專利名稱：一種快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及華支睪吸蟲(chóng)的檢測(cè)方法，特別是一種快速檢 測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
華支睪吸蟲(chóng)病(Clonorchiasis sinensis)又稱肝吸蟲(chóng)病，是由華支睪吸蟲(chóng)寄生在 人的肝膽管內(nèi)所引起的肝膽病變?yōu)橹鞯囊环N食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病。曾在中國(guó)、日本、韓 國(guó)、菲律賓、新加坡和馬來(lái)西亞、俄羅斯等國(guó)有華支睪吸蟲(chóng)感染的報(bào)道。近年來(lái)，由于食物的 多樣化和國(guó)外飲食習(xí)慣的引入，本病在我國(guó)的感染率逐步增高，人群感人率從1 30%不 等。根據(jù)全國(guó)首次寄生蟲(chóng)病調(diào)查表明，全國(guó)感染率平均為0. 356%,以此推算，全國(guó)大約有 470萬(wàn)感染者。其主要原因是食生魚(yú)的習(xí)慣所致。據(jù)1988年的調(diào)查資料表明，黑龍江佳木 斯地區(qū)的麥穗魚(yú)感染率也為100% ；臺(tái)灣省日月潭地區(qū)，麥穗魚(yú)、克氏鰷魚(yú)感染華支睪吸蟲(chóng) 囊蚴的感染率高達(dá)100%。華支睪吸蟲(chóng)囊蚴主要分布在魚(yú)體的各個(gè)部分，如肌肉、頭、皮、鰭 及鱗等，一般以魚(yú)肉及魚(yú)頭肉最多。除淡水魚(yú)外，淡水蝦，如細(xì)足米蝦(Caridina nilotica gracilipes)、巨掌沼蝦(Macrobrachium superbum)等也有囊蚴寄生，因此，水產(chǎn)品、特別是 淡水魚(yú)中囊蚴的檢測(cè)已經(jīng)成為食品安全的首要問(wèn)題。華支睪吸蟲(chóng)囊蚴呈橢圓形(如圖1所示)，大小92μπι ΙΙΟμ ΧΙΟΟμπι
140 μ m,囊壁分兩層，外壁較厚，內(nèi)壁較薄。囊內(nèi)有一幼蟲(chóng)，幼蟲(chóng)具口、腹吸盤、腸管和含黑色 鈣質(zhì)顆粒的排泄囊。當(dāng)人體感染華支睪吸蟲(chóng)囊蚴后，可引起機(jī)體消化不良、腹瀉、腹痛、肝劇痛、肝腫 大、消瘦、侏儒癥。在患者晚期可并發(fā)阻塞性黃疸、膽絞痛、膽管炎、膽囊炎及原發(fā)性膽管性 肝癌。吸蟲(chóng)囊蚴直接威脅著人民的飲食安全，因此，需要一種快速、敏感、簡(jiǎn)單的檢測(cè)淡水魚(yú) 中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴方法尤顯十分迫切和必須。FTA技術(shù)包含一種包埋在過(guò)濾基質(zhì)中的蛋白質(zhì)變性劑、螯合劑和自由基捕捉劑的 特殊干燥化學(xué)試劑混合物。它對(duì)人無(wú)毒，用FTA技術(shù)收集的核酸可以在室溫和高濕度環(huán)境 下保存多年而不降解。FTA卡的工作原理是樣品中感染性病原體在接觸FTA時(shí)裂解失活，病 原體中的核酸則被固定下來(lái)。通過(guò)簡(jiǎn)單的一步，從卡上純化洗脫下來(lái)DNA就可以應(yīng)用于下 游擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。FTA技術(shù)具有①節(jié)省低溫運(yùn)輸樣品以及保存樣品的低溫冰箱的成本。②使有 機(jī)體快速失活，避免了操作過(guò)程中樣品污染的風(fēng)險(xiǎn)。③處理樣品、分離得到DNA僅需15-30 分鐘，縮短、減少分離的步驟(4-16小時(shí))。④樣品處理只需一個(gè)簡(jiǎn)單的洗脫DNA的過(guò)程，省 去了使用純化試劑盒的花費(fèi)。⑤樣品需求量最小化(每個(gè)樣品采集區(qū)12-40 μ 1)因此，已 廣泛的用于病毒、微生物、寄生蟲(chóng)等生物DNA的提取。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的方法及其試劑 盒，所述的這種快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的方法及其試劑盒要解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的方法復(fù)雜而且靈敏度不高的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的方法，包括一個(gè)對(duì)離體的 淡水魚(yú)樣品處理的步驟、一個(gè)提取樣品DNA的步驟、一個(gè)對(duì)樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟 和一個(gè)對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳觀察的步驟；在所述的對(duì)離體的淡水魚(yú)樣品處理的步驟 中，將待檢測(cè)的樣品加入緩沖液玻璃株勻漿打碎，然后吸取勻漿液滴在FTA卡上；在所述的 提取樣品DNA的步驟中，將FTA卡自然干燥，然后將FTA卡用FTA卡洗液洗滌；在所述的對(duì) 樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟中，將洗滌后的FTA卡晾干后放入PCR反應(yīng)管中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增采用的上游引物為CGAGGGTCGGCTTATAAAC，下游引物為GGAAAGTTAAGCACCGACC， 然后對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳并觀察。進(jìn)一步的，還包括一個(gè)對(duì)陽(yáng)性的對(duì)照品進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增的步驟，所述的陽(yáng) 性的對(duì)照品為華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)或者囊蚴。進(jìn)一步的，在所述的對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳觀察的步驟中，將待檢測(cè)的樣品 的電泳條帶和陽(yáng)性對(duì)照的電泳條帶進(jìn)行比較，如果擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為3Mbp，則表示樣品中 含有華支睪吸蟲(chóng)囊蚴，反之，則表示樣品中不含有華支睪吸蟲(chóng)囊蚴。進(jìn)一步的，在所述的對(duì)樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟中，將FTA卡裁剪后放入 PCR反應(yīng)管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。進(jìn)一步的，所述的FTA卡洗液為由Tri s-HCl和EDTA組成的水溶液，所述的 Tris-HCl在FTA卡洗液中的濃度為0. 01mol/L,所述的EDTA在FTA卡洗液中的濃度為 0. lmmol/L, pH 為 8. 0。進(jìn)一步的，所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為2XTaq PCR Master Mix50 μ L, 1 % BSA 4 μ L, 10 μ mol/L上游引物和下游引物分別為3 μ L，ddH2040 μ L。進(jìn)一步的，PCR反應(yīng)條件是94°C預(yù)變性:3min ；94°C變性lmin，62°C退火lmin，72°C 延伸Imin, 40個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin0本發(fā)明還提供了一種快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的試劑盒，所述的試劑盒 含有檢測(cè)引物CSl和檢測(cè)引物CS2，所述的CSl的序列為CGAGGGTCGGCTTATAAAC，所述的CS2 的序列為 GGAAAGTTAAGCACCGACC。進(jìn)一步的，還含有陽(yáng)性對(duì)照品，所述的陽(yáng)性對(duì)照品為華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)或者囊蚴的樣品。進(jìn)一步的，所述的試劑盒中還含有PCR反應(yīng)液，本發(fā)明的工作原理是本發(fā)明首先采用FTA法快速的提取待檢測(cè)樣品中的DNAJf 提取的DNA PCR擴(kuò)增，然后將陽(yáng)性對(duì)照品和待檢測(cè)樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，觀察電泳的長(zhǎng) 度，如果擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為3Kbp，則表示樣品中含有華支睪吸蟲(chóng)囊蚴，反之，則表示樣品中 不含有華支睪吸蟲(chóng)囊蚴。本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比，其效果是積極和明顯的。本發(fā)明提供了快速檢測(cè)淡水魚(yú) 中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴方法，用本發(fā)明的方法能檢測(cè)到每g淡水魚(yú)中1個(gè)吸蟲(chóng)囊蚴，定量PCR技 術(shù)能區(qū)分淡水魚(yú)中3種不同的囊蚴，具有簡(jiǎn)便、快速且敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，適宜食品安全、海 關(guān)防疫檢驗(yàn)。


圖1是華支睪吸蟲(chóng)囊蚴就剖鏡下囊蚴形態(tài)鑒定圖。圖2是本發(fā)明的一種快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的方法的流程圖。④「圖3是淡水魚(yú)中檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的電泳比較圖。圖中“1”表示1克樣品 中含ι個(gè)華支睪囊蚴，“3”表示1克樣品中含3個(gè)華支睪囊蚴，依次類推。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明采用的試劑為FTA卡(Whatman公司)；FTA卡洗液TE buffer :0. Olmol/ L Tris-HCl, pH 8. 0 ；0. lmmol/L EDTA, (Whatman 公司)；TAE 電泳緩沖液(購(gòu)自上海生 工生物制品有限公司)(儲(chǔ)備液50X):撲化堿對(duì)28、冰醋酸57. lmL、0.5mol/L EDTA(pH 8. 0) lOOmL，用蒸餾水定容至1，OOOmL，混勻，室溫保存，使用時(shí)取2mL 50 X TAE電泳緩沖液， 稀釋為200mL工作液(0. 5X)即可。水PCR用水符合GB/T 6682中一級(jí)水的規(guī)格并用DEPC 水處理；2XTaq PCR Master Mix(含有 0. IU Taq 聚合酶/L、500mol/L dNTPeach、20mmol/ L Tris-HCl (pH8. 3) UOOmmol/L KCl、3mmol/L MgCL2、其它穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑，(購(gòu)自上海生 工生物制品有限公司)；marker2000(takara公司)；0. lmmol/L EDTA (pH 8.0)(購(gòu)自上海生 工生物制品有限公司)。實(shí)施例本發(fā)明的一種快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的方法1.魚(yú)肉樣品DNA的提取將魚(yú)去鯪后，取背、尾鰭部肌肉，稱取魚(yú)肉1克，再加入PH 8. 0緩沖液(0. lmmol/L EDTA)用細(xì)玻璃珠勻漿打碎，吸取勻漿液20 μ L滴在FTA卡上，自然干燥(或56°C 5min)后 直接提取DNA，用打孔機(jī)打孔制的一張直徑6mm的濾膜片，用FTA卡洗液洗3次，每次5min， 涼干后剪碎濾紙片于PCR反應(yīng)管中，以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2. PCR檢測(cè)步驟PCR擴(kuò)增總體積為100 μ L0反應(yīng)體系為DNA模板剪碎(制好的直徑6mmFTA濾 膜片一片)，2XTaq PCR Master Mix 50 μ L ； 1 % BSA 4 μ L ;10 μ mol/L 弓|物各 3 μ L ;ddH20 40 μ L，擴(kuò)增采用的上游引物為CGAGGGTCGGCTTATAAAC，下游引物為GGAAAGTTAAGCACCGACC。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性:3min；94°C變性 lmin，62°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，40 個(gè) 循環(huán)；72°C延伸IOmin。3.電泳擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為3Kbp。瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物是否有特征條帶(采 用溴化乙錠顯色)。如果擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為3Kbp，則表示樣品中含有華支睪吸蟲(chóng)囊蚴，反之，則表示 樣品中不含有華支睪吸蟲(chóng)囊蚴。(如圖3所示)實(shí)施例2傳統(tǒng)的試劑盒法試劑盒法主要步驟是1.將超凈臺(tái)酒精消毒，紫外滅菌；鑷子和剪刀滅菌；取滅菌1. 5ml離心管，加入蟲(chóng) 體(或囊蚴)，反復(fù)用單蒸水充分水洗，最后將洗液棄去。2.預(yù)先調(diào)好恒溫器55攝氏度；樣品管加入=Nuclei lysis solution 200微升; 0.5M EDTA (PH8. 0 50 微升；Proteinase K U0mg/ml) 20 微升；RNase A Solution (4mg/ml)5微升。3.放入55攝氏度加熱16-18小時(shí)，加入250微升lysis Buffer，漩渦震蕩，馬上 移入minicolumns中(預(yù)先準(zhǔn)備好)。4. 13000轉(zhuǎn)，離心，3分鐘30秒，倒掉收集管中的液體，將柱子重新放回收集管。5.加入 650 微升 wizard SV wash solution, 13000 轉(zhuǎn)離心 1 分 40 秒，棄去廢液， 13000轉(zhuǎn)離心，2分30秒。6.將柱子移入新的1. 5ml離心管，加入30微升Nuclease-Free Water,室溫放2 分鐘。7. 13000轉(zhuǎn)離心1分鐘30秒，離心后加入30微升Nuclease-Free Water,室溫放 2分鐘。8.再離心13000轉(zhuǎn)，2分30秒，去掉微型柱，離心管內(nèi)液體為所需的DNA。9.然后進(jìn)行擴(kuò)增和電泳，如果擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為3Kbp，則表示樣品中含有華支 睪吸蟲(chóng)囊蚴，反之，則表示樣品中不含有華支睪吸蟲(chóng)囊蚴(如圖3所示)。由圖3可知，試劑盒法和FTA法的結(jié)果是一致的，但是傳統(tǒng)的試劑盒法處理樣品、 分離得到DNA時(shí)間比較長(zhǎng)，而且步驟繁瑣，花費(fèi)也比較高。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的方法，包括一個(gè)對(duì)離體的淡水魚(yú)樣品處 理的步驟、一個(gè)提取樣品DNA的步驟、一個(gè)對(duì)樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟和一個(gè)對(duì)PCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳觀察的步驟；其特征在于在所述的對(duì)離體的淡水魚(yú)樣品處理的步驟 中，將待檢測(cè)的樣品加入緩沖液用玻璃株勻漿打碎，然后吸取勻漿液滴在FTA卡上，在所述 的提取樣品DNA的步驟中，將FTA卡自然干燥，然后將FTA卡用FTA卡洗液洗滌，在所述的 對(duì)樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟中，將洗滌后的FTA卡晾干后放入PCR反應(yīng)管中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增采用的上游引物為CGAGGGTCGGCTTATAAAC，下游引物為GGAAAGTTAAGCACCGACC， 然后對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳并觀察。
2.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的方法，其特征在于還包 括一個(gè)對(duì)陽(yáng)性的對(duì)照品進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增的步驟，所述的陽(yáng)性的對(duì)照品為華支睪吸 蟲(chóng)成蟲(chóng)或者囊蚴。
3.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的方法，其特征在于在所 述的對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳觀察的步驟中，將待檢測(cè)的樣品的電泳條帶和陽(yáng)性對(duì)照的 電 泳條帶進(jìn)行比較，如果擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為3Mbp，則表示樣品中含有華支睪吸蟲(chóng)囊蚴，反 之，則表示樣品中不含有華支睪吸蟲(chóng)囊蚴。
4.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的方法，其特征在于在所 述的對(duì)樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟中，將FTA卡裁剪后放入PCR反應(yīng)管中進(jìn)行PCR擴(kuò) 增。
5.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的方法，其特征在于所述 的FTA卡洗液為由Tris-HCl和EDTA組成的水溶液，所述的Tris-HCl在FTA卡洗液中的濃 度為0. 01mol/L,所述的EDTA在FTA卡洗液中的濃度為0. lmmol/L, pH為8. 0。
6.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的方法，其特征在于所述 的 PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為 JXiTaq PCR Master Mix 50μ L, 1% BSA 4 μ L，10 μ mol/L 上游 引物和下游引物分別為3 μ L，ddH20 40 μ L。
7.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的方法，其特征在于PCR反 應(yīng)條件是94°C預(yù)變性:3min ；94°C變性lmin，62°C退火lmin，72°C延伸Imin，40個(gè)循環(huán)；72°C 延伸lOmin。
8.一種快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒中含 有檢測(cè)引物CSl和檢測(cè)引物CS2，所述的CSl的序列為CGAGGGTCGGCTTATAAAC，所述的CS2 的序列為 GGAAAGTTAAGCACCGACC。
9.如權(quán)利要求8所述的快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的試劑盒，其特征在于還 含有陽(yáng)性對(duì)照品，所述的陽(yáng)性對(duì)照品為華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)或者囊蚴的樣品。
10.如權(quán)利要求8所述的快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的試劑盒，其特征在于所 述的試劑盒中還含有PCR反應(yīng)液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的方法，包括一個(gè)對(duì)離體的淡水魚(yú)樣品處理的步驟；一個(gè)提取樣品DNA的步驟；一個(gè)對(duì)樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟；一個(gè)對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳觀察的步驟；在一個(gè)對(duì)淡水魚(yú)樣品處理的步驟中，將待檢測(cè)的樣品加入緩沖液勻漿用玻璃珠打碎，然后吸取勻漿液滴在FTA卡上；在一個(gè)提取樣品DNA的步驟中，將FTA卡自然干燥，然后將FTA卡用PTA卡洗液洗滌。本發(fā)明還提供了一種快速檢測(cè)淡水魚(yú)中華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的試劑盒，用本發(fā)明的方法能檢測(cè)到每g淡水魚(yú)中1個(gè)吸蟲(chóng)囊蚴，定量PCR技術(shù)能區(qū)分淡水魚(yú)中3種不同的囊蚴，具有簡(jiǎn)便、快速且敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，適宜食品安全、海關(guān)防疫檢驗(yàn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102146446SQ20111000477
公開(kāi)日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2011年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月11日
發(fā)明者張永年, 李樹(shù)清, 艾琳, 陳家旭, 陳韶紅 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所