專利名稱：診斷豬囊蟲病斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾試劑盒其制備及應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及家畜寄生蟲病的診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及用于診斷豬囊蟲病的斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾試劑盒的制備方法及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
豬囊蟲病又稱豬囊尾蚴病(cysticercosis cellulosae)，是由豬帶絳蟲幼蟲寄生于人或豬、野豬等中間宿主引起的人獸共患寄生蟲病。人不僅是豬帶絳蟲唯一的終宿主，同時(shí)也是其幼絳期適宜寄生的宿主。
該病癥狀及危害因寄生部位不同而異。囊尾蚴寄生于腦內(nèi)，可呈現(xiàn)腦炎癥狀或癲癇，眩暈、嘔吐、感覺障礙、癱瘓、大小便潴留，神經(jīng)衰弱等癥狀；寄生于眼部可誘致失明；寄生于內(nèi)臟可引起心、肝囊尾蚴病、肺囊尾蚴病、胰囊尾蚴病等；寄生于肌肉或皮下，可引起無力、頭昏、頭痛、記憶力減退、肌肉痙攣及眼花等癥狀；囊尾蚴往往混合寄生于皮肌與腦內(nèi)，危害的表現(xiàn)復(fù)雜多樣，嚴(yán)重者可危及生命。
豬囊蟲病在世界各地均有發(fā)生，尤其在中非、南非、拉丁美洲和東南亞諸國(guó)仍是很重要的公共衛(wèi)生問題。該病在我國(guó)南方諸省呈散發(fā)，在東北、華北、西北和西南地區(qū)感染率較高。例如星文梅等(2005)對(duì)青?；】h西部地區(qū)地調(diào)查，豬的囊蟲病的感染率為3.27％～4.92％；民和縣滿坪地區(qū)豬的囊蟲病感染率為3.41％～5.43％(郭宏山，2004)。據(jù)山東省清華醫(yī)院統(tǒng)計(jì)，1991～2002年入院治療的絳/囊蟲病例有2824例(李登俊等，2004)。寧夏人群囊蟲感染率為1.28％(王自存等，2005)。湖北襄樊市1976～2003年生豬囊蟲感染率平均為0.23％(許正敏等，2004)。據(jù)趙輝元等(1998)調(diào)查研究表明，豬的豬囊尾蚴檢出率在10％～20％的流行區(qū)，人體豬肉絳蟲的感染率占農(nóng)村人口的0.5％～1％，囊尾蚴病人占農(nóng)村人口的1.5‰，由此推斷，我國(guó)某些地區(qū)囊蟲病的危害還是相當(dāng)嚴(yán)重的。
豬絳蟲卵被吞入豬等中間宿主的胃腸道，蟲卵的胚膜為消化液中的蛋白酶所破壞，卵膜在小腸內(nèi)破裂逸出六鉤蚴，六鉤蚴破膜而出并鉆入腸壁，經(jīng)血液循環(huán)及淋巴液進(jìn)入到宿主體內(nèi)各組織。一般豬感染蟲卵后約經(jīng)60～70天發(fā)育為成熟的囊尾蚴，豬囊尾蚴主要寄生于橫紋肌的肌纖維之間，在膈、舌、心、腦、眼、淋巴結(jié)、胃壁、食道、肝臟、肺臟和脂肪等臟器和組織中也可見。豬囊尾蚴在豬體內(nèi)可寄生3～5年。
豬囊蟲病的防治關(guān)鍵在于抓好“驅(qū)、檢、管”綜合防治措施。目前檢測(cè)囊蟲病的方法主要分兩類病原學(xué)檢查和免疫學(xué)檢測(cè)。前者主要包括囊結(jié)檢查(眼觀、手摸、解剖鏡觀察)和CT檢查；后者包括皮內(nèi)試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、卡紅凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、間接熒光抗體試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、改良ELISA、斑點(diǎn)試驗(yàn)等。囊結(jié)檢查在豬囊蟲病比較嚴(yán)重流行的地區(qū)，該法檢出率約占囊蟲病豬的20％左右。CT檢查是檢測(cè)腦囊尾蚴病的有效手段之一，但儀器價(jià)格昂貴，目前僅用于人，且診斷結(jié)果中尚有14.17％的患者不能檢出。免疫學(xué)檢測(cè)方法具有較高的檢出率，但如果不注意純化抗原，則會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)，而且這些檢測(cè)方法條件要求嚴(yán)格、操作較繁瑣，有些需要特定的儀器設(shè)備，檢測(cè)所需的時(shí)間較長(zhǎng)(20分鐘至數(shù)小時(shí))。不能滿足快速檢疫的需要。
因此尋找一種快速、簡(jiǎn)便，適用于豬囊蟲病流行病學(xué)調(diào)查、普查、診斷、流通市場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)檢疫的方法，已成為防疫部門迫切希望解決的問題。
金標(biāo)免疫滲濾法和金標(biāo)免疫層析法是近幾年發(fā)展起來的一種新的免疫學(xué)診斷方法，它是以微孔膜作為載體，用膠體金代替ELISA中的酶標(biāo)記物，可省去底物反應(yīng)步驟，陽(yáng)性反應(yīng)呈紅色斑點(diǎn)或線條，肉眼清晰可見，操作簡(jiǎn)便快速，整個(gè)試驗(yàn)過程在數(shù)分鐘內(nèi)完成，且試劑穩(wěn)定易長(zhǎng)期保存，國(guó)內(nèi)外已將該法用于多種疾病的診斷。
國(guó)內(nèi)利用金標(biāo)法檢測(cè)豬囊蟲病的報(bào)道多見于人醫(yī)學(xué)的試驗(yàn)。張洪花等(1994)應(yīng)用金標(biāo)記豬囊尾蚴囊液抗原為探針，以豬囊尾蚴抗原的McAb為橋聯(lián)，建立了非常規(guī)斑點(diǎn)免疫金染色法(Dot-IGS)檢測(cè)腦囊蟲病患者腦脊液中循環(huán)抗原(CAg)的方法，用4G2McAb檢測(cè)84例腦囊蟲病腦脊液，CAg陽(yáng)性率為88.09％，檢測(cè)63例其它疾病患者，有2例假陽(yáng)性。以1F11McAb檢測(cè)14例腦囊蟲病人，陽(yáng)性率為92.86％，檢測(cè)其它疾病患者36例，均為陰性。
劉玉冰等(2001)先后以1株豬囊尾蚴囊液抗原McAb滴于硝酸纖維素膜(NC)上，另1株豬囊尾蚴囊液抗原McAb與膠體金結(jié)合，建立了檢測(cè)腦囊蟲病患者腦脊液(CSF)中CAg的金標(biāo)免疫滲濾法(DIGFA)，對(duì)48例腦囊蟲病患者CSF，26份健康人CSF檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率為77.8％～93.75％，陰性符合率為96.15％，對(duì)23例非囊蟲病患者CSF檢測(cè)，假陽(yáng)性有1例。
后來，劉玉冰等(2002a，2002b)又以抗豬囊尾蚴囊液抗原4G2McAb制備膠體金探針，將硝酸醋酸混合纖維素膜粘貼在塑料薄片上，其上部緊貼吸水濾紙，在混合纖維素上固定一條豬囊尾蚴囊液抗原線(對(duì)照線)和一條單克隆抗體(1F11McAb)線(檢測(cè)線)制作成測(cè)試條，建立了金標(biāo)免疫層析法檢測(cè)豬囊蟲循環(huán)抗原的方法。該方法原理為，將測(cè)試條插入待測(cè)液中，液體向上滲透，流經(jīng)McAb線時(shí)，待測(cè)液中的CAg與其結(jié)合成抗原抗體復(fù)合物，再加入膠體金標(biāo)記抗豬囊尾蚴抗原4G2McAb，金標(biāo)4G2McAb與檢測(cè)線上的抗原抗體復(fù)合物及對(duì)照線上的抗原結(jié)合，膠體金顆粒聚集成紅色的線而顯色，用肉眼就可判斷結(jié)果，待測(cè)液中如無Cag，金標(biāo)McAb只在對(duì)照線上聚集顯色，檢測(cè)線不顯色。用該方法檢測(cè)腦囊蟲病人CSF和血清各48份，陽(yáng)性檢出率分別為81.25％和70.83％，檢測(cè)健康人CSF和血清各26份，陰性符合率分別為92.31％和90.00％，檢測(cè)23份右囊蟲病患者CSF和血清，交叉反應(yīng)率分別為8.70％和11.32％。檢測(cè)包蟲、血吸蟲、華支睪蟲患者血清各10份，交叉率分別為20.00％、10.00％和0。敏感性和特異性與ELISA相近。在另一試驗(yàn)中應(yīng)用同樣的膠體金免疫層析法檢測(cè)囊蟲病患者血清78份，陽(yáng)性率為71.79％，其中52例活動(dòng)型腦囊蟲病人血清的陽(yáng)性率為80.77％，20份非活動(dòng)型腦囊蟲病人血清的陽(yáng)性率為55％，6份單純皮肌型囊蟲病血清的陽(yáng)性率為50％。檢測(cè)40份健康人血清，陰性符合率為87.5％。
袁建華等(2001)在國(guó)內(nèi)外率先開發(fā)成功用于囊蟲病診斷的IgG金標(biāo)層析法診斷試劑盒，該試劑盒由用囊尾蚴囊液可溶性抗原吸附的硝酸纖維素膜和膠體金標(biāo)記的抗人IgG多克隆抗體及其它試劑組成。采用層析法檢測(cè)血清中的抗囊IgG抗體，用于囊蟲病的輔助診斷或流行病學(xué)調(diào)查。經(jīng)133例囊蟲病患者血清和131例正常人血清的檢測(cè)，陽(yáng)性率為93.2％，陰性符合率為99.2％，檢測(cè)20份包蟲病人血清，交叉反應(yīng)率為45％，檢測(cè)20例其它蠕蟲病人血清，未出現(xiàn)交叉反應(yīng)。其敏感性、特異性和重復(fù)性可與酶標(biāo)法媲美。操作和觀察時(shí)間僅需20分鐘左右。不足之處是價(jià)格較高。
唐雨德等(2004)從5株抗囊蟲McAb和1株多抗用于最佳配對(duì)的篩選，一株用于標(biāo)記膠體金，一株用于包被NC膜，以雙抗體夾心ELISA為對(duì)照，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以1A5McAb為金標(biāo)抗體，以1B6McAb為包被抗體制備金免疫層析法(GICA)試紙條的檢測(cè)效果最佳。用此GICA檢測(cè)7份囊蟲囊液、48份囊蟲病豬血清，25份非疫區(qū)豬血清、21份囊蟲病人血清、8份囊蟲病人腦脊液和36份正常人血清的CAg，結(jié)果顯示對(duì)囊蟲囊液和囊蟲病豬血清的陽(yáng)性率為100％，非疫區(qū)豬的陰性符合率為100％；囊蟲病人血清和腦脊液陽(yáng)性符合率達(dá)80％，正常人血清全部為陰性。檢測(cè)時(shí)間5～15分鐘。GICA試紙條37℃保存30天，4℃和室溫下保存105天檢測(cè)結(jié)果未發(fā)生改變。
但在上述文獻(xiàn)報(bào)道中均存在以下問題，首先，無論是金標(biāo)免疫層析法還是金標(biāo)免疫滲濾法均需制備抗豬囊尾蚴囊液抗原的McAb，抗體生產(chǎn)成本很高，是限制金標(biāo)免疫診斷技術(shù)在家畜豬囊蟲病診斷中應(yīng)用的主要原因之一。所以至今還沒有在家畜檢疫中得到推廣應(yīng)用的報(bào)道；其次，目前制備膠體金標(biāo)記的探針工藝，通常先以試管目測(cè)法確定抗原或者抗體的用量，為了保證充分包被，避免多余膠體金與非特異蛋白結(jié)合而干擾檢測(cè)結(jié)果判斷，一般在此基礎(chǔ)上再增加10％～20％的被包被抗原或抗體的用量，然后又為了去除多余的游離的抗原或抗體，再采用層析或高速離心等純化處理，這些處理或者對(duì)設(shè)備條件要求很高，或者處理過程周期長(zhǎng)，步驟繁雜，使試劑盒成本增高，不利于產(chǎn)業(yè)化開發(fā)；再之，采用雙夾心金標(biāo)免疫滲濾法，一塊反應(yīng)盒僅能檢測(cè)1個(gè)人的血樣，其檢測(cè)成本高，且效率較低；所以金標(biāo)免疫法至今還沒有在家畜檢疫中得到推廣應(yīng)用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是，針對(duì)上述現(xiàn)有金標(biāo)免疫法在檢測(cè)人體豬囊蟲病方法中所存在的速度不快，操作繁瑣，需要特定儀器或者檢測(cè)成本過高等不足，提供一種敏感、特異性強(qiáng)、結(jié)果可靠、檢測(cè)方便，效率較高的，可用于檢測(cè)家畜豬囊蟲病的診斷試劑盒；并提供該試劑盒中豬囊蟲抗原膠體金的簡(jiǎn)便、省本、省時(shí)的制備方法；以及應(yīng)用該試劑盒對(duì)豬囊蟲病進(jìn)行簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的診斷方法。
本發(fā)明斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾法以親和層析原理為基礎(chǔ)，采用硝酸纖維素膜為固相載體，以吸附在硝酸纖維素上的豬的待檢血樣為固相，以抗原膠體金結(jié)合物為液相，并同時(shí)作為探針和指示劑，而建立起來的一種新型的免疫檢測(cè)方法。其中膠體金顆粒的表面帶負(fù)電荷與囊蟲抗原蛋白分子的正電荷基團(tuán)因靜電作用形成牢固的結(jié)合，同時(shí)金顆粒又有高電子密度的特性，當(dāng)被金顆粒標(biāo)記的抗原與相應(yīng)的抗體配體結(jié)合，金顆粒在抗體配體位點(diǎn)大量聚集時(shí)，便形成肉眼可見的紅色斑點(diǎn)。
本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的。
診斷豬囊蟲病斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾試劑盒，包括盒體、內(nèi)置反應(yīng)盒、黑色試劑瓶、白色試劑瓶、玻璃毛細(xì)管及豬囊蟲病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血紙或血清、陰性血紙或血清；所述反應(yīng)盒由盒底、盒蓋組成，盒蓋中央有一直徑0.8cm圓孔，盒底內(nèi)裝滿吸水墊料、緊貼盒蓋圓孔下方放一層1.3×1.3cm硝酸纖維素膜，緊閉盒蓋與盒底即成反應(yīng)盒；所述白色試劑瓶?jī)?nèi)裝有洗滌液；所述黑色試劑瓶?jī)?nèi)裝有豬囊蟲抗原膠體金。
一種制備所述試劑盒的方法，其中盒體、反應(yīng)盒、黑色試劑瓶、白色試劑瓶及玻璃毛細(xì)管均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)用品，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血紙、陰性血紙或標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清按常規(guī)方法制備；所述白色試劑瓶?jī)?nèi)裝有的洗滌液為pH6.2～6.4，含有0.7％牛血清白蛋白(BSA)的0.01Mol磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液，具體由Na2HPO4 0.263-0.376g、KH2PO4 1.109-1.000g、NaCl 6g、KCl 0.2g、蒸餾水1000ml、牛血清白蛋白7g配制而成；
所述黑色試劑瓶?jī)?nèi)裝有的豬囊蟲抗原膠體金按以下步驟制備而成
(1)膠體金的制備 以1％氯金酸、1％檸檬酸三鈉、1％鞣酸、25mM K2CO3及雙蒸水為原料，先將1％氯金酸與雙蒸水按體積1∶79配成A液；將1％檸檬酸三鈉、1％鞣酸、25mMK2CO3與雙蒸水按體積4∶0.035～0.080∶0.035～0.080∶15.84～15.93配成B液；再將A液、B液在水浴內(nèi)同時(shí)加熱到59～61℃，攪拌A液，快速加入B液，繼續(xù)攪拌1分鐘，在10～13分鐘內(nèi)加熱至沸騰，制成顆粒直徑8～12nm的膠體金，該膠體金液顏色由黑→藍(lán)→紫→紅色時(shí)即成；
(2)膠體金pH值的調(diào)整 將步驟(1)膠體金液用0.25MK2CO3調(diào)整pH值為6.8～7.1后備用；
(3)豬囊蟲可溶性抗原的制備與透析 將豬囊蟲包囊(包括囊壁、囊液和頭節(jié))置玻璃研磨器中研磨后，用0.85％NaCl溶液按重量配成5％濃度溶液，置-25℃反復(fù)凍融7次，期間用40KHz、400W超聲波裂解處理5次，每次處理20分鐘，然后在4℃下13000r/min離心60分鐘，吸取上清液即為豬囊蟲可溶性抗原；將該抗原裝入透析袋，用雙蒸水透析去除鹽分后，裝瓶冷凍，備用；
(4)豬囊蟲抗原包被膠體金 將步驟(3)豬囊蟲可溶性抗原0.27～0.30mg，緩慢加入步驟(2)制備的100ml膠體金液中進(jìn)行包被，攪拌15分鐘后，依次加入10％迭氮鈉500μl、1％牛血清白蛋白100μl，攪勻后在2.5～4.0℃，1500r/min條件下離心30分鐘，吸取紅色上清液，即成囊蟲抗原膠體金，分裝黑色試劑瓶?jī)?nèi)，冷藏、備用；
一種所述制備方法的的優(yōu)選方案是，配制膠體金A液配方同上，所述配制膠體金B(yǎng)液的組分與含量為1％檸檬酸三鈉4.0ml、1％鞣酸0.08ml、25mMK2CO30.08ml與雙蒸水15.84ml；制成的膠體金顆粒直徑為10＜D≤11nm；膠體金液pH值調(diào)為7.1；膠體金液與豬囊蟲抗原的體積重量比為100ml∶0.30mg。
一種應(yīng)用所述試劑盒診斷豬囊蟲病的方法，按以下步驟操作
(1)待檢豬干燥血紙或豬血清的制備 采血5滴/頭，滴在濾紙面上至陰涼干燥即制成豬血紙；或采豬血3～5ml于干凈滅菌的試管中，置37℃水浴中30～45min，3000r/min離心30min，吸取上清液即為豬血清，冷凍備用；
(2)血紙浸出液或血清稀釋液的制取 裁取血紙，按每0.24cm2加0.5毫升生理鹽水(0.85％氯化鈉溶液)比例在容器內(nèi)浸泡，每10分鐘搖動(dòng)1次，浸泡30分鐘后即成血樣浸出液；或是血清，用生理鹽水(0.85％氯化鈉溶液)稀釋成128倍液；
(3)血樣浸出液或血清稀釋液點(diǎn)樣 用內(nèi)徑1mm玻璃毛細(xì)管吸取上述血樣浸出液或血清稀釋液1μl，點(diǎn)在反應(yīng)盒圓孔內(nèi)硝酸纖維素膜面上，每膜可布點(diǎn)1至4份待檢血樣；
(4)滴加洗滌液 點(diǎn)血樣后在室溫下放置40～90秒鐘，滴加100μl洗滌液；
(5)滴加豬囊蟲抗原膠體金 待洗滌液滲入后，再往反應(yīng)盒膜面滴加100μl豬囊蟲抗原膠體金；
(6)待豬囊蟲抗原膠體金滲入后，再往反應(yīng)盒膜面上滴加100μl蒸餾水；
(7)觀察并記錄結(jié)果 觀察反應(yīng)盒膜面，若點(diǎn)樣處呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)即為陽(yáng)性，否則為陰性。
本發(fā)明的有益效果
一是本發(fā)明診斷豬囊蟲病斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾試劑盒，不需要特殊儀器，僅需按序操作，即可直觀鑒別出血樣豬有否患豬囊蟲病，3分鐘即可檢測(cè)20個(gè)血樣，比ELISA方法操作簡(jiǎn)便，提高檢測(cè)效率20倍以上。
二是本發(fā)明是在探明了豬囊蟲抗原包被膠體金的最適穩(wěn)定量及膠體金標(biāo)記囊蟲抗原最佳pH值的基礎(chǔ)上，將該抗原與膠體金直接結(jié)合成抗原膠體金，因無游離的抗原，故結(jié)合后不需要濃縮、層析純化或高速離心純化等處理，制作工藝簡(jiǎn)單，省工、省時(shí)、節(jié)省成本，有利于產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，比目前在人醫(yī)囊蟲病診斷上所用的雙夾心金標(biāo)免疫滲濾法或雙抗金標(biāo)層析法試劑盒(試紙條)降低生產(chǎn)成本50％以上，工效提高20倍以上。
三是該抗原膠體金能檢測(cè)出人工感染豬囊蟲病21～28天及其以上的病豬特異抗體，達(dá)到了早期診斷的目的(見試驗(yàn)例2)；與解剖檢蟲法陽(yáng)性符合率為100％(5/5)，陰性符合率為99.21％(125/126)；與人工感染的血吸蟲、肝片吸蟲、錐蟲、蛔蟲、旋毛蟲病及自然感染的兔豆?fàn)钅椅豺什≈g無交叉反應(yīng)，具有可用于早期診斷、檢測(cè)敏感、特異、檢出率高等特點(diǎn)。
四是診斷試劑在4℃下保存7個(gè)月，在室溫下保存3個(gè)月，對(duì)20份陽(yáng)性及20份陰性血紙每月檢測(cè)一次，每次結(jié)果一致，表明該診斷試劑穩(wěn)定性及重現(xiàn)性均好(見試驗(yàn)例5)。
五是本發(fā)明檢測(cè)方法可以用血紙?zhí)娲Ｒ?guī)血清樣品，解決了農(nóng)村基層制備血清采血量大，并需離心設(shè)備進(jìn)行分離加工，血清的輸送與貯藏還需冷藏等諸多難題；該方法操作簡(jiǎn)單，顯色快速，將待檢血紙浸出液1μl點(diǎn)在硝酸纖維素膜上作為固相，一個(gè)反應(yīng)盒最多可點(diǎn)4份血樣而互不干擾，僅需100μl(2滴)豬囊蟲抗原膠體金作為流動(dòng)相，其抗原與特異抗體在數(shù)秒鐘即能結(jié)合，在反應(yīng)處發(fā)生抗原抗體金顆粒聚集，形成肉眼可見的紅色斑點(diǎn)即為陽(yáng)性，陰性則僅留淡褐黃色或粉紅色背景，該結(jié)果判斷容易，并可長(zhǎng)期保存，以利于回顧性分析和研究；與現(xiàn)有的診斷豬囊蟲病免疫學(xué)方法相比其檢測(cè)工效提高20倍以上，顯著降低了生產(chǎn)成本。
六是這種以紅色膠體金標(biāo)記囊蟲抗原來檢測(cè)血樣，可省去酶標(biāo)法加底物顯色的步驟，不用有潛在致癌性的酶的顯色底物，更加安全。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過以下實(shí)施例和試驗(yàn)例作進(jìn)一步具體描述。
實(shí)施例1(診斷豬囊蟲病斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾試劑盒)
盒體內(nèi)設(shè)置的反應(yīng)盒為長(zhǎng)3cm×寬2.5cm×高0.6cm的塑料小盒，分盒底和盒蓋兩部分，盒蓋頂面中央有一個(gè)直徑為0.8cm的小圓孔，盒內(nèi)墊滿吸水材料，在小圓孔下方和吸水材料上方之間放置一張1.3×1.3cm的硝酸纖維素膜，合緊盒蓋即組成反應(yīng)盒；在試劑盒體內(nèi)還包含裝有囊蟲抗原膠體金的黑色試劑瓶和裝有洗滌液的白色試劑瓶、點(diǎn)樣用的玻璃毛細(xì)管及豬囊蟲病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血紙或血清、陰性血紙或血清各4份，用于檢驗(yàn)試劑盒的有效性；所述黑色試劑瓶、白色試劑瓶，由有彈性的小口塑料瓶體、與之配套的細(xì)孔滴嘴和瓶蓋組成，容量為10ml或20ml；玻璃毛細(xì)管為常規(guī)實(shí)驗(yàn)用品，內(nèi)徑1mm。
豬囊蟲病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血紙或血清 經(jīng)血清學(xué)檢查為囊蟲病陽(yáng)性的豬，再經(jīng)解剖檢蟲法確認(rèn)為囊蟲病陽(yáng)性，始可采血制作標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血紙和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，其制備方法是，采上述陽(yáng)性豬血5滴/頭，滴在濾紙面上至陰涼干燥即制成豬血紙；或采陽(yáng)性豬血3～5ml于干凈滅菌的試管中，置37℃水浴中30～45min，3000r/min離心30min，吸取上清液即為豬血清，冷凍備用。
陰性血紙或血清 在囊蟲非疫區(qū)，經(jīng)血清學(xué)檢查為陰性，并經(jīng)解剖檢蟲法確證為陰性的豬，始可作為標(biāo)準(zhǔn)陰性血樣；其制備方法同上。
標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性和陰性血紙或血清主要用于檢測(cè)診斷試劑盒的有效性。在每次試劑盒用于檢測(cè)之前，須用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、陰性血紙的生理鹽水浸出液(0.24cm2/0.5ml)，或者標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性和陰性血清的(128倍)稀釋液測(cè)試，若陽(yáng)性血樣出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，陰性血樣為黃色或粉紅色斑點(diǎn)，說明試劑盒有效，否則為失效，不可再用。
實(shí)施例2(膠體金的制備方法1)
本發(fā)明以1％氯金酸、1％檸檬酸三鈉、1％鞣酸、25mM K2CO3與雙蒸水為原料，采用鞣酸-檸檬酸鈉還原法制備膠體金。檸檬酸鈉主要為還原劑，而鞣酸具有還原和保護(hù)的雙重作用，控制“晶核”的形成過程。本例A液，B液各原料組分與含量的配比見表1
表1 A液、B液的配制 (單位ml)
將配制好的A液、B液在水浴內(nèi)同時(shí)加熱到59～61℃，在電磁攪拌器上攪拌A液，快速加入B液，繼續(xù)攪拌1分鐘，在10～13分鐘內(nèi)加熱至沸騰，氯金酸在鞣酸-檸檬酸鈉還原劑的作用下，使金離子還原成金原子，其膠體金液顏色由黑→藍(lán)→紫→亮紅色，此時(shí)合成的膠體金顆粒約為12～13nm，較穩(wěn)定，在4℃下可保存10個(gè)月。
實(shí)施例3(膠體金的制備方法2)
表2 A液、B液的配制 (單位ml)
A液與B液的配制與合成方法同實(shí)施例1，制成的膠體金顆粒直徑約12nm。
實(shí)施例4(膠體金的制備方法3)
表3 A液、B液的配制 (單位ml)
A液與B液的配制與合成方法同實(shí)施例1，制成的膠體金顆粒直徑約10～11nm。
實(shí)施例5(豬囊蟲可溶性抗原的制備方法)
將豬囊蟲包囊(包括囊壁、囊液和頭節(jié))置玻璃研磨器中研磨后，用0.85％NaCl溶液按重量比配成5％溶液，置-25℃反復(fù)凍融7次，期間用40KHz、400W超聲波探頭浸入溶液內(nèi)進(jìn)行超聲波裂解，每次20分鐘，先后共處理5次，然后在4℃下以13000r/min離心60min，吸取上清液即為豬囊蟲可溶性抗原；將上述可溶性抗原裝入透析袋，用雙蒸水進(jìn)行透析去除鹽分，即為包被膠體金用的豬囊蟲抗原。
實(shí)施例6(豬囊蟲抗原包被膠體金最適穩(wěn)定量的測(cè)定)
豬囊蟲抗原的用量(即豬囊蟲抗原包被膠體金的量)對(duì)膠體金的穩(wěn)定狀態(tài)起著決定作用，要求達(dá)到在囊蟲抗原膠體金中既沒有游離的未結(jié)合的金顆粒，也沒有游離的抗原蛋白質(zhì)為理想狀態(tài)，這樣的膠體金探針狀態(tài)穩(wěn)定，又可簡(jiǎn)化離心純化等步驟。
首選采用目測(cè)法確定膠體金與待標(biāo)記囊蟲抗原用量的大致比例，具體做法是分三批次進(jìn)行，每批次為6支試管，一、二、三批次試管中分別加入實(shí)施例2，3，4所制的1ml膠體金，再加入不同量的由實(shí)施例5所制抗原，按表4、5、6所示進(jìn)行。
表4 膠體金與囊蟲可溶性抗原用量比例的測(cè)定
表5 膠體金與囊蟲可溶性抗原用量比例的測(cè)定
表6 膠體金與囊蟲可溶性抗原用量比例的測(cè)定
注未加抗原的膠體金液，在加入NaCl溶液后膠體金液由紅色變成藍(lán)色；加入抗原量不足者，由紅色變紫色或紫紅色；加入抗原量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量者，則膠體金液的紅色不變，如表4、5、6中的第5、第5、第6管可作為穩(wěn)定1ml膠體金液所需的囊蟲可溶性抗原的用量(0.27-0.31μg)。
實(shí)施例7(豬囊蟲抗原膠體金的制備方法1)
膠體金pH值的調(diào)整膠體金與豬囊蟲抗原的結(jié)合在接近等電點(diǎn)的條件下最穩(wěn)定，因此，在加囊蟲抗原被包膠體金之前，先用0.25M K2CO3調(diào)整膠體金酸堿度至pH 6.8～7.1，以使膠體金與豬囊蟲抗原能夠牢固地結(jié)合。
取實(shí)施例2所制膠體金液100ml，在電磁攪拌下用0.25M K2CO3調(diào)pH值為6.8，然后逐滴加入實(shí)施例5所制豬囊蟲可溶性抗原0.27mg，繼續(xù)攪拌15分鐘后，依次加入10％迭氮鈉500μl、1％牛血清白蛋白100μl，攪勻后，1500r/min離心30分鐘，吸出上清紅色液體，則為豬囊蟲抗原膠體金產(chǎn)品，按包裝規(guī)格10ml/瓶或20ml/瓶分裝于黑色塑料試劑瓶?jī)?nèi)，置4～8℃保存。
實(shí)施例8(豬囊蟲抗原膠體金的制備方法2)
取實(shí)施例3所制膠體金液100ml，在電磁攪拌下用0.25M K2CO3將膠體金pH值調(diào)至6.9，然后逐滴加入實(shí)施例5所制豬囊蟲可溶性抗原0.28mg，其余步驟同實(shí)施例7。
實(shí)施例9(豬囊蟲抗原膠體金的制備方法3)
取實(shí)施例4所制膠體金液100ml，在電磁攪拌下用0.25M K2CO3將膠體金pH值調(diào)至7.1，然后逐滴加入實(shí)施例5所制豬囊蟲可溶性抗原0.30mg，其余步驟同實(shí)施例7。
實(shí)施例10(洗滌液的配制)
表7 pH6.2洗滌液按以下配方配制(1)
表8 pH6.4洗滌液按以下配方配制(2)
上面四種原料在蒸餾水中溶解，測(cè)pH無誤后，再加入7.0gBSA，待完全溶解后按量分裝于10ml或20ml的白色塑料試劑瓶中，保存。
實(shí)施例11(豬囊蟲病斑點(diǎn)金免疫滲濾檢測(cè)方法)
按以下具體步驟操作
(1)待檢豬干燥血紙或豬血清的制備 采豬血，滴在新華濾紙條上，于陰涼處干燥，在室溫陰涼干燥的條件下可保存半年(若置封口塑料袋中冷凍或冷藏可保存2-3年以上)備用；采豬血3～5ml于干凈滅菌的試管中，置37℃水浴中30～45min，3000r/min離心30min，吸取上清液即為豬血清。冷凍備用。
(2)血紙浸出液或血清稀釋液的制取 用打孔器裁取干燥血紙圓片(0.24cm2)1片，投入已編號(hào)的清潔、干燥試管或青霉素瓶?jī)?nèi)，加入0.5毫升生理鹽水(0.85％NaCl)浸泡，每隔10分鐘搖動(dòng)1次，30分鐘后充分搖勻，則成血紙浸出液；如果是血清，則用生理鹽水稀釋成128倍稀釋液；
(3)血樣浸出液或血清稀釋液點(diǎn)樣 用內(nèi)徑1mm玻璃毛細(xì)管吸取血樣浸出液或血清稀釋液1μl，具體操作是將吸取樣液后的玻璃毛細(xì)管輕貼硝酸纖維素膜面0.5秒鐘(即約1μl)后，立即向上移走毛細(xì)管，若1個(gè)血樣，將血樣點(diǎn)在塑料反應(yīng)盒硝酸纖維素膜中央；若2～4個(gè)血樣，則沿距小孔邊緣1mm左右按順時(shí)針點(diǎn)樣，并用記號(hào)筆在圓孔外四周按順時(shí)針編上相應(yīng)血樣號(hào)；要求每個(gè)樣品用一根毛細(xì)管，以免污染。
(4)滴加洗滌液 點(diǎn)血樣后在室溫下放置40～90秒鐘，滴加實(shí)施例10制備的洗滌液2滴(100μl)；
(5)滴加豬囊蟲抗原膠體金 待洗滌液滲入后，再往反應(yīng)盒膜面滴加2滴(100μl)實(shí)施例7、8或9制備的豬囊蟲抗原膠體金；
(6)待豬囊蟲抗原膠體金滲入后，再往反應(yīng)盒膜面上滴加2滴(100μl)蒸餾水或自來水；
(7)觀察并記錄結(jié)果 觀察反應(yīng)盒膜面，若點(diǎn)血樣處呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)即為陽(yáng)性，否則為陰性。
試驗(yàn)例說明
(1)供試血紙和血清樣品
i人工感染囊蟲病豬21、28、35和42天采血，制備血清及血紙，32份。
ii從河南屠宰場(chǎng)采集的自然感染囊蟲病豬血紙及血清5份。
iii從浙江非疫區(qū)采集的126頭豬血紙。
(2)測(cè)定試劑，裝置與方法
試劑盒 實(shí)施例1；
囊蟲抗原膠體金 按實(shí)施例7、8或9制備；
豬囊蟲病斑點(diǎn)金免疫滲濾檢測(cè)方法 按實(shí)施例11方法；
ELISA檢測(cè)豬囊蟲病試劑盒 由浙江省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所提供；
試驗(yàn)例1(豬囊蟲病不同檢測(cè)方法符合率對(duì)比試驗(yàn))
表9斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾法與ELISA法陽(yáng)性、陰性符合率對(duì)比
注以本發(fā)明的斑點(diǎn)金免疫滲濾法與ELISA法分別檢測(cè)人工感染囊蟲病豬血紙、血清各32份及自然感染囊蟲病豬血紙、血清各5份，兩者檢測(cè)陽(yáng)性率均相同，陽(yáng)性符合率為100％；用斑點(diǎn)金免疫滲濾法和ELISA分別檢測(cè)非疫區(qū)豬陰性血紙、血清各126份，其陽(yáng)性率依次為0.79％和1.58％，陰性率依次為99.21％和98.42％。血紙與血清陽(yáng)、陰性符合率為100％。
試驗(yàn)例2(豬囊蟲病應(yīng)用不同方法早期診斷效果對(duì)比試驗(yàn))
表10斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾法和ELISA法對(duì)豬囊蟲病早期診斷效果對(duì)比
以斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾法和ELISA法檢測(cè)人工感染囊蟲病21天、28天的豬血清各8份，兩者陽(yáng)性檢出符合率完全相同。本發(fā)明的斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾法可用于豬囊蟲病的早期診斷。
試驗(yàn)例3(豬囊蟲病斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾法的特異性試驗(yàn))
以本發(fā)明豬囊蟲病斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾法試劑盒分別檢測(cè)人工感染囊蟲的豬血清、人工感染血吸蟲病豬血清、人工感染肝片吸蟲羊血清、人工感染錐蟲的羊血清、人工感染蛔蟲的豬血清，結(jié)果見下表
表11豬囊蟲病斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾法與其它疾病的交叉反應(yīng)試驗(yàn)
由上表可見，本發(fā)明斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾法僅對(duì)豬囊蟲病起反應(yīng)，囊蟲與血吸蟲、肝片吸蟲、錐蟲、蛔蟲兔豆?fàn)钅椅豺始靶x等病之間末見交叉反應(yīng)現(xiàn)象。
試驗(yàn)例4(豬囊蟲病斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾法不同人員、批次的重復(fù)性試驗(yàn))
表12斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾法檢測(cè)豬囊蟲病的可重復(fù)性檢驗(yàn)
注肩號(hào)1、2、3分別代表使用不同批次制備的囊蟲抗原膠體金。
由3個(gè)不同的操作者對(duì)32份豬囊蟲病的豬血紙和血清，40份囊蟲陰性的豬血紙和血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果一致；由相同的操作者用不同批次的豬囊蟲抗原膠體金進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果也相同。說明該檢測(cè)方法的重復(fù)性良好。
試驗(yàn)例5(囊蟲抗原膠體金保存期試驗(yàn))
表13囊蟲抗原膠體金保存期測(cè)定
注豬囊蟲抗原膠體金系按實(shí)施例6方法制備。
用在室溫(15～32℃)和冷藏保存的囊蟲抗原膠體金分別對(duì)30份陽(yáng)性及30份陰性血紙每星期檢測(cè)一次，二個(gè)月后每個(gè)月檢測(cè)一次，試驗(yàn)結(jié)果豬囊蟲抗原膠體金在4～8℃下可保存7個(gè)月仍有效，在室溫下可保存3個(gè)月之久。
權(quán)利要求
1、診斷豬囊蟲病斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾試劑盒，包括盒體、內(nèi)置反應(yīng)盒、黑色試劑瓶、白色試劑瓶、玻璃毛細(xì)管及豬囊蟲病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血紙或血清、陰性血紙或血清，其特征在于所述反應(yīng)盒由盒底、盒蓋組成，盒蓋中央有一直徑0.8cm圓孔，盒底內(nèi)裝滿吸水墊料、緊貼盒蓋圓孔下方放一層1.3×1.3cm硝酸纖維素膜，緊閉盒蓋與盒底即成反應(yīng)盒；所述白色試劑瓶?jī)?nèi)裝有洗滌液；所述黑色試劑瓶?jī)?nèi)裝有豬囊蟲抗原膠體金。
2、一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的方法，其中盒體、反應(yīng)盒、黑色試劑瓶、白色試劑瓶及玻璃毛細(xì)管均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)用品，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血紙、陰性血紙或標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清按常規(guī)方法制備；其特征在于所述白色試劑瓶?jī)?nèi)裝有的洗滌液為pH6.2～6.4，含有0.7％牛血清白蛋白的0.01Mol磷酸鹽緩沖溶液；
所述黑色試劑瓶?jī)?nèi)裝有的豬囊蟲抗原膠體金按以下步驟制備而成
(1)膠體金的制備 以1％氯金酸、1％檸檬酸三鈉、1％鞣酸、25mMK2CO3及雙蒸水為原料，先將1％氯金酸與雙蒸水按體積1∶79配成A液；將1％檸檬酸三鈉、1％鞣酸、25mMK2CO3與雙蒸水按體積4∶0.035～0.080∶0.035～0.080∶15.84～15.93配成B液；再將A液、B液在水浴內(nèi)同時(shí)加熱到59～61℃，攪拌A液，快速加入B液，繼續(xù)攪拌1分鐘，在10～13分鐘內(nèi)加熱至沸騰，制成顆粒直徑10～13nm的膠體金，該膠體金液顏色由黑→藍(lán)→紫→紅色時(shí)即成；
(2)膠體金pH值的調(diào)整 將步驟(1)膠體金液用0.25MK2CO3調(diào)整pH值為6.8～7.1后備用；
(3)豬囊蟲可溶性抗原的制備與透析 將豬囊蟲包囊經(jīng)研磨后，用0.85％NaCl溶液按重量配成5％濃度溶液，置-25℃反復(fù)凍融7次，期間用40KHz、400W超聲波裂解處理5次，每次處理20分鐘，然后在4℃下，以13000r/min離心60分鐘，吸取上清液即為豬囊蟲可溶性抗原；將該抗原裝入透析袋，用雙蒸水透析去除鹽分后，裝瓶冷凍，備用；
(4)豬囊蟲抗原包被膠體金 將步驟(3)豬囊蟲可溶性抗原0.27～0.30mg，緩慢加入步驟(2)100ml膠體金液中進(jìn)行包被，攪拌15分鐘后，依次加入10％迭氮鈉500μl、1％牛血清白蛋白100μl，攪勻后在2.5～4.0℃，1500r/min條件下離心30分鐘，吸取紅色上清液，即成囊蟲抗原膠體金，分裝黑色試劑瓶?jī)?nèi)，冷藏、備用。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述配制膠體金B(yǎng)液的組分與含量為1％檸檬酸三鈉4.0ml、1％鞣酸0.08ml、25mMK2CO30.08ml與雙蒸水15.84ml；制成的膠體金顆粒直徑為10＜D≤11nm；膠體金液pH值調(diào)整為7.10；膠體金液與豬囊蟲抗原的體積重量比為100ml∶0.30mg。
4、一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述試劑盒診斷豬囊蟲病的方法，其特征是按以下步驟操作
(1)待檢豬干燥血紙或豬血清的制備 采血5滴/頭，滴在濾紙面上至陰涼干燥；或采血3～5ml/頭，經(jīng)37℃水浴保溫30～45min，3000r/min離心30min，吸取上清液即為血清，冷凍備用；
(2)血紙浸出液或血清稀釋液的制取 裁取血紙，按每0.24cm2加0.5毫升生理鹽水比例在容器內(nèi)浸泡，每10分鐘搖動(dòng)1次，浸泡30分鐘后即成血樣浸出液；或?qū)⒀?，用生理鹽水稀釋成128倍液；
(3)血樣浸出液或血清稀釋液點(diǎn)樣 用內(nèi)徑1mm玻璃毛細(xì)管吸取上述血樣浸出液或血清稀釋液1μl，點(diǎn)在反應(yīng)盒圓孔內(nèi)硝酸纖維素膜面上，每膜布點(diǎn)1至4份的待檢血樣；
(4)滴加洗滌液 點(diǎn)血樣后在室溫下放置40～90秒鐘，滴加100μl洗滌液；
(5)滴加豬囊蟲抗原膠體金 待洗滌液滲入后，再往反應(yīng)盒膜面上滴加100μl豬囊蟲抗原膠體金；
(6)待豬囊蟲抗原膠體金滲入后，再往反應(yīng)盒膜面上滴加100μl蒸餾水；
(7)觀察并記錄結(jié)果 觀察反應(yīng)盒膜面，若點(diǎn)樣處呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)即為陽(yáng)性，否則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明提供了診斷豬囊蟲病斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾試劑盒其制備及應(yīng)用方法，屬于家畜寄生蟲病的診斷技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以硝酸纖維素膜為固相載體，吸附豬的待檢血樣，以豬囊蟲抗原與膠體金結(jié)合物為液相，并同時(shí)作為探針和指示劑，當(dāng)抗原與相應(yīng)的抗體配體結(jié)合，金顆粒在抗體配體位點(diǎn)大量聚集，便形成肉眼可見的紅色斑點(diǎn)。應(yīng)用時(shí)將被檢豬血樣干紙浸出液或血清稀釋液1μl點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，加洗滌液100μl，再滴加豬囊蟲抗原膠體金100μl，2－3分鐘內(nèi)即形成或不形成紅色斑點(diǎn)，結(jié)果判斷容易，一個(gè)反應(yīng)盒可做1－4份待檢血樣，檢測(cè)成本低，具有敏感、特異、檢出率高，省工、省時(shí)、采血樣方便等優(yōu)點(diǎn)，適用于豬囊蟲病診斷與流通市場(chǎng)檢疫等領(lǐng)域應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/532GK1866014SQ20061005084
公開日2006年11月22日 申請(qǐng)日期2006年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日
發(fā)明者盧福莊, 張雪娟, 程天印, 項(xiàng)美華, 付媛, 方蘭勇, 馮尚連, 程菊芬 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院