素的影響，單獨(dú)采用細(xì)菌培養(yǎng)方法會(huì)導(dǎo)致腦膜炎奈瑟菌漏檢。近年來(lái)，越來(lái)越多的分子技術(shù)用于病原菌的鑒定、檢測(cè)及病害診斷中，包括轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列分析、隨機(jī)擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)性(RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析等。和傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比，這些基于多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的分子檢測(cè)技術(shù)， 不需要經(jīng)過(guò)病原菌的分離、純培養(yǎng)等過(guò)程，而且具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)，是介于16S rRNA和23S rRNA之間的區(qū)域，在幾乎所有細(xì)菌的基因組中都以單拷貝或多拷貝的形式存在，相對(duì)較短(200bp-1000bp)。該區(qū)域進(jìn)化速率較快，具有超變位點(diǎn)，它的變異速率相當(dāng)于16S rRNA或者23S rRNA的十倍左右，在種內(nèi)不同菌株間高度保守，而在細(xì)菌的種間存在著豐富的變化。因此具有很高的分辨率，更易區(qū)分開(kāi)進(jìn)化關(guān)系很近的菌種，大大增強(qiáng)了檢測(cè)的特異性?？梢詾檠芯考?xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育、分類鑒定和分子檢測(cè)提供豐富的遺傳信息。熒光定量PCR法的檢出率高于常規(guī)PCR法，并且具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、 自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。它的技術(shù)更先進(jìn)，操作更便捷，避免常規(guī)PCR反應(yīng)后檢測(cè)的煩瑣步驟，并能達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、絕對(duì)定量的目的。無(wú)論是在陽(yáng)性符合率和陰性符合率上都要優(yōu)于分離培養(yǎng)法和直接涂片法，能檢測(cè)一些不能被培養(yǎng)或者很微量的樣品，對(duì)樣品運(yùn)輸條件也比較寬松。熒光定量PCR法檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏菌具有高靈敏性、高特異性和高精確定量等特點(diǎn)，可為流腦檢查提供一種快速、方便的病原學(xué)診斷手段，具有實(shí)用價(jià)值。該技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的方法有高通量、檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，只需對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單的預(yù)增菌或增菌過(guò)程，再通過(guò)離心及裂解制備細(xì)菌DNA模板，就可以在高特異性引物及探針介導(dǎo)下的熒光定量PCR過(guò)程中擴(kuò)增目標(biāo)序列，發(fā)出熒光信號(hào)，達(dá)到檢測(cè)樣品中是否含有待測(cè)的致病性微生物的目的。熒光定量PCR的擴(kuò)增過(guò)程僅需1個(gè)小時(shí)。 這對(duì)檢驗(yàn)檢疫部門(mén)和臨床檢驗(yàn)無(wú)疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了一種對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌的ITS特異的核苷酸；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該特異核苷酸的應(yīng)用，設(shè)計(jì)引物和探針，通過(guò)優(yōu)化和設(shè)計(jì)，提供一種用于檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏菌的熒光定量PCR試劑盒，并利用該熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏菌的存在。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌的ITS特異的核苷酸，所述核苷酸包含a) SEQ ID NO) 1-3所示的核苷酸序列或者其互補(bǔ)DNA或RNA序列；b)不同于a)但編碼的氨基酸序列與a)所編碼的RNA序列相同的核苷酸序列；c)上述a)或b)中缺失、替換或插入一個(gè)或多個(gè)堿基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌的ITS特異的核苷酸的分離方法包括下述步驟(1)基因組的提?。虎仆ㄟ^(guò)PCR擴(kuò)增腦膜炎奈瑟氏菌中的ITS基因簇；(3)構(gòu)建ITS克隆；(4)對(duì)ITS克隆測(cè)序；(5)核苷酸序列的拼接及分析；(6)特異引物和探針的篩選。上述的核苷酸的應(yīng)用，可將所述核苷酸作為引物和探針用于熒光定量PCR試劑盒或一般PCR試劑盒、作為探針用于雜交反應(yīng)與熒光檢測(cè)，或者用于制造基因芯片或微陣列以檢測(cè)細(xì)菌。其中的SEQ ID NO :1(5，-ACAAATCAAAACGGAAGAATGGA-3，)是上游引 物，SEQ ID NO :2(5，-TCAGCATTTTGTTCTTGGTCAAG-3，)是下游弓丨物，SEQ ID NO: 3 (5，-CAGAATCCATTCAGGGCGACG (A) TCAC-3，，第 21 位為 G/A 簡(jiǎn)并)是探針。上述上游引物SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3均是根據(jù)腦膜炎奈瑟氏菌的tRNA-IA類型ITS設(shè)計(jì)合成的寡核苷酸，位于ITS序列上的287-359堿基位置。該引物可在試管中由DNA聚合酶選擇性的復(fù)制合成介于兩引物之間的DNA區(qū)段(針對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌為73bp靶DNA片段)，可以將極其微量的(lpg DNA)目的基因在較短的時(shí)間內(nèi)(1 小時(shí))擴(kuò)增到熒光檢測(cè)可區(qū)分的水平。上述熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒包括如下試劑25mM MgCl2 50 μ 1 ；IOmM dNTP10 μ 1 ；IOX酶特異性反應(yīng)緩沖液50 μ 1 ；5υ/μ 1耐熱DNA聚合酶5μ 1 ；引物和探針各 10 μ 1 ；陽(yáng)性對(duì)照品10 μ 1，陰性對(duì)照品10 μ 1 ；超純水1ml。本發(fā)明還涉及上述的熒光定量PCR試劑盒在檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏菌中的應(yīng)用。上述針對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，整個(gè)檢測(cè)步驟包括樣品預(yù)處理_擴(kuò)增_觀察結(jié)果。引物、探針和熒光定量PCR反應(yīng)體系所需要的試劑已預(yù)先加入擴(kuò)增管中，使用者只需將預(yù)處理后的樣本加入擴(kuò)增管啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)即可，簡(jiǎn)單快速的完成檢測(cè)工作。使用上述的熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法包括以下步驟(1)提取待測(cè)臨床樣品模板； (2)在8聯(lián)PCR薄壁管中加入dNTP、MgCl2UOX酶特異性反應(yīng)緩沖液、rTaq聚合酶、引物、探針、待測(cè)樣品模板和超純水，混勻；(3)將8聯(lián)薄壁PCR管中混勻的混合物在熒光定量PCR儀上擴(kuò)增；(4)記錄結(jié)果，分析并進(jìn)行結(jié)果判斷。上述步驟(1)中的臨床樣品模板為是臨床樣品中的腦脊液、血液或皮膚出血斑內(nèi)容物或帶菌者的鼻咽拭子標(biāo)本粗提液，或是腦膜炎奈瑟氏菌的純培養(yǎng)物的粗提液，或是純 DNA,或者是陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品。上述步驟(1)中的臨床樣品模板的提取方法為(1)取培養(yǎng)物1. 5ml，在12000rpm條件下常溫離心5分鐘，去掉上清液；(2)取500 μ 1的超純水重懸沉淀，在12000rpm條件下常溫離心5分鐘，去掉上清液，控干；(3)取100 μ 1超純水重懸沉淀，在100°C沸水中水浴10分鐘；(4) 12000rpm條件下離心10分鐘；(5)取5 μ 1中層上清做為熒光定量PCR反應(yīng)的模板。上述步驟(3)中的熒光定量PCR儀上的反應(yīng)循環(huán)參數(shù)包括DNA的變性、復(fù)性、延伸的溫度和時(shí)間、循環(huán)次數(shù)，具體為前期為使變性能夠達(dá)到所需溫度而必需的前期處理過(guò)程的一個(gè)循環(huán)為95°C，2分鐘；變性溫度和時(shí)間為95 °C，15秒；復(fù)性和延伸溫度和時(shí)間為60°C，60秒；變性、復(fù)性、延伸的循環(huán)次數(shù)為40個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后直接觀察反應(yīng)示意圖即可得到檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明通過(guò)配制一種可檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏菌的可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的熒光定量PCR試劑盒，將熒光定量PCR檢測(cè)方法需要使用的組分組合在一起，使用時(shí)，提取待測(cè)樣品，同時(shí)經(jīng)過(guò)較為簡(jiǎn)單的操作程序就可以進(jìn)行快速、靈敏、簡(jiǎn)便的檢測(cè)、試劑盒中各組分的用量和濃度均為試驗(yàn)所得，用該試劑盒檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏菌僅需一臺(tái)電腦和一臺(tái)熒光定量PCR儀， 操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本較低。使用陽(yáng)性和陰性對(duì)照品的目的是用于質(zhì)控整個(gè)操作過(guò)程，以便得出準(zhǔn)確的判斷。 若含有腦膜炎奈瑟氏菌，則從結(jié)果中可以觀察到與陽(yáng)性對(duì)照品一樣在35個(gè)循環(huán)以前起峰；若不含有腦膜炎奈瑟氏菌，則與陰性對(duì)照品一樣不起峰。本發(fā)明一次檢測(cè)試驗(yàn)所使用的實(shí)際盒中的試劑量為引物探針各0.5 μ 1，IOmM dNTPO. 5μ Ι,ΙΟΧ酶特異性反應(yīng)緩沖液2. 5μ 1，5υ/μ 1耐熱DNA聚合酶0. 3 μ 1，25mM MgCl22. 5 μ 1，余下的體積在除去5 μ 1待測(cè)樣品的量后用超純水補(bǔ)足至25 μ 1。本發(fā)明中的耐熱DNA聚合酶為rTaq聚合酶。上述的陽(yáng)性對(duì)照品為已確定是腦膜炎奈瑟氏菌的樣品，陰性對(duì)照品則為經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確定不是腦膜炎奈瑟氏菌的樣品，如大腸桿菌。本熒光定量PCR試劑盒若用腦膜炎奈瑟氏菌的菌懸液進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，與經(jīng)提取得到的DNA作為模板反應(yīng)所得結(jié)果一致。敏感度和特異性無(wú)差別，這樣，可省去模板 DNA的提取步驟，使操作方法得以簡(jiǎn)化。同時(shí)，相比常規(guī)微生物檢測(cè)方法而言，本方法所采用的待測(cè)樣品可以直接是臨床樣品培養(yǎng)液，或者對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單分離培養(yǎng)就可進(jìn)行檢測(cè)，因而節(jié)省了人力物力。本發(fā)明公開(kāi)的對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌(簡(jiǎn)稱ITS)特異的寡核苷酸及其應(yīng)用與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)實(shí)用性強(qiáng)本發(fā)明所配制的熒光定量PCR試劑盒配制方法簡(jiǎn)便，檢測(cè)周期短、速度快，可操作性強(qiáng)，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，而檢測(cè)成本卻相對(duì)較低，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣。(2)準(zhǔn)確性高本發(fā)明通過(guò)對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌及奈瑟氏菌屬內(nèi)其他6個(gè)種的ITS克隆、測(cè)序并進(jìn)行序列比對(duì)，找到腦膜炎奈瑟氏菌ITS的特異區(qū)，設(shè)計(jì)出引物及探針，能夠直接將腦膜炎奈瑟氏菌和其近源菌種分開(kāi)。本發(fā)明者對(duì)15株腦膜炎奈瑟氏菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株、20株奈瑟氏菌屬其他菌株以及6株近緣標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行了擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的檢測(cè)方法的準(zhǔn)確率高達(dá) 100%。(3)靈敏度高本發(fā)明提供的腦膜炎奈瑟氏菌檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法具有相當(dāng)高的敏感性，檢測(cè)精度高，可以檢測(cè)到Ipg/μ 1的DNA模板。


圖1為腦膜炎奈瑟氏菌種屬間特異性的檢測(cè)峰圖，其中起峰的樣品為腦膜炎奈瑟氏菌其中一株標(biāo)準(zhǔn)株，其他不起峰的樣品為表2中所列各其他非腦膜炎奈瑟氏菌的菌株。圖2為腦膜炎奈瑟氏菌種內(nèi)保守性的檢測(cè)峰圖。其中不起峰者為陰性對(duì)照，其余為腦膜炎奈瑟氏菌各標(biāo)準(zhǔn)株。圖3為熒光定量P CR試劑盒檢測(cè)結(jié)果峰圖，其中4條起峰帶為腦膜炎奈瑟氏菌，其余兩條未起峰帶為非腦膜炎奈瑟氏菌的其他菌株。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York =Cold Spring HarborLaboratoryPress, 1989)中所述的條件。實(shí)施例1 基因組的提取 使用血平板或巧克力平板37°C過(guò)夜培養(yǎng)腦膜炎奈瑟氏菌，收集細(xì)菌。用500ul 50mMTris-HCl (pH8. 0)和 1Oul 0. 4M EDTA 重懸細(xì)胞，37 °C 溫育 20 分鐘，然后加入 IOul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10% SDS, 50°C溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNaSe，65°C溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清液，再用等體積的酚氯仿異戊醇(25 24 1)溶液抽提兩次，取上清液，再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚。上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA 并用70%乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ul TE中?；蚪MDNA通過(guò)0. 4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。實(shí)施例2 通過(guò)PCR擴(kuò)增腦膜炎奈瑟氏菌中的ITS以腦膜炎奈瑟氏菌的基因組為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增其ITS。首先根據(jù)ITS—端的 16SrRNA基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)上游引物(5，-TGT ACA CAC CGC CCG TC-3，見(jiàn)序列表1)，再根據(jù)23S rRNA基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)下游引物(5’_GGT ACT TAG ATG TTT CAG TTC-3’見(jiàn)序列表 1)。PCR反應(yīng)程序如下在94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C 延伸1分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后，在72°C繼續(xù)延伸5分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0. 8 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性。合并3管PCR產(chǎn)物，并用上海生工生物工程技術(shù)公司的UNIQ-IO柱式DNA膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物條帶；實(shí)施例3 構(gòu)建ITS克隆首先是連接產(chǎn)物的獲得將PCR純化產(chǎn)物與Promega公司的3 X 1O"3的pGEM-T-Easy載體于16°C連接24小時(shí)，總體積為IOy 1，其中有1μ 1的IOXbuffer和0. 5單位的T4DNA連接酶，得到連接產(chǎn)物。其次是感受態(tài)細(xì)胞的制備參照Bio-Rad公司提供的方法制備大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。取一環(huán)大腸桿菌DH5 α單菌落于5ml的LB培養(yǎng)基中，180rpm培養(yǎng)10小時(shí)后，取2ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到200ml 的LB培養(yǎng)基中，37°C 250rpm劇烈振蕩培養(yǎng)到0D6000. 5左右，然后冰浴冷卻20分鐘，于 40C 4000rpm離心15分鐘。傾盡上清液，用冷的冰預(yù)冷的去離子滅菌水200ml吹散菌體，于 40C 4000rpm離心15分鐘。再用冷的冰預(yù)冷的去離子滅菌水IOOml吹散菌體，于4°C 4000rpm 離心15分鐘。用冷的冰預(yù)冷的10%的甘油懸浮細(xì)胞，4°C 6000rpm離心10分鐘，棄上清液， 最后沉淀用Iml冰預(yù)冷的10%的甘油懸浮細(xì)胞，即為感受態(tài)細(xì)胞。將制得的感受態(tài)細(xì)胞分裝為60ul —管，-70°C保存。最后是電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞取2_3ul連接產(chǎn)物與60ul感受態(tài)大腸桿菌DH5 α混合后，轉(zhuǎn)到Bio-Rad公司的 0. 2cm的電擊杯中電擊，電壓為2. 5千伏，時(shí)間為5. O毫秒-6. O毫秒。電擊后立即在杯中加入Iml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇。然后立即將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB 固體培養(yǎng)基上37°C倒置過(guò)夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落。將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群即為腦膜炎奈瑟氏菌的ITS克隆。
實(shí)施例4 對(duì)ITS克隆測(cè)序挑選有插入片段8個(gè)克隆由用ABI3730型DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段雙向進(jìn)行測(cè)序，從而獲得含tRNA-IA基因的ITS的序列。實(shí)施例5 特異引物及探針的篩選針對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌ITS的特異區(qū)設(shè)計(jì)引物及探針；在特異區(qū)設(shè)計(jì)上下游引物及探針(上游引物是5，-ACAAATCAAAACGGAAGAATGGA-3，，見(jiàn)序列SEQ ID NO 1 ；下游引物是 5，-TCAGCATTTTGTTCTTGGTCAAG-3，，見(jiàn)序列 SEQ ID NO :2，探針是 5，-CAGAATCCATTCAGGGCGACG(A)TCAC-3，，見(jiàn)序列 SEQ ID NO :3)。我們收集了 15 株腦膜炎奈瑟氏菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株、20株奈瑟氏菌屬其他菌株以及6株近緣標(biāo)準(zhǔn)株驗(yàn)證引物的特異性， 菌株編號(hào)和來(lái)源見(jiàn)表2。以這41個(gè)菌株的基因組為模板進(jìn)行熒光定量PCR，體系為IOuM引物及探針 0. 5ul、25mM MgCl22. 5ul UO X buffer 2. 5ul、10mM dNTP 0. 5ul、5U/ulrTaq 聚合酶0. 3ul及5ul的待測(cè)樣品模板到0. 2ml的8聯(lián)薄壁PCR管中，最后用超純水補(bǔ)足至25ul。 引物及探針在腦膜炎奈瑟氏菌標(biāo)準(zhǔn)株中得到陽(yáng)性結(jié)果，其他菌株沒(méi)有起峰，所以該寡核苷酸對(duì)腦膜炎奈瑟 氏菌及其ITS都是高度特異的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1及圖2。所用引物序列見(jiàn)表 1，所用菌株見(jiàn)表2。表 權(quán)利要求
1.一種對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌的ITS特異的核苷酸，所述核苷酸包含a)SEQ ID NO :1_3所示的核苷酸序列或者其互補(bǔ)DNA或RNA序列；b)不同于a)但編碼的氨基酸序列與a)所編碼的RNA序列相同的核苷酸序列；c)上述a)或b)中缺失、替換或插入一個(gè)或多個(gè)堿基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。
2.—種權(quán)利要求1所述的對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌的ITS特異核苷酸的分離方法包括下述步驟(1)基因組的提??；(2)通過(guò)PCR擴(kuò)增腦膜炎奈瑟氏菌中的ITS基因簇；(3)構(gòu)建ITS 克?。?4)對(duì)ITS克隆測(cè)序；(5)核苷酸序列的拼接及分析；(6)特異引物和探針的篩選。
3.權(quán)利要求1所述的對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌的ITS特異的核苷酸作為引物和探針用于熒光定量PCR試劑盒或一般PCR試劑盒或作為探針用于雜交反應(yīng)與熒光檢測(cè)或用于制造基因芯片或微陣列以檢測(cè)細(xì)菌方面的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中的熒光定量PCR試劑盒，包括引物、探針、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶；所述的熒光定量PCR引物和探針包括1)SEQID NO :1、SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 所示的核苷酸序列；2)不同于1)但編碼的氨基酸序列與1)所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；3)上述幻或幻中缺失、替換或插入一個(gè)或多個(gè)堿基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒包括如下試劑25mM MgCl250 μ 1 ；IOmM dNTP 10 μ 1 ；IOX酶特異性反應(yīng)緩沖液50 μ 1 ;5U/ μ 1耐熱DNA聚合酶 5 μ 1 ；引物和探針各10 μ 1 ；陽(yáng)性對(duì)照品10 μ 1，陰性對(duì)照品10 μ 1 ；超純水lml。
6.一種含有對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌ITS特異的核苷酸的熒光定量PCR試劑盒在檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏菌中的應(yīng)用。
7.—種檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法包括以下步驟(1)提取待測(cè)臨床樣品模板；(2)在8聯(lián)PCR薄壁管中加入dNTP、MgCl2、10X酶特異性反應(yīng)緩沖液、rTaq聚合酶、引物、探針、待測(cè)樣品模板和超純水，混勻；(3)將8聯(lián)薄壁PCR管中混勻的混合物在熒光定量PCR儀上擴(kuò)增；(4)記錄結(jié)果，分析并進(jìn)行結(jié)果判斷；其中上述步驟(1)中的臨床樣品模板為是臨床樣品中的腦脊液、血液或皮膚出血斑內(nèi)容物或帶菌者的鼻咽拭子標(biāo)本粗提液或是腦膜炎奈瑟氏菌的純培養(yǎng)物的粗提液或是純 DNA，或者是陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品；上述步驟(3)中的熒光定量PCR儀上的反應(yīng)循環(huán)參數(shù)包括DNA的變性、復(fù)性、延伸的溫度和時(shí)間、循環(huán)次數(shù)，具體為前期為使變性能夠達(dá)到所需溫度而必需的前期處理過(guò)程的一個(gè)循環(huán)為95°C，2分鐘；變性溫度和時(shí)間為95°C，15秒；復(fù)性和延伸溫度和時(shí)間為60°C，60秒；變性、復(fù)性、延伸的循環(huán)次數(shù)為40個(gè)循環(huán)；待反應(yīng)結(jié)束后直接觀察反應(yīng)示意圖即可得到檢測(cè)結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)中16S rRNA-23S rRNA基因間區(qū)(Internal transcribed spacer，簡(jiǎn)稱ITS)特異的寡核苷酸SEQ ID NO1-SEQ ID NO3及其應(yīng)用，并提供了一種用本發(fā)明的寡核苷酸為引物及探針的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，利用該熒光定量PCR試劑盒對(duì)人體及環(huán)境中的腦膜炎奈瑟氏菌進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)便快速、特異性好、靈敏度高，可用于食品和臨床樣品的監(jiān)督和檢測(cè)、食物中病原菌檢測(cè)、細(xì)菌學(xué)分類及流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域，具有深遠(yuǎn)的社會(huì)效益和較大的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102154466SQ20111000482
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月11日
發(fā)明者何欣, 孫亞民, 曹勃陽(yáng), 王敏, 王磊 申請(qǐng)人:天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司