本發(fā)明涉及一種提高阿魏酸酯酶酶活的方法，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73，ferulic acid esterase，F(xiàn)AE)又稱為肉桂酸酯酶，屬羧酸酯水解酶的亞類之一，是指能夠水解植物細(xì)胞壁中多糖與阿魏酸連接的酯鍵，釋放出游離的單體阿魏酸或阿魏酸二聚體。1991年，首次從橄欖色鏈霉菌(Streptomyces olitrochromogenes)中分離得到阿魏酸酯酶，目前已有超過30種阿魏酸酯酶被分離和純化。阿魏酸酯酶來源廣泛，普遍存在于真菌、細(xì)菌、植物中，絕大多數(shù)阿魏酸酯酶是從真菌尤其是曲霉菌屬(Aspergillus sp.)中分離得到，如黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、泡盛曲霉(A.awamori)和構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)等。然而，由于大多數(shù)野生菌株產(chǎn)阿魏酸酯酶能力很低，如黑曲霉發(fā)酵后酶活僅在10-96mU/mL之間，這就限制了該酶的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

基因的外源表達(dá)可以實(shí)現(xiàn)目的蛋白的高效生產(chǎn)。很多科研工作者將不同來源的阿魏酸酯酶基因?qū)脒m宜的表達(dá)體系中，以構(gòu)建高產(chǎn)阿魏酸酯酶的重組工程菌。2001年，Juge等在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了黑曲霉阿魏酸酯酶基因的異源高效表達(dá)，重組阿魏酸酯酶表達(dá)量為300mg/L。在國內(nèi)，張帥兵等將黑曲霉阿魏酸酯酶基因?qū)氘叧嘟湍窯S115中，分泌表達(dá)的重組阿魏酸酯酶酶活達(dá)16.6U/mL。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種阿魏酸酯酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供含有所述基因的載體或細(xì)胞系。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述基因編碼的阿魏酸酯酶。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種產(chǎn)阿魏酸酯酶的基因工程菌，是以pPICZαA為載體，以畢赤酵母X-33為宿主，表達(dá)所述阿魏酸酯酶基因。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供所述基因工程菌的構(gòu)建方法，是將SEQ ID NO.2所示基因與載體連接，再轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述載體是pPICZαA。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述宿主是畢赤酵母X-33.

本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種提高阿魏酸酯酶酶活的方法，是將基因工程菌接種至BMMY培養(yǎng)基中，200～280rpm培養(yǎng)3～8d。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述BMMY培養(yǎng)基每L含有：10g酵母提取物，10g蛋白胨，13.4gYNB，4×10^-4g生物素，100mM pH 6.0磷酸鹽緩沖液。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法還包括每20～24h補(bǔ)充終濃度為10mL/L的甲醇。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是以活化后的菌體進(jìn)行接種；所述活化是在BMGY培養(yǎng)基中進(jìn)行。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述活化是將菌體接種于BMGY培養(yǎng)基中，于250-300rpm，30℃培養(yǎng)16-18h，至OD₆₀₀達(dá)到2.0-6.0，離心菌體并用BMMY培養(yǎng)基將菌體沉淀重懸，使菌體的OD₆₀₀為1.0，進(jìn)行接種。

本發(fā)明還提供所述阿魏酸酯酶在食品、保健品、醫(yī)藥、化工領(lǐng)域的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用包括制備具有藥用價(jià)值和保健功能的游離阿魏酸，制備功能性的食品，制備抗氧化劑、香精、香料。

有益效果：本發(fā)明提供了一種阿魏酸酯酶基因及高效表達(dá)阿魏酸酯酶的工程菌，利用本發(fā)明的優(yōu)化方法構(gòu)建的工程菌，均具有高效的表達(dá)能力，分泌表達(dá)的阿魏酸酯酶的酶活最高可達(dá)39.9U/mL，為今后工業(yè)化生產(chǎn)高活性的阿魏酸酯酶提供了思路和方法。

附圖說明

圖1為AnfaeA基因的瓊脂糖電泳檢測(cè)圖；M，marker；1,基因opAnfaeAI；2，基因opAnfaeA II；

圖2為pMD19-AnfaeA雙酶切的瓊脂糖電泳檢測(cè)圖；M,marker；1，pMD19-AnfaeA雙酶切產(chǎn)物；

圖3為SDS-PAGE電泳圖譜；M，marker；1，F(xiàn)aeA-opt I；2，F(xiàn)aeA-opt II；

圖4為FaeA-ori、FaeA-opt I和FaeA-opt II三株重組菌誘導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)reAnfaeA的效果。

具體實(shí)施方式

PDA平板培養(yǎng)基：去皮土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂15～20g，水1000mL，pH自然

改良馬丁培養(yǎng)基(每L含有)：蛋白胨5g，酵母浸出粉2g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀1.0g，硫酸鎂0.5g，pH6.4±0.2。

LB培養(yǎng)基(每L含有)：蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl 10g。

YPD培養(yǎng)基(每L含有)：蛋白胨20g，酵母浸出粉10g，葡萄糖20g。

BMGY培養(yǎng)基(每L含有)：10g酵母提取物，10g蛋白胨，13.4g YNB，4×10^-4g生物素，100mM pH 6.0磷酸鹽緩沖液，10mL甘油。

BMMY培養(yǎng)基(每L含有)：10g酵母提取物，10g蛋白胨，13.4gYNB，4×10^-4g生物素，100mM pH 6.0磷酸鹽緩沖液，10mL甲醇。

阿魏酸酯酶的酶活測(cè)定方法：以阿魏酸甲酯為底物，配置標(biāo)準(zhǔn)酶活反應(yīng)體系：移取900μL阿魏酸甲酯(1mmol/L，pH6.0的磷酸鹽緩沖液配制)于1.5mL EP管中，50℃保溫5min，加入100μL適當(dāng)稀釋的酶液，準(zhǔn)確反應(yīng)10min后加入400μL冰乙酸終止反應(yīng)，過膜(水系，0.22μ.)，用高效液相色譜法測(cè)定經(jīng)reAnfaeA水解所產(chǎn)生的阿魏酸的含量。以預(yù)先在酶溶液中加入400μL冰乙酸，再加底物溶液的反應(yīng)物為對(duì)照。

酶活定義：每分鐘降解阿魏酸甲酯生成1μmol阿魏酸所需的阿魏酸酯酶的酶量定義為一個(gè)酶活力單位U。

表1.引物、序列及酶切位點(diǎn)

實(shí)施例1

將黑曲霉(Aspergillus niger)CBS 513.88在PDA平板培養(yǎng)基上劃線活化，28℃培養(yǎng)7～14d收集上層孢子至生理鹽水中，振蕩，制成孢子懸液，取菌懸液接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，搖床上150rpm，28℃培養(yǎng)3d后紗布過濾培養(yǎng)液搜集白色菌絲體；采用無菌生理鹽水沖洗2-3次，12000rpm離心10min，吸取上清液，底部菌絲體收集備用。

將菌絲體用5mL研磨器液氮研磨過后，放入滅菌的2mL微量離心管中。使用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒提取黑曲霉基因組，方法見試劑盒說明書。

設(shè)計(jì)引物(表1)，以提取的A.niger染色體基因組為模板，用表1中的引物組合(F1+R1，F(xiàn)2+R2)分別擴(kuò)增外顯子1和外顯子2，PCR反應(yīng)條件如下：95℃4min預(yù)變性后95℃15s，52℃15s，72℃30s共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。膠回收PCR產(chǎn)物外顯子1和外顯子2。以外顯子1和2的膠回收產(chǎn)物的混合物(1∶1)為模板，以F1和R2為上、下游引物，進(jìn)行重疊延伸PCR，反應(yīng)條件除了延伸時(shí)間改成60s外，其余條件均和外顯子1擴(kuò)增的條件相同。膠回收重疊延伸PCR產(chǎn)物。并連接pMD19-T載體，保存到E.coli JM109中，在含有50μg/mL氨芐的LB平板上37℃培養(yǎng)1-2d，挑選陽性轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證后獲得重組質(zhì)粒pMD19-AnfaeA，由上海生工進(jìn)行測(cè)序，基因序列如SEQ ID NO.1所示。

實(shí)施例2

對(duì)SEQ ID NO.1所示基因進(jìn)行隨機(jī)突變，獲得序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示基因opAnfaeAI和opAnfaeAII。將SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示基因與載體pMD19-T連接，獲得質(zhì)粒pMD19-opAnfaeAI和pMD19--opAnfaeA II。

分別將重組質(zhì)粒pMD19-AnfaeA、pMD19-opAnfaeA I和pMD19-opAnfaeA II用EcoR I和Not I雙酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的pPICZαA質(zhì)粒連接。酶切體系如表2：

表2酶切體系

37℃酶切5h或37℃過夜。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果后，膠回收酶切目的片段及載體片段。

將目的基因與pPICZaA質(zhì)粒雙酶切后回收片段按如表3的連接體系進(jìn)行連接：

表3連接體系

16℃保溫過夜，轉(zhuǎn)化至E.coli JM109中，挑選陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR驗(yàn)證，獲得重組表達(dá)載體pPICZαA-AnfaeA(圖3)、重組表達(dá)載體pPICZαA-opAnfaeA I和pPICZαA-opAnfaeA II。

將3種重組質(zhì)粒經(jīng)Sac I酶切線性化，電轉(zhuǎn)入P.pastoris X-33，涂布于，含150μg/mLZeocin的YPD平板上30℃培養(yǎng)3-5d，挑取單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證(引物為Opt I-F，Opt I-R，Opt II-F，Opt II-R，PCR擴(kuò)增條件與實(shí)施例1中PCR反應(yīng)條件相同)，陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)發(fā)酵及甲醇誘導(dǎo)，將發(fā)酵液離心后加到阿魏酸乙酯篩選平板上30℃孵育1h，根據(jù)透明圈大小初步篩選高酶活轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步用高效液相色譜法測(cè)定高酶活轉(zhuǎn)化子所對(duì)應(yīng)的發(fā)酵液上清中重組阿魏酸酯酶酶活，篩選酶活最高的陽性轉(zhuǎn)化子。

實(shí)施例3

上述篩選和鑒定表達(dá)阿魏酸酯酶量的菌株的方法為：

將3種基因工程菌分別按下述方式培養(yǎng)：將基因工程菌單菌落接種于BMGY培養(yǎng)基中，于250-300rpm，30℃培養(yǎng)16-18h，至OD₆₀₀達(dá)到2.0-6.0；3000rpm離心5min，用5mL BMMY培養(yǎng)基將菌體沉淀重懸，使菌體的OD₆₀₀為1.0，再轉(zhuǎn)移至等體積的BMMY培養(yǎng)基中，30℃、250rpm培養(yǎng)5d，每24h補(bǔ)充甲醇使其終濃度為1％(按體積比)。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后取樣測(cè)定酶活，對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳分析，得到分子量約33kDa的單一條帶，表明重組工程菌表達(dá)了阿魏酸酯酶。

對(duì)發(fā)酵液中的酶活進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，用濃度為1％的甲醇分別誘導(dǎo)重組畢赤酵母菌株FaeA-ori，F(xiàn)aeA-opt I，F(xiàn)aeA-opt II每隔12h取樣，離心并測(cè)定發(fā)酵液上清的酶活。如圖4所示，在發(fā)酵4.5d時(shí)比酶活最高，F(xiàn)aeA-ori為6.8U/ml，菌株FaeA-opt II酶活為5.2U/ml，僅為對(duì)照菌株酶活的76.5％，菌株FaeA-opt I酶活達(dá)到39.9U/ml，與對(duì)照菌株相比酶活提高了近6倍。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種提高阿魏酸酯酶酶活的方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 780

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcctccacgc aaggcatctc cgaagacctc tacaatcgct tggtagagat ggccactatc 60

tcccaagccg cctacgccga cctatgcaat attccatcga ctattatcaa aggagagaaa 120

atttacaacg ctcaaactga tatcaacgga tggatcctcc gcgacgacac cagcaaagaa 180

attatcaccg tcttccgtgg cactggcagt gacacaaacc tacagctcga tactaactac 240

acgctcacgc cattcgacac tctacctcaa tgcaacgatt gcgaggtaca cggtggatac 300

tatattggat ggatctcagt ccaagaccaa gtcgagtcgc ttgtcaaaca acaggctagc 360

cagtatccgg actatgcgct taccgtgaca ggccatagtc tgggagcgtc gatggcagca 420

ctcactgccg cccagctgtc cgcgacatac gacaacgtcc gtctgtacac attcggcgaa 480

ccgcgcagcg gcaaccaggc cttcgcgtcg tacatgaacg atgcgttcca ggtctcgagc 540

ccggagacga cccagtactt ccgggtcact cattccaacg acggcatccc aaacttgccc 600

ccggcggagc agggttacgc ccatggtggt gtagagtact ggagcgttga tccttacagc 660

gcccagaaca cgtttgtctg tactggggat gaagtacagt gctgtgaggc acagggcgga 720

cagggggtga atgatgcgca tactacttat tttgggatga cgagcggagc ttgtacttgg 780

<210> 2

<211> 780

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<211> 780

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcttctactc aaggtatttc tgaagatctg tacaaccgtc tggttgaaat ggccactatt 60

tctcaagctg cttacgctga tttgtgtaac attccatcta ctattattaa gggtgaaaag 120

atttacaacg ctcaaactga tattaacggt tggattttga gagatgatac tagtaaggaa 180

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