一種用于診斷羊腦多頭蚴病的重組蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種來(lái)源于多頭帶絳蟲(chóng)的重組蛋白及其制備方法，本發(fā)明還涉及該重 組蛋白在羊腦多頭蝴病診斷上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦多頭蝴?。–oem/riAS1 cereAraJis)俗稱腦包蟲(chóng)病，是多頭帶絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)，腦多頭 蝴寄生于綿羊和山羊等有蹄類反芻動(dòng)物腦內(nèi)，可引起一種嚴(yán)重致死性的寄生蟲(chóng)病，人也可 作為中間宿主感染。其成蟲(chóng)寄生于犬科肉食獸的小腸。腦多頭蝴病的致死率可達(dá)1〇〇%，給 畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病呈全球性分布，是一種重要的人畜共患寄生蟲(chóng)病。 所以該病的早期診斷對(duì)患畜的檢疫與治療有著非常重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義。
[0003] 早期報(bào)道的羊腦多頭蝴病診斷抗原有包囊液、原頭節(jié)組織勻漿等粗抗原，但因其 抗原來(lái)源十分有限，而且其診斷的敏感性不高，特異性不強(qiáng)，與其他羊絳蟲(chóng)蝴病（如羊 細(xì)頸囊尾蝴病，羊囊尾蝴?。┐嬖诮徊娣磻?yīng)。目前，一些重組抗原如Tm7等也被應(yīng)用于診 斷，可能克服運(yùn)用粗抗原作為診斷抗原的一些不足，當(dāng)然，這些重組抗原對(duì)哪個(gè)感染時(shí)期的 血清或哪種感染劑量的血清敏感，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種診斷羊腦多頭蝴病的重組蛋白。本發(fā)明同時(shí)提供了一種用于制 備上述重組蛋白的方法及制備該重組蛋白的引物，以及該重組蛋白的用途。
[0005] 本發(fā)明提供的這種診斷羊腦多頭蝴病的重組蛋白是腦多頭帶絳蟲(chóng)基因TmAdh3的 0RF序列在原核表達(dá)系統(tǒng)下的重組蛋白，其氨基酸序列是SEQ ID No. 1，基因序列為SEQ ID No. 2。該重組蛋白已于2 0 1 5年6月1 9日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，保 藏編號(hào)為 CCTCC No :M2015388。
[0006] TmAdh3序列是以腦多頭蝴原頭芐基因組DNA為模板，分別以用上游引物序列SEQ ID No. 3和下游引物序列SEQ ID No. 4進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到。
[0007] 本發(fā)明的重組蛋白的制備方法是針對(duì)前述來(lái)源于多頭帶絳蟲(chóng)的TmAdh3基因全序 列，在其0RF序列5'端和3'端分別加上酶切位點(diǎn)及〃泌/ /及〇/后人工合成，測(cè)序獲 得基因序列SEQ No. 3。接著將合成的SEQ No. 3產(chǎn)物與載體pGEX-4T-l分別用及碰^/ / 及〇/雙酶切后回收產(chǎn)物以T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-4T-TmAdh3,再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單個(gè)菌落接種于含有氨芐青 霉素（100 yg/mL)的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，將大量增菌誘導(dǎo)表達(dá)的菌體離心富集細(xì)菌培養(yǎng) 物沉淀，用PH7. 4 PBS緩沖液懸浮，反復(fù)凍融3次后超聲裂解表達(dá)菌，分別收集裂解液的上 清及沉淀，用SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)形式后，將可溶性表達(dá)上清用GST瓊脂糖樹(shù)脂 純化，得到目標(biāo)蛋白。
[0008] 本發(fā)明提供的重組蛋白可在診斷羊腦多頭蝴病中應(yīng)用。通過(guò)west-blotern及 ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該重組蛋白對(duì)羊腦多頭蝴感染血清反應(yīng)明顯，從而推測(cè)這種重組蛋白對(duì)羊 腦多頭蝴病具有診斷價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1是實(shí)施例一中TmAdh3基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。其 中，M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ; 1: TmAdh3基因PCR產(chǎn)物。
[0010] 圖2是實(shí)施例二中TmAdh3重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)形式SDS-PAGE鑒定結(jié)果。
[0011] M :低蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 :pGEX-4T-l/BL21菌液未誘導(dǎo)；2 :pGEX-4T-l/BL21菌 液誘導(dǎo)；3 :pGEX4T-1-TmAdh3/BL21 菌液未誘導(dǎo)；4 :pGEX-4T-1-TmAdh3/BL21 菌液誘導(dǎo)；5 : pGEX4T-1-TmAdh3/BL21 裂解液的上清液；6-7 :pGEX-4T-1-TmAdh3 /BL21 裂解液2 mol/L尿 素洗滌液；8:?6￡乂41'-1-1'滅(1113/8121裂解液8 111〇1/1尿素溶解沉淀。
[0012] 圖3是實(shí)施例三中TmAdh3重組蛋白純化產(chǎn)物SDS-PAGE鑒定。M:低蛋白分子質(zhì) 量標(biāo)準(zhǔn)；1 :純化后的重組TmAdh3蛋白。
[0013] 圖4是實(shí)施例四中TmAdh3重組蛋白與綿羊腦多頭蝴感染血清進(jìn)行Western blot 分析。M :蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 :羊腦多頭蝴自然感染血清；2 :健康羊血清。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 本發(fā)明以下結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳述。
[0015] 一、腦多頭蝴TmAdh3基因的克隆 1.基因組DNA的提取 從甘肅景泰屠宰場(chǎng)收集腦多頭蝴病羊，開(kāi)顱分離到腦多頭蝴包囊，形態(tài)學(xué)檢查確認(rèn)后， 將原頭節(jié)無(wú)菌條件下剝離后，用PBS洗滌，最后應(yīng)用北京天根公司的組織DNA提取試劑盒提 取腦多頭蝴基因組DNA，具體操作詳見(jiàn)說(shuō)明（略)。
[0016] 2. TmAdh3基因的擴(kuò)增 以前述內(nèi)容1. 1提取的腦多頭蝴基因組DNA為模板，用上游引物序列SEQ ID No.3 (5 ' -ATACGCAATGAITTGTGCCT-3 ')和下游引物序列 SEQ ID No.4 (5 '-ACGATGGCCTCGAAAGAITC -3< )進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增得到。PCR 反應(yīng)體系：10XPCR 緩沖液 5 ML， dNTP mixture (2.5 mmol/L)4 ML，引物（10 Mmol/L)各 1 ML，LA Taq DNA 聚合酶（5 U/ML) 0. 5 ML，模板基因組 DNA 1 ML，加入 ddH20 至 50 ML。反應(yīng)條件：94°C 1 min;94°C 30 s， 50°C 30 s，72°C 2 min，35 個(gè)循環(huán)；72°C 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取 5 ML PCR 產(chǎn)物于 8 g/L 瓊脂糖凝膠中電泳觀察結(jié)果。其余產(chǎn)物克隆于PMD18-T載體中，進(jìn)行測(cè)序，獲得TmAdh3基 因組DNA完整序列。
[0017] 3. TmAdh3基因的克隆、序列分析 (1) 將上述2的PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化（北京天根公司DNA純化試劑 盒），具體步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明（略）： (2) TmAdh3基因與pMD-18T克隆載體的連接 連接體系為：PMD18T克隆載體1 yL(50 ng/yL)，TmAdh3基因PCR純化產(chǎn)物4 yL， Solution I 5 yL，混勻后置16°C連接4 h后轉(zhuǎn)化AcWiDH5a感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布于 氨芐青霉素抗性LB平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。挑選轉(zhuǎn)化后的單個(gè)菌落，進(jìn)行PCR陽(yáng)性鑒定。
[0018] (3) TmAdh3基因的序列分析 分別取陽(yáng)性重組菌送上海生工測(cè)序公司測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果，通過(guò)Blast分析確定其 0RF序列，去除信號(hào)肽序列并在5'端和3'端分別加上酶切位點(diǎn)及碰^/ /及〇/后人工 合成該序列。其基因編碼的氨基酸序列為SEQ ID No. 2，基因編碼的氨基酸序列為SEQ ID No. 1 〇
[0019] 二、TmAdh3重組蛋白的表達(dá) 將上述人工合成的TmAdh3基因產(chǎn)物及pGEX-4T-l質(zhì)粒，分別用及碰^/ /肋o I進(jìn) 行雙酶切，回收