專利名稱：作為抑制素受體的β聚糖及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及內(nèi)分泌學(xué)領(lǐng)域，生殖生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)，尤其是關(guān)于激素/生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)。更特別的是，本發(fā)明涉及抑制素受體的識(shí)別及其用途。
相關(guān)領(lǐng)域的描述抑制素和活化素最初被認(rèn)為是性腺起源的蛋白質(zhì)激素，它們能可逆調(diào)節(jié)垂體前葉產(chǎn)生促卯泡成熟激素(FSH)(1)。這些蛋白質(zhì)是相關(guān)多肽的二硫鍵連接的二聚體?；罨赜蓛蓷lβ鏈構(gòu)成，而抑制素具有一條β鏈，它與一條相關(guān)的但趨異的α鏈連接(2)?，F(xiàn)在已知活化素在生殖和非生殖組織中起到了重要的內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌作用。這些作用調(diào)節(jié)發(fā)育和成年動(dòng)物中包括激素分泌和細(xì)胞增殖和分化過程(1，3)。雖然有抑制素不能封閉活化素反應(yīng)的系統(tǒng)(5，6)，抑制素通常拮抗活化素的作用(4)。
抑制素和活化素屬于生長(zhǎng)和分化因子的轉(zhuǎn)化性生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族(7)。與該家族的其它代表性成員一樣，活化素顯示通過兩類跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體傳遞信號(hào)(8)。在1991年，克隆和確定了活化素II型受體，稱為ActRII的特征(9)。ActRII是第一種被確定特征的脊椎動(dòng)物受體絲氨酸激酶(RSK)，也是任何TGF-β超家族成員中第一種在分子水平詳細(xì)描述的受體?，F(xiàn)在超過12種受體絲氨酸激酶家族成員已被鑒定出來，包括第二種II型活化素受體(ActRIIB)(10，11)、II型TGF-β受體(12)和化合物(13，14)和TGF-β(15)的I型受體。
抑制素、活化素和相關(guān)因子的廣泛的重要生物學(xué)作用，以及其與治療生殖、發(fā)育、骨骼、肝臟、造血和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可能應(yīng)用的關(guān)系，形成了探索其受體、信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制和調(diào)控的強(qiáng)有力的理由?？偟恼f，該工作涉及鑒定多種新的靶分子，并應(yīng)提供針對(duì)治療內(nèi)分泌疾病和腫瘤病的治療方法的新的基礎(chǔ)。
活化素(β-β)和抑制素(α-β)結(jié)構(gòu)上相關(guān)，具有同樣的14kDa β亞基，但是抑制素二聚體還具有不同的18kDa α亞基。從濾泡液中分離了活化素和抑制素的同工型。這些包括活化素A(βA-βA)、活化素B(βB-βB)、活化素AB(βA-βB)、抑制素A(α-βA)和抑制素B(α-βB)?；谛蛄信帕泻捅Ｊ匕腚装彼釟埢亩ㄎ唬J(rèn)為這些多肽與其它能得到晶體結(jié)構(gòu)信息的TGF-β家族成員結(jié)構(gòu)相似(16，17)。
迄今，已顯示抑制素僅在活化素反應(yīng)的情況下具有活性，它通常拮抗活化素信號(hào)(5，18-20)，雖然近來報(bào)道了骨骼中活化素依賴性抑制素作用的抽象的方式。已顯示抑制素可與活化素競(jìng)爭(zhēng)其靶細(xì)胞，抑制素能阻止活化素誘導(dǎo)的受體異源化(5，19)。未標(biāo)記的抑制素直接與已標(biāo)記的活化素競(jìng)爭(zhēng)II型活化素受體，雖然其作為取代劑的能力大約比非標(biāo)記的活化素低10倍(9，10)。
在活化素和抑制素中同時(shí)存在的β亞基將介導(dǎo)與II型活化素受體的結(jié)合。活化素與ActRII結(jié)合后，活化素-ActRII復(fù)合物隨后促進(jìn)I型活化素受體絲氨酸激酶ALK4的募集和磷酸化(5，8，14)。這導(dǎo)致同源I型受體的磷酸化和下游Smad蛋白質(zhì)的激活(21，22)。抑制素還與II型活化素受體結(jié)合，但抑制素分子的α亞基不支持I型受體(即ALK4)的募集。這提示抑制素通過直接競(jìng)爭(zhēng)受體結(jié)合位點(diǎn)來封閉信號(hào)傳導(dǎo)(5，18，19)，因此防止活化素與II型活化素受體結(jié)合(23)。然而，抑制素在一些組織和細(xì)胞內(nèi)不能拮抗活化素，這與抑制素作用需要其它成分的假設(shè)一致(5，24，25)。
先前的發(fā)現(xiàn)表明抑制素可能需要其它受體成分來與活化素成功競(jìng)爭(zhēng)與II型活化素受體的接觸，從而功能性拮抗活化素的反應(yīng)?？赡芎?jiǎn)單、直接的在活化素和抑制素之間競(jìng)爭(zhēng)與活化素II型受體的接觸單獨(dú)對(duì)于揭示抑制素對(duì)活化素反應(yīng)的作用是不夠的。事實(shí)上，活化素抑制垂體ACTH分泌的作用不是由于大摩爾過量的抑制素的拮抗(6)。另外，在工程改造過度表達(dá)ActRII的K562紅白血病細(xì)胞(KAR6細(xì)胞)中，提高的ActRII表達(dá)即使在存在基本分子過量的抑制素下，也封閉抑制素拮抗活化素信號(hào)傳導(dǎo)的能力(5)。
在嘗試鑒定推測(cè)的抑制素-特異性受體成分中，用[125I]-標(biāo)記的活化素和抑制素進(jìn)行交聯(lián)實(shí)驗(yàn)，來標(biāo)記野生型K562紅白血病細(xì)胞和過度表達(dá)ActRII的KAR6細(xì)胞。結(jié)果顯示活化素與兩種細(xì)胞系中的I型和II型受體結(jié)合，標(biāo)記的活化素與這兩種受體的結(jié)合被過量的未標(biāo)記的活化素或未標(biāo)記的抑制素取代(5)。如預(yù)期的，標(biāo)記的抑制素能結(jié)合兩種細(xì)胞系中的II型受體，但不是I型受體。抑制素與II型受體的結(jié)合可被加入的未標(biāo)記的活化素或抑制素取代。有趣的是，與標(biāo)記的抑制素交聯(lián)的高分子量的蛋白質(zhì)在這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中也是明顯的可通過加入過量未標(biāo)記的抑制素而不是活化素而能被競(jìng)爭(zhēng)性的被取代。
總的說，這些結(jié)果提示除了與ActRII結(jié)合，抑制素還與另一種高分子量的推測(cè)共受體結(jié)合，它可穩(wěn)定抑制素-ActRII相互作用，從而防止ActRII結(jié)合活化素和調(diào)節(jié)活化素反應(yīng)。因此，在某些組織中缺乏抑制素對(duì)活化素反應(yīng)的拮抗可通過缺少這類或類似的抑制素結(jié)合共受體成分解釋。卵巢腫瘤細(xì)胞系KK-1中類似的高分子量抑制素-結(jié)合成分的存在已被確認(rèn)。高親和力抑制素與非鑒定的高分子量蛋白(24)。
β聚糖是III型TGF-β受體，最初被認(rèn)為是三種顯示以高親和力結(jié)合TGF-β的細(xì)胞表面受體中最大的一種(26)。大鼠β聚糖cDNA編碼853個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，含有一個(gè)大胞外結(jié)構(gòu)域、一個(gè)單跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)短C-末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，缺乏可清楚識(shí)別的信號(hào)傳導(dǎo)基序(27，28)。β聚糖與三種TGF-β同工型以高親和力結(jié)合，據(jù)信在促進(jìn)TGF-β與其信號(hào)傳導(dǎo)受體的結(jié)合中起到了輔助作用(22，29)。
成熟的β聚糖是蛋白聚糖，它含有硫酸乙酰肝素和硫酸軟骨素糖胺聚糖(GAG)鏈，得到在SDS-PAGE凝膠上在250-350kDA之間遷移的分子。不和糖胺聚糖結(jié)合的β聚糖核心多肽保留TGF-β活性，并作為100-110kDa的蛋白質(zhì)遷移(27，30，31)。近來的工作顯示β聚糖在介導(dǎo)對(duì)TGF-β的生理反應(yīng)中的重要性，包括其自分泌調(diào)節(jié)人乳腺癌細(xì)胞增殖(32，33)及其觸發(fā)心內(nèi)膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力(34)。
現(xiàn)有技術(shù)的缺陷在于，沒有確定介導(dǎo)抑制素和活化素受體的相互作用的蛋白質(zhì)的特征。本發(fā)明填補(bǔ)了本領(lǐng)域該長(zhǎng)期存在的需要和需求。
發(fā)明簡(jiǎn)述在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，描述了一種方法，其中抑制素敏感細(xì)胞中活化素誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)可以通過抑制抑制素/β聚糖復(fù)合物的形成上調(diào)。一種抗血清可以針對(duì)β聚糖的胞外表位，來防止抑制素與β聚糖結(jié)合。另外，形成抑制素/β聚糖復(fù)合物可由減少細(xì)胞中β聚糖的表達(dá)抑制，通過反義抑制或用同源重組等方法誘變一個(gè)或兩個(gè)β聚糖等位基因。該方法的一種可能用途是增強(qiáng)垂體細(xì)胞中的活化素信號(hào)傳導(dǎo)。這應(yīng)導(dǎo)致促卵泡成熟激素(FSH)產(chǎn)生的增加，和生育力的增強(qiáng)。該方法還可用于治療許多病理性狀況，包括生殖、發(fā)育、皮膚、骨骼、肝臟、造血和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如前列腺癌。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了針對(duì)β聚糖胞外部分的抗血清。該抗血清抑制抑制素與β聚糖的結(jié)合，可摻入藥物組合物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種抑制活化素-誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的方法。這可通過增加抑制素/β聚糖復(fù)合物在靶細(xì)胞表面的形成實(shí)現(xiàn)。一種這樣的方法利用提高β聚糖在靶細(xì)胞中的表達(dá)，來提供額外β聚糖用于形成這些復(fù)合物。該方法還可通過施用額外的抑制素來增強(qiáng)。β聚糖表達(dá)可通過用組成型或用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)β聚糖的人工構(gòu)建體轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞來提高。該方法還可用于對(duì)正常情況下對(duì)抑制素不反應(yīng)的細(xì)胞引入抑制素敏感性?？捎迷摲椒ㄖ委熢S多病理性狀況，包括生殖、發(fā)育、皮膚、骨骼、肝臟、造血和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。實(shí)施例包括性腺癌、腎上腺癌和肝臟發(fā)育不良。該方法還可用于促進(jìn)肝臟再生。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是一種篩選抑制抑制素/β聚糖復(fù)合物形成，來增加活化素信號(hào)傳導(dǎo)的方法。在可能的抑制素與β聚糖結(jié)合的抑制劑存在或不存在的條件下，培育表達(dá)β聚糖的細(xì)胞膜。進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)等試驗(yàn)，比較結(jié)果。抑制抑制素/β聚糖復(fù)合物形成的化合物將導(dǎo)致更低水平的抑制素結(jié)合?？赡艿幕衔锟梢允请?、蛋白質(zhì)或小分子。另外，該方法可用于篩選增加抑制素/β聚糖復(fù)合物形成，從而抑制活化素信號(hào)傳導(dǎo)的化合物。對(duì)此，化合物應(yīng)提高抑制素與膜的結(jié)合。
附圖簡(jiǎn)述因此，獲得了上述引用的本發(fā)明的特征、優(yōu)點(diǎn)和目的，以及其它會(huì)變得清楚的方面，并可詳細(xì)理解，上面簡(jiǎn)單總結(jié)的本發(fā)明更具體的描述將參考一些實(shí)施例并用


。這些附圖是說明書的一部分。然而應(yīng)注意

了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，因此不應(yīng)認(rèn)為限制了本發(fā)明的范圍。
圖1A和1B顯示β聚糖與抑制素高親和性結(jié)合，加強(qiáng)了抑制素與ActRII的結(jié)合。
在圖1A中，用磷酸鈣沉淀(35)ActRII-myc、β糖苷(BG)或(ActRII+BG)一起轉(zhuǎn)染標(biāo)出的HEK293細(xì)胞。分離的細(xì)胞膜與約100pM[125I]抑制素A在存在或不存在各種濃度的未標(biāo)記抑制素A競(jìng)爭(zhēng)劑下培育。
圖1B顯示標(biāo)準(zhǔn)化的并表示成％特異性結(jié)合的圖1A的數(shù)據(jù)。用Prism軟件分析結(jié)合數(shù)據(jù)。
圖2A和2B說明抑制素與β聚糖(轉(zhuǎn)染和內(nèi)源的)共價(jià)交聯(lián)，提供了ActRII-β聚糖復(fù)合物的證據(jù)。
在圖2A中，β聚糖增加了抑制素A與ActRII的共價(jià)交聯(lián)?？蛰d體(pcDNA3)、ActRII-myc、β聚糖(BG)或ActRII和β聚糖同時(shí)(BG+ActRII-myc)轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，然后與[125I]-抑制素A和DSS如前對(duì)于活化素所述(9)進(jìn)行交聯(lián)。[125I]-抑制素A與表達(dá)β聚糖的細(xì)胞的結(jié)合和交聯(lián)在存在或不存在25nM未標(biāo)記的抑制素A、25nM未標(biāo)記的活化素A或5nM未標(biāo)記的TGF-β1的條件下如指出的進(jìn)行。用抗-β聚糖抗血清(R&D Systems，Inc.)或多克隆抗myc抗體(9E10)(Calbiochem，Inc.)免疫沉淀分離的交聯(lián)復(fù)合物。在還原條件下通過SDS-PAGE分辨交聯(lián)的蛋白質(zhì)，并通過放射性自顯影目測(cè)檢驗(yàn)。標(biāo)出了ActRII-myc、β聚糖核心多肽(核心)和含糖胺聚糖鏈的β聚糖(BG)的位置。分子量標(biāo)記表示成Mr×10-3。
圖2B顯示了抑制素A和活化素A與內(nèi)源β糖苷復(fù)合物的共價(jià)交聯(lián)。[125I]抑制素A和[125I]-活化素A的結(jié)合和交聯(lián)在存在或不存在25nM未標(biāo)記的抑制素A或25nM未標(biāo)記的活化素A的條件下，如標(biāo)出的在表達(dá)內(nèi)源受體KK-1細(xì)胞上進(jìn)行。用抗-β聚糖抗血清(R&D Systems，Inc.)、抗-ActRII抗血清或正常大鼠血清免疫沉淀分離交聯(lián)復(fù)合物，在還原條件下用SDS-PAGE分辨，并用放射性自顯影目測(cè)檢驗(yàn)。標(biāo)出了ActRII、β聚糖核心多肽(BG核心)、含糖胺聚糖鏈的β聚糖(BG)和ALK4的位置。分子量標(biāo)記表示成Mr×10-3。
圖3A-3F顯示了在正常成年大鼠大腦、垂體、卵巢和睪丸中β聚糖的免疫細(xì)胞化學(xué)定位。高倍亮視野顯微照相顯示前腦(圖3A)、垂體(圖3B和3C)、附睪(圖3D)、睪丸(3E)和卵巢(圖3F)中的β聚糖免疫染色。用箭頭標(biāo)出了對(duì)β聚糖免疫陽(yáng)性的細(xì)胞的典型例子(染成棕色)。條代表50微米?？s寫包括AL，垂體前葉；CT，結(jié)締組織；GC，粒層細(xì)胞；IL，垂體中葉；LC，睪丸間質(zhì)細(xì)胞；O，卵母細(xì)胞；PL，垂體后葉；ST，精小管；TT，Tenia Tecta；TC，卵泡膜細(xì)胞。
圖4A-4D顯示β聚糖可在促腎上腺皮質(zhì)激素、卵巢和紅白血病細(xì)胞中介導(dǎo)活化素信號(hào)傳導(dǎo)的功能拮抗。
在圖4A中，用3TPLux-報(bào)告質(zhì)粒(7)、CMV-β-半乳糖苷酶(β-GAL)和空載體或β聚糖(BG)cDNA，用Superfect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen)在優(yōu)化的條件下轉(zhuǎn)染AtT20細(xì)胞。用或不用2.5nM抑制素A(Inh A)和各種濃度的活化素A(Act A)處理細(xì)胞15小時(shí)，測(cè)量得到的熒光素酶活性。
在圖4B中，如圖4A中所述轉(zhuǎn)染AtT20細(xì)胞，然后用或不用1nN活化素A和一定濃度范圍的抑制素A處理。
在圖4C中，如上所述轉(zhuǎn)染KK-1卵巢腫瘤細(xì)胞，并用或不用0.3nM活化素A和一定范圍濃度的抑制素A處理。
在圖4D中，用β聚糖(BG)或空載體轉(zhuǎn)染K562-衍生的KAR6細(xì)胞，用IPTG處理誘導(dǎo)活化素受體表達(dá)，并用0.3nM活化素A和一定范圍濃度的抑制素A處理。熒光素酶活性用任意的熒光素酶單位(L U.)代表，標(biāo)化到β-GAL活性。
圖5顯示抑制素A抑制大鼠垂體前葉細(xì)胞FSH分泌在抗-β聚糖血清的存在下以劑量依賴性方式抑制。大鼠垂體前葉細(xì)胞如所述脫離并鋪板(40)。鋪板4天后，洗滌細(xì)胞并在0.2％FBS-bPJ(36)中培育24小時(shí)。然后用新鮮培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，用正常家兔血清(NRS)或來自注射了GST與大鼠β聚糖殘基154-439(Ab-BG)的融合蛋白的家兔的抗血清處理。1小時(shí)后，用或不用25pM抑制素A處理細(xì)胞，并培育48小時(shí)。用放免法試劑盒(NIADDK的國(guó)家激素和垂體計(jì)劃)測(cè)量FSH。報(bào)告值表示成三份孔的無抑制素處理的百分?jǐn)?shù)±SEM。
圖6示意性說明了假定的模型，其中β聚糖(BG)作為抑制素共受體。β聚糖或功能上相似的抑制素共受體的存在增加了與ActRII結(jié)合的抑制素，并從而防止活化素與ActRII的結(jié)合。除了封閉活化素信號(hào)傳導(dǎo)途徑外，抑制素/β聚糖/ActRII復(fù)合物的形成可指導(dǎo)新的下游信號(hào)。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，可使用本領(lǐng)域能力內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有完整的解釋。見例如Maniatis，F(xiàn)ritsch & Sambrook，“Molecular CloningA Laboratory Manual”(1982)；“DNA CloningA LaboratoryManual”卷I和II(D.N.Glover編，1985)；“Oligonucleitide Synthesis”(M.J.Gait編，1984)；“Nucleic Acid Hybridization”[B.D.Hames & S.J.Higgins編(1985)]；“Animal Cell Culture”[R.I.Freshney編(1986)]；“ImmobilizedCells And Enzymoes”[IRL Press(1986)]；B.Perbal，“A practical Guide ToMolecular Cloning”(1984)。
因此，如果本文出現(xiàn)，下面的術(shù)語將具有下列定義。
本文所用的術(shù)語“cDNA”應(yīng)指基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的DNA拷貝。
本文所用的術(shù)語“衍生的氨基酸序列”應(yīng)意味著通過閱讀cDNA中核苷酸堿基的三個(gè)一組的序列確定的氨基酸序列。
本文所用的術(shù)語“文庫(kù)篩選”指用標(biāo)記的探針檢查是否在合適的條件下有序列與存在于特定DNA文庫(kù)中的探針互補(bǔ)的過程。另外“文庫(kù)篩選”可用PCR進(jìn)行。
本文所用的術(shù)語“PCR”指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它是Mullis的美國(guó)專利號(hào)4,683,195和4,683,202的主題，以及其它本領(lǐng)域現(xiàn)在已知的改進(jìn)。
本文所描述的氨基酸優(yōu)選是“L”異構(gòu)形式的。然而“D”異構(gòu)形式的殘基可取代任何L-氨基酸，只要免疫球蛋白結(jié)合的所需的功能被多肽保留。NH2指存在于多肽氨基端的游離氨基。COOH指存在于多肽羧基端的游離羧基。與標(biāo)準(zhǔn)多肽命名法一致，J.Biol.Chem.2433552-59(1969)，氨基酸殘基的縮寫是本領(lǐng)域已知的。
應(yīng)注意所有氨基酸殘基的序列在本文中是由化學(xué)式代表的，其左右朝向是從氨基端到羧基端的常規(guī)朝向。另外，應(yīng)注意氨基酸殘基序列開始和結(jié)束處的劃線表示與一個(gè)或多個(gè)其它氨基酸殘基序列的肽鍵。
“復(fù)制子”是任何作為體內(nèi)的自主DNA復(fù)制單元；即能在其自身控制下復(fù)制的基因元件(例如質(zhì)粒、染色體、病毒)。
“載體”是復(fù)制子，例如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，另一條DNA區(qū)段與其結(jié)合，因此使得結(jié)合的區(qū)段復(fù)制。
“DNA分子”指脫氧核糖核苷酸(腺苷酸、鳥苷酸、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的多聚形式，它可以是單鏈形式或雙鏈螺旋。該術(shù)語僅指分子的一級(jí)或二級(jí)結(jié)構(gòu)，不將其限于任何具體的三級(jí)形式。因此，該術(shù)語包括雙鏈DNA，尤其是線性DNA分子(例如限制性片段)、病毒、質(zhì)粒和染色體。在討論中，本文的結(jié)構(gòu)根據(jù)正常的常規(guī)僅是沿DNA非轉(zhuǎn)錄鏈的5’-3’方向的序列(即與mRNA序列相同的那條鏈)來給出。
“復(fù)制起始點(diǎn)”指參與DNA合成的DNA序列。
DNA“編碼序列”是雙鏈DNA序列，它在體內(nèi)當(dāng)置于合適的調(diào)控序列控制下時(shí)轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽。編碼序列的邊界是由5’(氨基)端的起始密碼子和3’(羧基)端的翻譯終止密碼子確定的。編碼序列可包括但不限于原核序列、來自真核mRNA的cDNA，來自真核(例如哺乳動(dòng)物)DNA的基因組DNA序列，和甚至合成的DNA序列。聚腺苷酸信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列總在編碼序列3’端。
轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列是DNA調(diào)控序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、聚腺苷酸信號(hào)、終止子等，提供在宿主細(xì)胞中編碼序列的表達(dá)。
“啟動(dòng)子序列”是一種能在細(xì)胞中與RNA聚合酶結(jié)合，引發(fā)下游(3’方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)域。為了限定本發(fā)明，啟動(dòng)子序列在其3’末端與轉(zhuǎn)錄引發(fā)位點(diǎn)結(jié)合，向上游(5’方向)延伸，以包括引發(fā)在背景以上的可檢測(cè)水平的轉(zhuǎn)錄所需的最少數(shù)目的堿基或元件。在啟動(dòng)子序列內(nèi)將發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，以及負(fù)責(zé)結(jié)合RNA聚合酶的蛋白質(zhì)結(jié)合域(共有序列)。真核啟動(dòng)子常常但不總是在-10和-35共有序列中含有Shine-Dalgarno序列。
“表達(dá)控制序列”是一種DNA序列，它控制和調(diào)節(jié)其它DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。當(dāng)RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄入mRNA，編碼序列在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的“控制下”，然后翻譯成編碼序列編碼的蛋白質(zhì)。
“信號(hào)序列”可包含在編碼序列附近。該序列編碼信號(hào)肽，在多肽的N-末端，它與宿主細(xì)胞通訊以將多肽定向到細(xì)胞表面或?qū)⒍嚯姆置谌虢橘|(zhì)，宿主細(xì)胞在蛋白質(zhì)離開細(xì)胞前切下該信號(hào)肽。可發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽與各種原核生物和真核生物天然的蛋白質(zhì)有關(guān)。
本文所用的術(shù)語“寡核苷酸”在指本發(fā)明的探針時(shí)，定義為含有兩個(gè)或多個(gè)核糖核苷酸，優(yōu)選三個(gè)以上的分子。其確切大小將由許多因素決定，它們又依賴于寡核苷酸的最終功能和用途。
本文所用的術(shù)語“引物”指寡核苷酸，不論它是以天然的純化的限制性消化產(chǎn)物存在，還是合成產(chǎn)生的，當(dāng)置于某些條件下能作為合成的起始點(diǎn)，這些條件是誘導(dǎo)與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成，即在核苷酸和誘導(dǎo)劑，例如DNA聚合酶和合適的溫度和pH條件下。引物可以是單鏈或雙鏈的，必需足夠長(zhǎng)，在誘導(dǎo)劑的存在下引發(fā)所需延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長(zhǎng)度將依賴于許多因素，包括溫度、引物來源和方法的使用。例如對(duì)于診斷用途，由靶序列的復(fù)雜性決定，寡核苷酸通常含有15-25個(gè)或更長(zhǎng)的核苷酸，雖然它可以含有較少的核苷酸。
選擇本文中的引物，使其“基本”與特定靶DNA序列的不同鏈互補(bǔ)。這意味著引物必需足夠互補(bǔ)，與其相應(yīng)的鏈雜交。因此，引物序列不需要反映模板的確切序列。例如，不互補(bǔ)的核苷酸片段可與引物的5’末端結(jié)合，而剩余的引物序列與該鏈互補(bǔ)。另外，可在引物中插入不互補(bǔ)的堿基或更長(zhǎng)的序列，條件是引物序列足夠與序列互補(bǔ)或與其雜交，從而形成合成延伸產(chǎn)物的模板。
本文所用的術(shù)語“限制性內(nèi)切核酸酶”和“限制性酶”指酶，它們各自在特定核苷酸序列處或附近切割雙鏈DNA。
當(dāng)DNA被引入細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞被外源或異源DNA“轉(zhuǎn)化”。轉(zhuǎn)化的DNA可以或可以不整合(共價(jià)連接)到細(xì)胞基因組中。在例如原核生物、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化的DNA可以維持在游離狀態(tài)，例如質(zhì)粒中。對(duì)于真核細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是其中轉(zhuǎn)化的DNA整合到染色體中，從而它可以通過染色體復(fù)制被子代細(xì)胞繼承。該穩(wěn)定性由真核細(xì)胞建立含有一群含轉(zhuǎn)化的DNA的子代細(xì)胞的細(xì)胞系或克隆來證明。“克隆”是一群通過有絲分裂衍生自單個(gè)細(xì)胞或祖先的細(xì)胞?！凹?xì)胞系”是一個(gè)能在體外穩(wěn)定生長(zhǎng)許多代的祖細(xì)胞的克隆。
當(dāng)至少約75％(優(yōu)選至少約80％，最優(yōu)選至少約90％或95％)核苷酸在限定長(zhǎng)度的DNA序列中匹配時(shí)，兩條DNA是“基本上同源的”?？赏ㄟ^用序列數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)軟件，或在例如如特定系統(tǒng)限定的嚴(yán)格條件下在Southern雜交實(shí)驗(yàn)中比較序列，來鑒定基本同源的序列。限定合適的雜交條件在本領(lǐng)域技術(shù)水平內(nèi)。見例如Maniatis等，見上；DNA Cloning，卷I & II，見上；Nucleic Acid Hybridization，見上。
DNA構(gòu)建物中的“異源”區(qū)是在更大的DNA分子中一個(gè)可鑒定的DNA區(qū)段，它與該更大的分子天然不結(jié)合。因此，當(dāng)異源區(qū)編碼哺乳動(dòng)物基因時(shí)，該基因通常側(cè)接有在來源生物體的基因組內(nèi)不側(cè)接哺乳動(dòng)物基因組DNA的DNA。在另一個(gè)例子中，編碼序列是一種構(gòu)建體，其中編碼序列本身在天然中不存在(如基因組編碼序列含有內(nèi)含子或合成性序列，具有與天然基因不同的密碼子的cDNA)。等位變體或天然存在的突變事件不產(chǎn)生如本文定義的DNA異源區(qū)。
通常用于這些研究的標(biāo)記是放射性元素、酶、當(dāng)接觸紫外光時(shí)發(fā)射熒光的化學(xué)物質(zhì)等。許多熒光物質(zhì)是已知的，并可用作標(biāo)記。這些包括例如熒光素、羅丹明、金胺、Texas Red、AMCA藍(lán)和Lucifer Yellow。特別的檢測(cè)物質(zhì)是在山羊中制備的抗兔抗體，并通過異硫氰酸與熒光素偶聯(lián)。
蛋白質(zhì)還可用放射性元件或酶標(biāo)記。放射性標(biāo)記可通過任何目前可得的計(jì)數(shù)法檢測(cè)。優(yōu)選的同位素可選自3H、14C、32p、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90y、125I、131I和186Re。
酶標(biāo)記也是有用的，并可用任何現(xiàn)在利用顯色、分光光度、熒光光度、電流測(cè)定或氣體定量技術(shù)來檢測(cè)。酶可以和所選的顆粒通過與橋聯(lián)分子，例如碳二亞胺、二異氰酸酯、戊二醛等偶聯(lián)。優(yōu)選的是過氧化物酶、β-葡糖苷酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶+過氧化物酶和堿性磷酸酶。其它標(biāo)記物質(zhì)和方法參考例如美國(guó)專利號(hào)3,654,090、3,850,752和4,016,043的公開內(nèi)容。
本領(lǐng)域開發(fā)和利用的特定分析系統(tǒng)稱作受體實(shí)驗(yàn)。在受體實(shí)驗(yàn)中，要分析的物質(zhì)合適標(biāo)記，然后用一定量的標(biāo)記接種一些細(xì)胞測(cè)試集落，然后進(jìn)行結(jié)合研究，測(cè)定標(biāo)記物質(zhì)與細(xì)胞受體結(jié)合的程度。用該方法可確定親和力之間的差異。
本領(lǐng)域有用的實(shí)驗(yàn)稱為“順式/反式”實(shí)驗(yàn)。簡(jiǎn)單說，該實(shí)驗(yàn)使用兩種基因構(gòu)建物，其中一種是通常是當(dāng)轉(zhuǎn)染入合適細(xì)胞系時(shí)，連續(xù)表達(dá)感興趣的特定受體的質(zhì)粒，第二種是在受體/配體復(fù)合物控制下表達(dá)報(bào)告子，例如熒光素酶的質(zhì)粒。因此例如，如果需要評(píng)估一種作為特定受體的配體的化合物，質(zhì)粒之一可以是導(dǎo)致在所選細(xì)胞系中表達(dá)受體的構(gòu)建體，而第二種質(zhì)粒將具有與熒光素酶基因連接的啟動(dòng)子，其中插入了特定受體的反應(yīng)元件。如果測(cè)試的化合物是受體的激動(dòng)劑，配體將與受體復(fù)合，得到的復(fù)合物將與反應(yīng)元件結(jié)合，引發(fā)熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄。然后進(jìn)行光度測(cè)定得到的化學(xué)發(fā)光，獲得劑量應(yīng)答曲線，并于已知配體的曲線比較。上述方法在美國(guó)專利號(hào)4,981,784中詳述。
一般說，含有促進(jìn)插入的DNA片段有效轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列的表達(dá)載體可與宿主連用。表達(dá)載體通常含有復(fù)制起始點(diǎn)、啟動(dòng)子、終止子以及能在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中提供表型選擇的特定基因。轉(zhuǎn)化的宿主可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法發(fā)酵和培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)最佳細(xì)胞生長(zhǎng)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可用于構(gòu)建含有合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。見例如，Sambrook等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版)Cold Spring Harbor Press，N.Y.中描述的技術(shù)。如果轉(zhuǎn)錄控制序列有效控制基因轉(zhuǎn)錄，基因及其轉(zhuǎn)錄控制序列被定義為“可操縱性連接”。本發(fā)明的載體包括但不限于質(zhì)粒載體和病毒載體。
本發(fā)明針對(duì)一種通過抑制抑制素/β聚糖復(fù)合物的形成，加大活化素誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的方法?？捎冕槍?duì)β聚糖胞外表位的抗血清抑制該復(fù)合物的形成。另外，可通過減少細(xì)胞中β聚糖的表達(dá)限制能形成復(fù)合物的β聚糖量。β聚糖的表達(dá)可通過抗-β聚糖反義轉(zhuǎn)錄物，或通過誘變細(xì)胞中一個(gè)或兩個(gè)β聚糖等位基因減少。同源重組是一種可用于使β聚糖突變的方法。垂體細(xì)胞是該方法的可能目標(biāo)，其中放大活化素信號(hào)傳導(dǎo)提高了促卵泡成熟激素(FSH)的產(chǎn)生和增強(qiáng)生殖力。另外，該方法可用于治療許多生殖、發(fā)育、皮膚、骨骼、肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如前列腺癌。
本發(fā)明還針對(duì)抗β聚糖抗血清，它抑制抑制素與β聚糖的結(jié)合?？寡蹇膳c藥物學(xué)上可接受的載體復(fù)合，形成藥物組合物。
還提供了通過增強(qiáng)抑制素/β聚糖復(fù)合物的形成抑制活化素-誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的方法。實(shí)現(xiàn)該目的的主要方法是通過提高所述細(xì)胞中β聚糖的表達(dá)。還可施用其它抑制素，來促進(jìn)復(fù)合物的形成。表達(dá)可通過轉(zhuǎn)染含有β聚糖基因的人工構(gòu)建物來增強(qiáng)。β聚糖基因可以組成型表達(dá)或在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。該方法還可用于在正常情況下不和抑制素反應(yīng)的細(xì)胞中引入對(duì)抑制素的敏感性。該方法可用于治療許多病理情況，包括生殖、反應(yīng)、皮膚、骨骼、肝臟、造血和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。具體例子包括治療性腺癌、腎上腺癌或肝發(fā)育不良。該方法還可用于促進(jìn)受傷肝組織的再生。
本發(fā)明還針對(duì)篩選抑制抑制素/β聚糖復(fù)合物形成，從而放大活化素信號(hào)傳導(dǎo)的化合物的方法。一種抑制素與β聚糖結(jié)合的測(cè)定法在表達(dá)β聚糖的細(xì)胞膜上進(jìn)行。如果化合物在用化合物處理的細(xì)胞膜中，比未處理細(xì)胞的得到更低水平的抑制素結(jié)合，該化合物抑制抑制素/β聚糖復(fù)合物的形成，并放大活化素信號(hào)傳導(dǎo)。該方法可用于測(cè)試許多可能的化合物，包括肽、蛋白質(zhì)和小分子。另外，該方法可用于篩選化合物，它提高抑制素/β聚糖復(fù)合物的形成，從而抑制活化素信號(hào)傳導(dǎo)。對(duì)此，化合物應(yīng)提高抑制素與膜的結(jié)合。
給出下列例子是為了說明本發(fā)明的各種實(shí)施例，而不是要以任何形式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合研究重組人活化素A和抑制素A是用J.Mather(Genetech Inc.)提供的穩(wěn)定表達(dá)活化素的細(xì)胞系產(chǎn)生的，該細(xì)胞系由Wolfgang Fischer(PBL，Salk Institute)純化。[125I]活化素A和[125I]-抑制素A是用氯亞明T法如前所述(7)制備的。
對(duì)于結(jié)合研究，用DEAE Dextran和10微克ActRII和/或10微克β聚糖質(zhì)粒DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用DNA培養(yǎng)細(xì)胞4小時(shí)，用含10％DMSO的Hepes解離緩沖液(HDB)休克，在37℃和5％CO2下，含有10％胎牛血清和L-谷氨酰胺的DMEM中培養(yǎng)48小時(shí)。匯合的單層用Hepes解離緩沖液洗滌兩次，重新懸浮在結(jié)合緩沖液(HepesDissociation Buffer，含0.1％BSA，5mM MgSO4和1.8mM CaCl2)中。通過在最終0.4毫升體積的結(jié)合緩沖液中存在或不存在各種濃度的未標(biāo)記抑制素或活化素的條件下，將約2×105個(gè)細(xì)胞與2×105cpm[125I]-抑制素A(約100pM)一起在室溫下保溫90分鐘，進(jìn)行結(jié)合。結(jié)合后，離心沉淀細(xì)胞，用結(jié)合緩沖液洗滌兩次。用γ計(jì)數(shù)器定量結(jié)合的[125I]-抑制素A，用Prism程序進(jìn)行結(jié)合數(shù)據(jù)的分析。
實(shí)施例2交聯(lián)研究在5％CO2下，完全DMEM(含有10％胎牛血清、青霉素、鏈霉素和L-谷氨酰胺)中生長(zhǎng)到約40-60％匯合的細(xì)胞中進(jìn)行交聯(lián)研究。細(xì)胞在10厘米培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)，然后用磷酸鈣沉淀法，用Hepes緩沖的鹽水(pH7.07)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞在5％CO2中培養(yǎng)48小時(shí)。用Hepes解離緩沖液漂洗各皿收集細(xì)胞，然后在含有1mM EDTA的Hepes解離緩沖液中培育10分鐘，釋放細(xì)胞。
將約106個(gè)重懸浮在Hepes解離緩沖液中的細(xì)胞與約2×106cpm[125I]-活化素A在總共500微升體積中室溫孵育1小時(shí)，一邊溫和振搖，進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。該培養(yǎng)后，在各試管中加入1毫升冷Hepes解離緩沖液，然后離心沉淀細(xì)胞，重新懸浮在500微升HDB中，加到0.5mM二琥珀酰辛二酸(DSS)中，在冰上孵育30分鐘。在各試管中加入1毫升TBS淬滅反應(yīng)。然后離心沉淀細(xì)胞，吸取并將沉淀在冰上溶于1毫升裂解緩沖液(20mM Tris-HCl，pH7.5，0.2mM EDTA，1％Triton X-100，1mMAEBSF，1mM EDTA，10微克/毫升亮抑肽酶、10微克/毫升胃酶抑素和1微克/毫升抑酶肽)30分鐘。離心除去TX-100-不溶性物質(zhì)，在各上清液中加入2微克抗-β聚糖或2微克抗-myc抗體。試管在4℃孵育16小時(shí)，在各試管中加入10微升50％蛋白質(zhì)G瓊脂糖(PGA)漿液沉淀免疫復(fù)合物，在4℃再保溫1小時(shí)，并離心沉淀固定的免疫復(fù)合物。用1毫升裂解緩沖液洗滌各蛋白質(zhì)G瓊脂糖沉淀三次，然后煮沸10分鐘，在25微升SDS樣品緩沖液中洗脫，通過SDS-PAGE分辨。所有SDS-PAGE在還原條件下，在聚丙烯酰胺3-8％Tris乙酸酯NuPAGE凝膠(Novex)上進(jìn)行SDS-PAGE。干燥凝膠，通過放射性自顯影檢測(cè)條帶。
實(shí)施例3AtT20和KK-1細(xì)胞中的熒光素酶測(cè)定在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中用良好確定特征的活化素/TGF-β-反應(yīng)性熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒3TPLux評(píng)估β聚糖的功能。測(cè)試了兩種小鼠細(xì)胞系；AtT20促皮質(zhì)激素細(xì)胞(在DMEM、10％FBS、2mML-谷氨酰胺和慶大霉素中生長(zhǎng))和KK-1卵細(xì)胞(在含有10％FBS、L-谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素的DMEMF12中生長(zhǎng))。胰蛋白酶消化細(xì)胞，以1.5-2×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度在轉(zhuǎn)染24小時(shí)前鋪在6孔平板中。細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中用約1微克3TPLux、0.1-0.2微克巨細(xì)胞病毒(CMV)-β-半乳糖苷酶(β-GAL)和0.1-0.3微克載體或β聚糖質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染在優(yōu)化的條件下，用市售的Superfect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen，Hilden，Germany)進(jìn)行。在培養(yǎng)2.5小時(shí)后，用含2％FBS的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，使其恢復(fù)5小時(shí)。15小時(shí)后用抑制素A和/或活化素A處理細(xì)胞15小時(shí)，然后收集在裂解緩沖液(1％Triton X-100、25mM甘氨酰甘氨酸，pH7.8，15mM MgSO4，4mM EGTA和1mM DTT)中。熒光素酶報(bào)告子活性是通過對(duì)相對(duì)的β-GAL活性標(biāo)定確定的。
實(shí)施例4免疫細(xì)胞化學(xué)正常的成年雄性和雌性Sprague-dawley大鼠(175-250克，Sprague Dawley)保持在標(biāo)準(zhǔn)箱、食物和光照條件(23℃，12小時(shí)光，12小時(shí)暗，早六點(diǎn)開燈)下。如前所述(MacConell等，1998)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)(ICC)。簡(jiǎn)單說，深度麻醉大鼠，經(jīng)心臟灌注4％聚甲醛。取出組織(大腦、垂體、睪丸或卵巢)，預(yù)先在相同的固定劑中固定1小時(shí)。將大腦轉(zhuǎn)移到10％蔗糖/0.02M磷酸鉀緩沖的鹽水(KPBS)中，4℃過夜儲(chǔ)藏。在顯微切片機(jī)上切下30μm冷凍的冠狀切片，如下處理自由漂浮切片，用于ICC分析。垂體、睪丸和卵巢組織被包埋在石蠟中，切下10微米切片，加到Superfrost Plus載玻片(Fish Scientific)上，加工用于ICC分析。所有與使用動(dòng)物有關(guān)的程序是根據(jù)聯(lián)邦、州和地方法律和團(tuán)體和NIH規(guī)則進(jìn)行的。
為了減少背景染色，組織切片在1％H2O2中保溫20分鐘，用KPBS漂洗，然后在含有0.3％Triton X-100、10％正常兔血清和2％BSA的KPBS中室溫保溫1小時(shí)。切片與25微克/毫升的β聚糖原始抗血清(R&D)在加有0.3％Triton X-100、2％正常兔血清和2％BSA的KPBS中4℃過夜溫育(作為對(duì)照，相鄰的切片單獨(dú)與正常山羊IgG或二抗溫育)。然后用KPBS漂洗組織切片，然后與1∶1,000稀釋的生物素化的家兔抗山羊二抗(Vector)在室溫下溫育1小時(shí)。KPBS洗滌過的組織與活化素-生物素-辣根過氧化物酶(Vector)的復(fù)合物室溫保溫1小時(shí)。然后過氧化物酶反應(yīng)在0.03％DAB和0.015％H2O2的0.1M Tris-HCl，pH7.4保溫3-5分鐘得到可見的棕色的反應(yīng)產(chǎn)物。將自由漂浮的腦切片放在Superfrost/Plus載玻片(FisherScientific)上，用光學(xué)顯微鏡觀察免疫反應(yīng)性。
實(shí)施例5β聚糖高親和力的結(jié)合抑制素，提高抑制素與ActRII的結(jié)合。
在一個(gè)篩選潛在的抑制素結(jié)合蛋白的過程中，在表達(dá)β聚糖的細(xì)胞中檢測(cè)到抑制素結(jié)合。圖1顯示從轉(zhuǎn)染β聚糖的HEK293細(xì)胞上分離的膜顯示特異性的、高親和力的抑制素結(jié)合[Ki＝0.6(0.5-0.9)nM]，而來自用空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞膜沒有可檢測(cè)的特異性抑制素結(jié)合。
為了進(jìn)一步確定表達(dá)ActRII或共表達(dá)ActRII和β聚糖的細(xì)胞分離物的膜中抑制素的結(jié)合，將編碼這些受體的cDNA轉(zhuǎn)染入HEK 293細(xì)胞，并進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)。當(dāng)ActRII單獨(dú)表達(dá)時(shí)，抑制素結(jié)合親和力十分低[Ki＝6.3nM(2.9-13.4)nM]，與先前的結(jié)果(9)一致，但當(dāng)ActRII與β聚糖共表達(dá)時(shí)，增加了30倍[Ki＝0.2(0.1-0.3)nM](圖1B)另外，共表達(dá)ActRII和β聚糖使抑制素結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)于單獨(dú)表達(dá)ActRII或β聚糖的細(xì)胞中結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目增加了約12倍或6倍(圖1A)。用β聚糖和ActRIIB進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)有相似結(jié)果；然而β聚糖對(duì)抑制素親和力和抑制素結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目的作用沒有如此劇烈(數(shù)據(jù)未顯示)。與β聚糖結(jié)合的活化素在HEK 293細(xì)胞中表達(dá)過程中檢測(cè)不到。另外，β聚糖不增加活化素與ActRII的結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)，表明β聚糖不能通過增加ActRII表達(dá)的方法來增加抑制素結(jié)合。
實(shí)施例6將抑制素與β聚糖共價(jià)交聯(lián)，和抑制素與ActRII-β聚糖復(fù)合物的共價(jià)交聯(lián)為了確定抑制素是否能和ActRII一起表達(dá)或不表達(dá)的β聚糖結(jié)合并形成復(fù)合物的能力，兩種受體在HEK 293細(xì)胞中表達(dá)。細(xì)胞用[125I]-抑制素，然后用共價(jià)交聯(lián)劑二琥珀酰辛二酸酯(DSS)處理細(xì)胞。然后用針對(duì)β聚糖胞外結(jié)構(gòu)域的ActRIImyc表位的抗體免疫沉淀交聯(lián)的抑制素-受體復(fù)合物。交聯(lián)的、免疫沉淀的復(fù)合物可通過SDS-PAGE分辨，并用放射性自顯影用肉眼觀察。
圖2A顯示了這樣的交聯(lián)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中單獨(dú)用載體(泳道1)、單獨(dú)用ActRII(泳道2)、β聚糖(泳道3)或β聚糖和ActRII一起(泳道7-10)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用[125I]-抑制素交聯(lián)在SDS-PAGE分析上，在被空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中得不到任何可見復(fù)合物(圖2A，泳道1)。在被ActRII單獨(dú)(圖2A，泳道2)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中檢測(cè)到約75-85kDa的共價(jià)復(fù)合物，與先前報(bào)道的抑制素/活化素-ActRII(8，9，18，19)的交聯(lián)復(fù)合物大小一致。將[125I]-抑制素與單獨(dú)用β聚糖轉(zhuǎn)染的細(xì)胞交聯(lián)得到約110kDa的復(fù)合物，和另一條175-250kDa的擴(kuò)散條帶(圖2A、泳道3)。先前用[125I]抑制素交聯(lián)的β聚糖的實(shí)驗(yàn)已顯示具有相似遷移率(27，28)的復(fù)合物，代表β聚糖核心蛋白(約110kDa)和具有糖胺聚糖鏈(200-300kDa)的β聚糖。因此，抑制素標(biāo)記后所見的條帶含有預(yù)測(cè)形式的β聚糖。
先前報(bào)道了在表達(dá)β聚糖的細(xì)胞中存在的大小范圍相同的抑制素復(fù)合物具有相似的高分子量(5，24，38)。加入25nM未標(biāo)記的抑制素或5nM未標(biāo)記的TGF-β防止抑制素與β聚糖交聯(lián)(圖2A，泳道4和6)。相反，25nM未標(biāo)記的活化素沒有作用(圖2A，泳道5)。這些結(jié)果說明了活化素缺乏該蛋白聚糖的親和力，和β聚糖與抑制素的α亞基結(jié)合的可能性。TGF-β封閉抑制素交聯(lián)的能力表明抑制素的結(jié)合位點(diǎn)與β聚糖上的至少一種TGF-β結(jié)合位點(diǎn)重疊。
當(dāng)ActRII和β聚糖共表達(dá)時(shí)，抑制素-交聯(lián)受體復(fù)合物的水平劇烈增加，[125I]-抑制素和ActRII和β聚糖之間的共價(jià)復(fù)合物是明顯的(圖2A，泳道7)。預(yù)計(jì)大小范圍內(nèi)的抑制素標(biāo)記的復(fù)合物與針對(duì)ActRII的抗-myc抗體共同免疫沉淀(圖2A，泳道7)，提供了抑制素、ActRII和β聚糖相互作用，形成寡聚抑制素受體復(fù)合物的證據(jù)。25nM未標(biāo)記的抑制素的存在在表達(dá)兩種受體的細(xì)胞中完全封閉了[125I]-抑制素對(duì)ActRII和β聚糖的標(biāo)記(圖2A，泳道8)。相反加入25nM活化素或5nM TGF-β對(duì)用[125I]-抑制素標(biāo)記的條帶強(qiáng)度幾乎沒有作用(圖2A，泳道9和10)。未標(biāo)記的TGF-β不能封閉抑制素與和ActRII共表達(dá)的β聚糖交聯(lián)是和存在ActRII/β聚糖復(fù)合物，它與抑制素結(jié)合，而不是TGF-β結(jié)合一致的。
除了其與重組β聚糖和ActRII在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中形成交聯(lián)的復(fù)合物的能力外，抑制素還與內(nèi)源β聚糖和ActRII在小鼠卵巢細(xì)胞系KK-1中結(jié)合并形成交聯(lián)的復(fù)合物(圖2B)(38)?？稍谟每功戮厶强寡?泳道2)或抗ActRII抗血清(泳道4)免疫沉淀后目測(cè)這些復(fù)合物。通過與過量的未標(biāo)記抑制素A溫育，封閉標(biāo)記的復(fù)合物的形成(圖2B)。免疫沉淀的復(fù)合物包括β聚糖核心蛋白、具有糖胺聚糖鏈的β聚糖和ActRII，但是活化素I型受體Alk4不存在于復(fù)合物中(圖2B)。用125I-活化素標(biāo)記KK-1細(xì)胞，然后交聯(lián)和用抗-β聚糖抗體免疫沉淀，顯示內(nèi)源β聚糖不與活化素形成共價(jià)復(fù)合物(泳道7和9)。當(dāng)活化素-交聯(lián)的細(xì)胞被抗-ActRII抗體免疫沉淀時(shí)，可見ActRII和Alk4，而不是β聚糖。
實(shí)施例7抑制素應(yīng)答性組織中β聚糖的表達(dá)足夠的證據(jù)提示抑制素是一種下丘腦-垂體-性腺軸的重要的旁分泌/自分泌調(diào)節(jié)劑(39)。因此，用免疫細(xì)胞化學(xué)來評(píng)估是否β聚糖蛋白的組織特異性分布與記錄的有抑制素反應(yīng)性的組織一致。令人驚奇的是，盡管相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間以來已知β聚糖是一種TGF-β受體，β聚糖體內(nèi)的組織分布仍然很大程度上未被探索。圖3總結(jié)了正常成年大鼠大腦、垂體、卵巢和睪丸中β聚糖的免疫組織化學(xué)定位。
可能抑制素最廣為人知的功能是其選擇性抑制垂體前葉FSH分泌(1，40-42)。如圖3B所示，與β聚糖介導(dǎo)抑制素應(yīng)答的作用一致，在正常成年雄性大鼠垂體腺的整個(gè)前葉中的細(xì)胞亞類中觀察到強(qiáng)β-聚糖-免疫應(yīng)答，顯示優(yōu)勢(shì)胞質(zhì)定位。這些垂體前葉中的β聚糖-免疫陽(yáng)性細(xì)胞類型可代表促性腺激素細(xì)胞和促乳激素細(xì)胞，因?yàn)檫@些垂體細(xì)胞類型主要分別是抑制素和TGF-β靶(43-45)。有趣的是，還在垂體中葉的一大類細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)β聚糖-免疫應(yīng)答(圖3C)。雖然該葉中的細(xì)胞上抑制素作用未被記錄，報(bào)道了TGF-β1與中葉的促黑激素細(xì)胞共同定位，表明它在調(diào)節(jié)該細(xì)胞類型中起到了作用(46)。β聚糖的陽(yáng)性免疫染色在垂體的后葉中檢測(cè)不到(圖3C)。
在睪丸內(nèi)，在大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中觀察到輕微的β聚糖染色，但在支持細(xì)胞或精細(xì)胞中在任何階段沒有可見的可辨別染色(圖3D)。另外，附睪間質(zhì)染成對(duì)β聚糖陽(yáng)性(圖3E)。β聚糖對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的免疫定位與由睪丸支持細(xì)胞分泌的抑制素局部作用，以調(diào)節(jié)睪丸膠質(zhì)細(xì)胞中的類固醇生成作用的事實(shí)(47，48)，以及抑制素特異性結(jié)合位點(diǎn)被定位到該細(xì)胞類型的事實(shí)(49)一致。然而，精細(xì)胞上不能染色根據(jù)抑制素對(duì)配子聲稱的作用的報(bào)道，有些出乎意料(50，51)。
在粒層細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞和間隙細(xì)胞中觀察到卵巢內(nèi)陽(yáng)性β聚糖免疫染色(圖3F)。與睪丸中的發(fā)現(xiàn)類似，該定位與記載的抑制素對(duì)大鼠卵泡膜細(xì)胞的雄激素生產(chǎn)的作用相符(47)。
在成年雄性大鼠大腦中，在前腦的tenia tecta中β聚糖-免疫反應(yīng)性(ir)纖維(圖3A)。還在大鼠前腦的中隔海馬回核中發(fā)現(xiàn)β聚糖-ir纖維(數(shù)據(jù)未顯示)。值得注意的是，該β聚糖在tenia tecta中的中心定位對(duì)應(yīng)于抑制素/活化素α-和βA-亞基mRNA在該相同區(qū)域中的存在(52)。因此可能大腦區(qū)域中分泌的成熟抑制素與類似定位的β聚糖相互作用。雖然α、βA和βB亞基蛋白和mRNA廣泛分布在大鼠大腦的整個(gè)rostrocaudal extent中(雖然是低水平)，β聚糖-ir纖維的檢測(cè)限于這兩個(gè)大腦區(qū)域，在大鼠大腦的任何區(qū)域未觀察到β聚糖的核周體染色?？赡堞戮厶窃谄渌竽X區(qū)域中的表達(dá)由于低翻譯、迅速蛋白質(zhì)降解或蛋白質(zhì)的快速運(yùn)輸在免疫組織化學(xué)的可檢測(cè)水平之下，表明大鼠的秋水仙素處理可能是目測(cè)對(duì)β聚糖免疫陽(yáng)性細(xì)胞體必需的。還可能在這些區(qū)域內(nèi)表達(dá)與β聚糖不同的相關(guān)抑制素受體成分，進(jìn)行與β聚糖類似的介導(dǎo)抑制素反應(yīng)的功能。
實(shí)施例8β聚糖介導(dǎo)促腎上腺皮質(zhì)激素細(xì)胞和卵巢細(xì)胞系中活化素信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗。
雖然許多活化素反應(yīng)被抑制素有效封閉，還有抑制素對(duì)活化素反應(yīng)沒有可測(cè)量作用的情況(5，6，53，54)。已顯示例如在過度表達(dá)ActRII的K562紅白血病細(xì)胞中，3TPLux報(bào)告質(zhì)粒活化素介導(dǎo)的誘導(dǎo)不受加入高濃度抑制素的影響(5)。先前描述了活化素A抑制促腎上腺皮質(zhì)激素細(xì)胞系A(chǔ)tT20中堿性ACTH的分泌的能力，其中抑制素類似的被發(fā)現(xiàn)對(duì)活化素反應(yīng)沒有作用(6)。
為了直接測(cè)試β聚糖是否能介導(dǎo)抑制素封閉活化素信號(hào)傳導(dǎo)，將大鼠β聚糖cDNA和3TPLux報(bào)告子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入AcT20細(xì)胞，來確定是否β聚糖能對(duì)這些細(xì)胞賦予抑制素反應(yīng)性。在轉(zhuǎn)染后，測(cè)量抑制素封閉活化素誘導(dǎo)熒光素酶的活性。
圖4A顯示當(dāng)AtT20被空3TPLux載體或表達(dá)β聚糖xDNA的3TPLux載體共轉(zhuǎn)染后，提高的活化素A濃度導(dǎo)致3TPLux活性劑量依賴性的增加。然而當(dāng)另外用2.5nM抑制素處理細(xì)胞時(shí)，β聚糖轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中活化素的反應(yīng)大大下降，而被空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中活化素反應(yīng)不受抑制素的影響(圖4A)。
為了測(cè)量該β聚糖介導(dǎo)的抑制素作用的劑量依賴性，再次用空載體或含有β聚糖的3TPLux質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用一定范圍濃度的抑制素A(圖4B)在存在或不存在1nM活化素A的情況下處理轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。如圖4B所示，抑制素封閉3TPLux的活化素誘導(dǎo)的活性是劑量依賴性的，并且需要β聚糖。抑制素在表達(dá)β聚糖的細(xì)胞中的該作用是濃度依賴性的，抑制素的估計(jì)IC50具有8-10pM(圖4B)。
還測(cè)試了β聚糖對(duì)兩種其它細(xì)胞系的抑制素反應(yīng)性的作用。雖然發(fā)現(xiàn)卵巢細(xì)胞系KK-1具有弱抑制素反應(yīng)性(數(shù)據(jù)未顯示)，但是被β聚糖cDNA轉(zhuǎn)染的KK-1細(xì)胞變得對(duì)抑制素高度敏感。在過度表達(dá)活化素受體的K562紅白血病細(xì)胞(KAR6)中，3TPLux報(bào)告子質(zhì)粒的活化素介導(dǎo)的誘導(dǎo)在很大程度上未受加入高濃度抑制素的影響(5)。圖4D顯示KAR6細(xì)胞還顯示活化素誘導(dǎo)的熒光素酶報(bào)告活性在轉(zhuǎn)染β聚糖cDNA后，而不是在轉(zhuǎn)染空載體后抑制素依賴性的減少。
聯(lián)合結(jié)合和交聯(lián)結(jié)果，這些結(jié)果進(jìn)一步支持了一種模型，其中β聚糖作為抑制素受體，初始抑制素與ActRII結(jié)合，從而限制活化素與ActRII的接觸，并拮抗活化素信號(hào)傳導(dǎo)。值得注意的是雖然β聚糖/ActRII的抑制素估計(jì)的親和力是約200pM，抑制素對(duì)功能性實(shí)驗(yàn)中測(cè)試的這三種細(xì)胞類型的反應(yīng)的IC50值范圍低得多(5-50pM)。在一些實(shí)驗(yàn)中，在未加入抑制素時(shí)，β聚糖過度表達(dá)可變的抑制活化素誘導(dǎo)的報(bào)告子活性，提示β聚糖與ActRII在不存在抑制素的情況下相互作用，來干涉活化素信號(hào)傳導(dǎo)。不能排除可能抑制素/ActRII/β聚糖復(fù)合物還可引發(fā)新的與活化素誘導(dǎo)的不同的信號(hào)來產(chǎn)生不依賴于活化素或其受體復(fù)合物的抑制素反應(yīng)。
實(shí)施例9
抗-β聚糖抗血清實(shí)驗(yàn)為了研究?jī)?nèi)源β聚糖在介導(dǎo)抑制素作用中的可能的生理學(xué)重要性，對(duì)β聚糖胞外功能域的一部分產(chǎn)生抗體，檢測(cè)了這些抗體對(duì)抑制素的生物反應(yīng)的作用。在家兔中產(chǎn)生抗-β聚糖抗血清(Ab-BG)，針對(duì)之前報(bào)道得到的序列，得到能封閉β聚糖-依賴性TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的抗體(34)。圖5顯示抑制素將FSG分泌減少到對(duì)照或正常家兔血清(NRS)處理的細(xì)胞中測(cè)量的約30％。加入Ab-βG以劑量依賴形式逆轉(zhuǎn)該抑制素作用，而以等劑量加入的正常加入血清(NRS)沒有作用。這些數(shù)據(jù)表明β糖苷免疫中和抑制抑制素抑制原代垂體細(xì)胞分泌FSH的能力。這支持了β聚糖或免疫學(xué)上相關(guān)的蛋白質(zhì)與抑制素對(duì)垂體的作用有關(guān)的猜想。
實(shí)施例10抑制素與β聚糖和ActRII的相互作用的可能模型幾種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子需要細(xì)胞表面的蛋白聚糖來獲得與其相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)受體的接觸，并施加生物應(yīng)答(55)。本文列出的數(shù)據(jù)與一種模型(圖6)一致，其中抑制素/β聚糖復(fù)合物與活化素競(jìng)爭(zhēng)與ActRII的接觸。這因此可以防止活化素/ActRII復(fù)合物的形成，這種復(fù)合物是隨后ALK4的補(bǔ)充和活化素信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)必需的。該模型與對(duì)于TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)提出的機(jī)制類似但結(jié)果不同，在后者中β聚糖濃縮細(xì)胞表面的TGF-β，將其遞呈給其協(xié)同II型受體來增強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)(56)。近來提出的有關(guān)紅木(Mahogany)的蛋白聚糖促進(jìn)拉美刺鼠的MSH拮抗劑與MSH受體(57，58)結(jié)合的作用最可能是與β聚糖對(duì)于本文報(bào)道的抑制素作用的影響。
本文引用了下列參考文獻(xiàn)1.Vale等，1988，蛋白質(zhì)激素的抑制素家族的化學(xué)和生物學(xué)鑒定。于Laurentian激素會(huì)議，1988 Clark，JH.(編)Resent Progresss in HormoneResearch，Inc.，San Diego卷44，1034。
2.Vale等，1998，活化素、抑制素和受體絲氨酸超家族以及Smad蛋白質(zhì)。于關(guān)于卵巢功能性Sapporo的第四屆Sapporo國(guó)際專題討論會(huì)，1998年一月到1998八月7-8。
3.Kessler Dam，DA(1994)脊椎動(dòng)物胚胎誘導(dǎo)中胚層和神經(jīng)圖式。Science266596-604。
4.Vale W，Rivier C 1995活化素和抑制素。于Munson P(編)，藥物學(xué)原理基礎(chǔ)概念和臨床應(yīng)用。Chapman & Hall，New York，883-886。
5.Lebrun，J-J，Vale WW 1997活化素和抑制素對(duì)I型和II型活化素受體的配體依賴性異二聚化作用和人紅細(xì)胞樣細(xì)胞分化的拮抗作用。
6.Bileziljian等，1991，活化素-A抑制AtT20細(xì)胞中鴉黑皮素原信使RNA聚集和促腎上腺皮質(zhì)激素的分泌，Mol Endocriniol 51389-1395。
7.Massague J 1990轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β家族，Annu.Rev.Cell Biol 6597-641。
8.Attisano等，1996，活化素受體復(fù)合物的信號(hào)傳導(dǎo)的激活Mol.Cell.Biol.161066-1073。
9.Mathews LS，Vale WW 1991活化素受體，以后預(yù)測(cè)多種跨膜絲氨酸激酶的表達(dá)克隆，Cell 65973-982。
10.Mathews等，1992第二類活化素受體的克隆和在非洲爪蟾胚胎中的特征確定，Science 2551702-1705。
11.Attisano等，1992，新活化素受體不同的基因和另外的mRNA剪切產(chǎn)生了絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的文庫(kù)，Cell 6897-108。
12.Lin等，1992，表達(dá)克隆TGF-βII型受體，一種功能上跨膜絲氨酸/蘇氨酸，Cell 68775-785。
13.Ten Dijke等，1993，活化素受體樣激酶一類具有預(yù)測(cè)的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的新的細(xì)胞表面受體亞類，Oncogene，82879-2887。
14.Carcamo等，1994，I型受體指定生長(zhǎng)抑制和對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β和活化素的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。Mol.Cell.Biol 143810-3821。
15.Yamashita等(1994)，用于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β的i型和II型受體的異源寡聚復(fù)合物的形成。J.Biol.Chem.26920172-20178。
16.Daopin S等，1992，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子2的晶體結(jié)構(gòu)該超家族不尋常的折疊。Science 257373。
17.Griffith DL等，1996，重組人成骨蛋白1的三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的結(jié)構(gòu)范例，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93878-883。
18.Martens等，1997，抑制素在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞內(nèi)的活化素受體復(fù)合物水平上干涉活化素信號(hào)傳導(dǎo)，Endocrinology 1382928-36。
19.Xu等，1995，抑制素通過顯性-隱性機(jī)制拮抗活化素對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，J.Biol.Chem.2706308-6313。
20.Yu等，1987，F(xiàn)SH釋放蛋白質(zhì)和抑制素在紅細(xì)胞分化中的作用，Nature330765-767。
21.Derynck R，Zhang Y，F(xiàn)eng XH 1998 SmadsTGF-β反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄激活物，Cell 95737-740。
22.Massague J 1998 TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，Annu.Rev Biochem 67753-91。
23.Xu等，1995，顯陰性的骨形態(tài)發(fā)生蛋白4受體導(dǎo)致非洲爪蟾外胚層中的神經(jīng)化Biochem Biophys Res Commun 212212-9。
24.Woodruff T，1998，抑制素a-亞基敲除的小鼠的性腺腫瘤中抑制素受體的鑒定，Journal of Biological Chemistry 273398-403。
25.Hertan，R.等，1999，對(duì)培養(yǎng)物中羊垂體細(xì)胞鑒定抑制素的高親和力結(jié)合位點(diǎn)，Endocrinology 140，6-12。
26.Massague J，與B1985類似，β型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的細(xì)胞受體，J.Biol.Chem.2602636-2645。
27.Lopez-Casillas等，1991，膜蛋白聚糖β聚糖，TGF-β受體系統(tǒng)的一個(gè)成員的結(jié)構(gòu)和表達(dá)，Cell 67785-95。
28.Wang等，1991，TGF-βIII型受體的表達(dá)克隆和特征確定67797-805。
29.Derynck R，F(xiàn)eng XH，1997，TGF-β受體信號(hào)傳導(dǎo)，Biochem Biophys Acta1333F105-50。
30.Wang等，1991，TGF-βIII型受體的表達(dá)克隆和特征確定，Cell 67797-805。
31.Lopez-Casillas等，β聚糖可作為TGF-β接觸信號(hào)傳導(dǎo)受體的雙重調(diào)節(jié)劑配體結(jié)合與GAG接觸位點(diǎn)的作圖，J Cell Biol 124557-68。
32.Sun L，Chen C 1997，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βIII型受體的表達(dá)抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的腫瘤原性，J.Biol.Chem.27225367-72。
33.Chen C，Wang XF，Sun L 1997，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)III型受體的表達(dá)恢復(fù)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的TGFβ1活性，J.Biol.Chem.27212862-7。
34.Brown等，1999，心臟中心內(nèi)膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化對(duì)于III型TGF-β受體的要求，Science 2832080-2。
35.Chen C，Okayama H.1987，質(zhì)粒DNA對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的高效率轉(zhuǎn)化，Mol.Cell.Biol.72745-2752。
36.Vale W等，1983于酶學(xué)方法神經(jīng)內(nèi)分泌肽Conn P M(編)Academic Press，New York，pp.565-577。
37.Kananen K等，1995，攜帶小鼠抑制素α-亞基啟動(dòng)子/猿病毒t-抗原融合基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中的性腺腫瘤原性卵巢腫瘤的確定特征和促性腺素反應(yīng)性粒層細(xì)胞系的建立，Molecular Endocrinology，9616-627。
38.Mason等，1985，卵巢卵泡液抑制素的互補(bǔ)DNA序列顯示前體結(jié)構(gòu)和與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β的同源性，Nature 318659-663。
39.Vale等，1990，生長(zhǎng)因子的抑制素/活化素家族，于Sporn等(編)，肽生長(zhǎng)因子及其受體，實(shí)驗(yàn)藥物學(xué)手冊(cè)，Springer-Verlag，Heidelberg，卷95/II，211-248。
40.Mason等，1985，卵巢卵泡液抑制素的互補(bǔ)DNA序列顯示前體結(jié)構(gòu)和與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β的同源性，Nature 318659-663。
41.Mason等，1986，兩種人卵巢抑制素的結(jié)構(gòu)，Biochem Biophys Res Commun135957-64。
42.Mayo等，1986，來自豬卵巢和人胎盤的抑制素α-亞基cDNA，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835849-5853。
43.Carroll等，1989，抑制素、活化素和濾泡素抑制素濾泡刺激性激素信使核糖核酸水平的調(diào)節(jié)，Mol.Endocrinol 31969-1976。
44.Sarkar DK，Kim KH，Minami S 1992，垂體腺中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1信使RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)-其對(duì)促乳激素分泌和促乳激素細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，Mol Endocrinol61825-183345.Sarkar等，1998，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-βI型和TGF-βII型受體在垂體促乳激素細(xì)胞中對(duì)分泌性TGF-β1調(diào)節(jié)的基因表達(dá)中的作用，Endicrinology1393620-8。
46.Burns G，Sarkar DK 1993，大鼠垂體腺中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1-樣免疫反應(yīng)性雌激素的作用，Endocrinology 1331444-9。
47.Hsueh等，1987，抑制素亞基的雜二聚體和同二聚體具在調(diào)節(jié)黃體素化激素刺激的雄激素生物合成中有不同的旁分泌作用，Proc.Natl.Acad.Sci.USA845082-5086。
48.Morris等，1988，富含原代睪丸足細(xì)胞的培養(yǎng)物產(chǎn)生的抑制素濾泡刺激性激素、雄激素和表皮生長(zhǎng)因子的調(diào)控，Endocrinology 122717-725。
49.Krummen等，1994通過原位配體結(jié)合對(duì)睪丸中發(fā)育過程中抑制素和活化素結(jié)合位點(diǎn)定位，Biol.Reprod 50734-44。
50.Hakovirta等，1993，大鼠精小管上皮循環(huán)中活化素-A、抑制素-A和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1對(duì)階段特異性脫氧核酸合成的作用，Endocrinology 1331664-l668。
51.van Dissel-Emiliani等，1989，抑制素減少成年小鼠和中國(guó)倉(cāng)鼠睪丸中精原細(xì)胞數(shù)量，Endocrinology 1251899-1903。
52.Roberts VJ，Barth SL，Meunier H，Vale W 1996大鼠大腦中抑制素/活化素亞基和信使核糖核酸的雜交組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)定位，J CompNeurology 364473-493。
53.Schubert D等，1990，活化素是一種神經(jīng)細(xì)胞存活分子，Nature344868-870。
54.Darland DC等，1995，睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)育目標(biāo)中濾泡素抑制素表達(dá)顯示了調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)表型的作用，Neutron，15857-866。
55.Schlessinger J等，1995，蛋白聚糖對(duì)生長(zhǎng)因子活化的調(diào)節(jié)低親和力受體的作用是什么？Cell 83357-360。
56.Lopez-Casillas等，1993，β聚糖代表了TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)受體的配體，Cell731435-44。
57.Gunn TM等，1999，小鼠mahogany基因座編碼人吸引素(attractin)的跨膜形式，Nature 398152-156。
58.Nagle D等，1999 Nature，398148-152。
本說明書中提到的任何專利表明了本發(fā)明涉及的領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。這些專利和出版物在此引入以供參考，其程度如同各獨(dú)立出版物特別并分別表明引入以供參考。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將不難理解本發(fā)明適合實(shí)施目的并獲得提到的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)，以及那些本文中提到的目的、結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)。本文的實(shí)施例以及方法、程序、療法、分子和本文所述的具體化合物是優(yōu)選例的代表，是示范性的，不意味著限制本發(fā)明的范圍。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員可進(jìn)行改變和其他用途，這些在權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種增加細(xì)胞中活化素誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的方法，其特征在于，該方法包括步驟抑制所述細(xì)胞表面抑制素/β聚糖復(fù)合物的形成。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制素/β聚糖復(fù)合物的形成被針對(duì)β聚糖的胞外表位的抗-β聚糖抗血清所抑制。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞中β聚糖的表達(dá)被抑制。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，β聚糖的表達(dá)被β聚糖的反義轉(zhuǎn)錄物抑制。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，β聚糖的表達(dá)被所述細(xì)胞中至少一個(gè)β聚糖等位基因的誘變抑制。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述β聚糖等位基因通過同源重組突變。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是垂體細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，活化素信號(hào)傳導(dǎo)的增強(qiáng)提高了所述細(xì)胞中促卵泡成熟激素的產(chǎn)生。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法增加了生育力。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化素信號(hào)傳導(dǎo)的增加減輕了所述細(xì)胞中的病理狀況。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述病理狀況選自生殖、發(fā)育、皮膚、骨骼、肝臟、造血和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述病理狀況是前列腺癌。
13.一種針對(duì)β聚糖胞外部分的抗血清，其特征在于，所述抗血清抑制抑制素與β聚糖的結(jié)合。
14.一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物含有權(quán)利要求13所述的抗血清和藥物學(xué)載體。
15.一種抑制細(xì)胞中活化素誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的方法，其特征在于，該方法包括步驟增加所述細(xì)胞表面形成的抑制素/β聚糖復(fù)合物。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述抑制素/β聚糖復(fù)合物的形成是通過提高所述細(xì)胞中β聚糖的表達(dá)增加的。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，該方法還包括步驟對(duì)所述細(xì)胞施用其它抑制素。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，通過用含有β聚糖基因的人工構(gòu)建物轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞增加β聚糖表達(dá)。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述β聚糖基因組成型表達(dá)。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述β聚糖基因是由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)的。
21.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法用于在活化素信號(hào)傳導(dǎo)不受抑制素正常影響的細(xì)胞中引起對(duì)抑制素的敏感性提高。
22.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述活化素信號(hào)傳導(dǎo)的抑制減輕了所述細(xì)胞中的病理狀況。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述病理狀況選自生殖、發(fā)育、皮膚、骨骼、肝臟、造血和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述病理狀況選自性腺癌、腎上腺癌和肝臟發(fā)育不良。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，該方法用于促進(jìn)受傷肝臟中的肝臟再生。
26.一種篩選抑制抑制素/β聚糖復(fù)合物形成，從而提高活化素信號(hào)傳導(dǎo)的化合物的方法，其特征在于，該方法包括步驟a)在所述化合物存在或不存在下培育來自表達(dá)β聚糖的細(xì)胞的膜；b)進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)量抑制素對(duì)β聚糖的結(jié)合；c)比較與所述化合物一起培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)未處理細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果，其中抑制抑制素/β聚糖復(fù)合物形成的化合物將導(dǎo)致更低水平的抑制素結(jié)合。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述化合物選自肽、蛋白質(zhì)和小分子。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述試驗(yàn)是標(biāo)記和未標(biāo)記抑制素之間的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)。
29.一種用權(quán)利要求26所述的方法鑒定出的化合物。
30.一種篩選化合物的方法，該化合物提高抑制素/β聚糖復(fù)合物的形成，來抑制活化素信號(hào)傳導(dǎo)，其特征在于，該方法包括步驟a)在所述化合物存在或不存在下培育來自表達(dá)β聚糖的細(xì)胞的膜；b)進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)量抑制素與β聚糖的結(jié)合；c)比較與所述化合物一起培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)未處理細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果，其中提高抑制素/β聚糖復(fù)合物形成的化合物將導(dǎo)致更高水平的抑制素結(jié)合。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述化合物選自肽、蛋白質(zhì)和小分子。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述試驗(yàn)是標(biāo)記和未標(biāo)記抑制素之間的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)。
33.一種用權(quán)利要求30所述的方法鑒定出的化合物。
全文摘要
抑制素和活化素是可逆調(diào)控多種調(diào)節(jié)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)激素。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)揭示了β聚糖、III型TGF－β受體，還起到了抑制素受體的作用。β聚糖上調(diào)抑制素與ActRII活化素受體的結(jié)合。通過上調(diào)抑制素與ActRII的結(jié)合，β聚糖有效隔絕了ActRII與活化素結(jié)合，從而減弱了活化素信號(hào)傳導(dǎo)。另外，ActRII－β聚糖復(fù)合物可產(chǎn)生與通過ActRII和ALK4的活化素信號(hào)傳導(dǎo)不同的新信號(hào)。β聚糖在大鼠大腦的不連續(xù)核和成年大鼠的垂體、睪丸和卵巢內(nèi)的特定類型細(xì)胞中產(chǎn)生。抑制素－反應(yīng)性組織和細(xì)胞類型中β聚糖的存在，以及該蛋白聚糖能結(jié)合抑制素，并賦予抑制素敏感性的能力，與β糖苷作為抑制素特異性受體，調(diào)節(jié)各種組織中抑制素反應(yīng)的作用一致。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1450907SQ00818570
公開日2003年10月22日 申請(qǐng)日期2000年12月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月15日
發(fā)明者W·韋爾, P·C·格雷, A·L·布倫特, K·A·劉易斯, L·M·比利齊吉 申請(qǐng)人:研究發(fā)展基金會(huì)