參與花青苷生物合成調控的菊花bHLH轉錄因子的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物分子生物技術和基因工程領域，涉及一個參與花青苷生物合成調 控的新型菊花轉錄因子仏似（SEQ :N0. 1)。
【背景技術】
[0002] 菊花是世界重要花卉之一，為僅次于玫瑰的世界第二大切花。菊花亦是我國傳統(tǒng) 名花，具有悠久的歷史和深厚的文化積淀。至今，我國研究者已自主培育了近250個切花菊 品種，其中單頭切花大菊占切花產量總數(shù)的一半左右?；ㄉ蔷栈ㄖ匾挠^賞性狀之一，單 頭切花大菊的花色多以原始色系黃、白為主，除此黃、白色系之外，我國自主培育的菊花品 種還有綠、青、粉紅、紅、紫和間色等其他色系。分析紫紅粉色系菊花的呈色機制，是培育多 色系菊花重要的理論基礎，有助于改善切花菊文化的發(fā)揚及其產業(yè)的多元化。
[0003] 花青苷是眾多紫紅粉色系菊花品種的主要呈色色素，其積累量越高花色越偏紅紫 色。花青苷，又名花色素苷，屬黃酮類化合物，由花青素和糖基結合而成。花青苷在植物體 內的生物合成起始于苯丙氨酸途徑，由多個酶參與催化，而編碼這些酶的基因在轉錄水平 上則受到從MZ辨卩勝必轉錄因子形成的MBW轉錄復合體的協(xié)同調控。在這三類轉錄 因子中，盡管i/ra轉錄因子對花青苷的生物合成調控具有較高的特異性，然而專錄因 子的協(xié)同作用亦不容忽視。
[0004] 是植物中第2大轉錄因子家族，其基因序列中擁有保守的bHLH結構域，由 約60個氨基酸組成。典型的bHLH結構域的N端包含13 ~ 17個親水的堿性氨基酸殘基， 其后連接被任意長度的環(huán)一分為二的a螺旋（HLH，helix-loop-helix)。在bHLH結構域 的堿性氨基酸序列中，ffiR (His5-Glu9-Argl3)基序具有高度的保守性，可結合啟動子序列 中的六核苷酸E-box基序（CANNTG)，進而調控靶基因轉錄?？蓞⑴c植物心皮、花藥和 表皮細胞的發(fā)育，光敏色素信號轉導，植物激素信號轉導和逆境響應，黃酮類化合物的生物 合成調控等生命進程。參與植物花青苷生物合成調控的威員，已在眾多植物體內得到 鑒定，然而菊花中參與花青苷生物合成轉錄調控的成員至今未見報道，極大地限制了 菊花花色品質改良育種及其產業(yè)多元化的發(fā)展。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一個參與花青苷生物合成調控的新型菊花祕￡辟專錄因子 (仏祕￡似)，具有SEQ :N0. 1的核苷酸序列，其編碼序列全長為1842個核苷酸，可編碼一個 含614氨基酸的蛋白。CmbHLH2氨基酸序列中含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋結構域，且在堿性結 構域內含有高度保守的ffiR (His5-Glu9-Argl3)基序，可結合啟動子序列中六核苷酸E-box 基序（CANNTG);在其氨基酸序列的C端分布著MIR結構域，可與轉錄因子相互作用。
[0006] 本發(fā)明提供的菊花祕￡辟專錄因子（在紅色菊花品種中的基因表達最高， 粉色次之，黃色品種中最低。的這一表達模式與不同菊花品種積累花青苷的能力呈 顯著正向相關。CmbHLH2可與CmMYB6相互作用形成轉錄蛋白復合體，結合花青苷合成關鍵 基因啟動子并增強其表達活性，進而誘導花青苷的積累。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是提供菊花辟專錄因子在改變植物色澤中的應用。 仏MM2與仏#/及徹、同在煙草葉片中瞬時過量表達時，可強烈誘導花青苷的積累，使得原 本綠色的葉片變成紅色。因此，通過轉基因的手段，使得在植物中過量表達，或者 抑制菊花植株中的表達，即可分別獲得花青苷合成受到增強或者抑制的轉基因植 株，其色澤會因花青苷合成的變化而變化。 仏似（SEQ :N0. 1)是菊花中首例克隆并經過功能鑒定的可調控花青苷生物合成， 進而修飾植株色澤的成員。
[0008] 本發(fā)明以三種不同花色的菊花品種Z1 (紅色)，Z2 (粉色）和Z3 (黃色）為試材，應 用RACE、實時定量PCR、酵母雙雜交、瞬時表達等生物學技術，分離鑒定出參與菊花花青苷 生物合成調控的成員仏（SEQ :N0. 1)。研究發(fā)現(xiàn)，仏MM2的基因表達與菊花 花色中紅色程度呈良好正向相關，即越紅的菊花品種中，仏MM2的表達量越高； 可與仏俗相互作用形成轉錄蛋白復合體，增強菊花花青苷生物合成關鍵基因啟動 子活性，進而顯著誘導煙草葉片花青苷的積累。
【附圖說明】
[0009] 圖1菊花2個基因在不同菊花品種中的表達模式分析。
[0010] 圖2菊花2個基因對花青苷合成基因啟動子的調控效應分析。
[0011] 圖3菊花2個bHLH與CmMYB6轉錄蛋白質間的相互作用分析。
[0012] 圖4仏（SEQ:N0. 1)誘導花青苷生物合成功能的鑒定。
【具體實施方式】
[0013] 下面結合附圖和實施例，對本發(fā)明做進一步闡述，但實施例不限制本發(fā)明的保護 范圍。在下述實施例中常規(guī)的基因操作方法參照《分子克隆實驗指南》（第三版)。
[0014] 實施例1:菊花仏MZ似基因克隆 依據(jù)菊花RNA-Seq數(shù)據(jù)庫信息，篩選出可能參與菊花花青苷生物合成調控的辟專錄 因子仏MM2部分序列（SEQ:N0. 2)。應用基因特異引物2(GSP2)SEQ:N0. 3,以及巢式基 因特異引物2(NGSP2)SEQ:N0. 4,利用3' cDNA末端快速擴增（3' RACE)技術獲得仏 的3'非編碼區(qū)（3'UTR)序列（SEQ:N0. 5)。進而應用基因特異引物1 (GSP1)SEQ:N0. 6， 以及巢式基因特異引物1(NGSP1)SEQ:N0. 7,利用5' cDNA末端快速擴增（5' RACE)技術 獲得仏MM2的5'非編碼區(qū)（5' UTR)序列（SEQ:N0. 8)。根據(jù)所得的3'和5' UTR拼接 得到自起始密碼子（ATG)至終止密碼子的仏似（SEQ :N0. 1)的全長序列。
[0015] RACE 中第一輪 PCR 程序為 94°C 5min ; 94°C 10 s，72°C 2 min 30 s，5 個循環(huán)； 94〇C 10 s，70°C 30s，72°C 2 min 30 s，5 個循環(huán)；94°C 10 s，67°C 30s，72°C 2 min 30 s， 30 個循環(huán)；72°C 10 min，16°Chold。第二輪 PCR 程序為 94°C 5min;94°C 10 s，65°C 30s， 72〇C 2 min 30 s，30 個循環(huán)；72〇C 10 min，16〇Chold。
[0016] RACE第一輪PCR體系為10 X Ex-Buffer 2 yL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 yL，10 ymol/L GSP1或GSP2 0.5 yL，下游引物UPM 2 yL，Ex-Taq 0.1 yL，cDNA 0.5 yL，加 滅菌雙蒸水至20yL。第二輪PCR體系為10 X Ex-Buffer 2 yL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 yL，10 ymol/LNGSPl或NGSP2 0.5 yL，下游引物NUP2 yL，Ex-Taq0.1 yL，稀釋10倍的第一輪PCR產物1 yL，加滅菌的雙蒸水至20yL。
[0017] 根據(jù)3'和5' UTR拼接得到自起始密碼子（ATG)至終止密碼子的仏（SEQ : NO. 1)的全長序列。為更加明確闡述本發(fā)明的內容，文中還應用了仏(GenBank KC686698)和仏#/萬6 (GenBank KR002097)兩個基因，其序列均來自已有的報道。
[0018] 實施例2:菊花仏MM2基因表達模式分析 (一）實驗方法 利用 Primer Premier 5,依據(jù)~(SEQ :N0. 9)和~（SEQ :N0. 5)的 3' UTR序列分別設計實時定量PCR(QPCR)引物組合SEQ :N0. 10和SEQ :N0. 11以及SEQ :N0. 12和SEQ:N0. 13，PCR產物包含終止密碼子，長度分別為201 bp和192 bp。以菊花actin 基因（SEQ :N0. 14)的表達為內參分析仏和仏MM2的表達模式，其QPCR引物組合為 SEQ:N0. 15和SEQ:N0. 16。所有QPCR引物特異性經熔點曲線分析、凝膠電泳分析和QPCR 產物再測序驗證。
[0019] 分別提取三種不同花色的菊花品種的花瓣RNA，參照cDNA合成kit(Bi〇-Rad，USA) 說明書，合成 cDNA。參照 Ssofast EvaGreen Supermix kit(Bi〇-Rad，USA)說明書開展 QPCR 分析，米用 20 ML體系：其中 10 ML 2 XSsofast EvaGreen Supermix (Bio_Rad，USA)，1.0 ML上游引物（10剛），1.0 ML下游引物（10剛），2.0 ML稀釋的cDNA和6.0 ML H20。QPCR 程序為：94°C，10 min;94°C 10 s，60°C 30 s，45 個循環(huán)。
[0020] (二）實驗結果 基因表達分析結果表明，仏似（SEQ :N0. 1)的基因表達與不同花色菊花品種中的 花青苷積累呈良好正向相關（附圖1)，即在紅色菊花品種Z1中表達量最高，在粉色 菊花品種Z2中表達量次之，而在黃色菊花品種Z3中不表達。仏(SEQ :N0. 9)的基 因表達雖然也呈相