本發(fā)明屬于基因工程和微生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，尤其是涉及一種高有機(jī)溶劑耐受性的簡(jiǎn)單節(jié)桿菌工程菌株的構(gòu)建及該菌株在甾體化合物轉(zhuǎn)化，如A環(huán)C_1,2脫氫反應(yīng)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

甾體類藥物具有重要的生理活性，是僅次于抗生素的第二大類藥物。C_1,2位脫氫反應(yīng)是工業(yè)化生產(chǎn)氫化潑尼松及其同系物最有價(jià)值的一個(gè)反應(yīng)，也是甾體藥物工業(yè)上采用轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)的典型代表。甾體藥物母核發(fā)生C_1,2位引入雙鍵后可成倍地增加其抗炎活性，醋酸可的松的C_1,2位導(dǎo)入雙鍵后生成醋酸潑尼松，抗炎能力能夠提高3-4倍，并且減少由鈉滯留帶來的副作用。簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(Arthrobacter simplex)催化的C_1,2脫氫反應(yīng)是工業(yè)生產(chǎn)醋酸潑尼松及其同系物最有價(jià)值的一種反應(yīng)，也是采用發(fā)酵法工業(yè)生產(chǎn)甾體類藥物的典型代謝。然而，甾體類化合物較差的水溶性(溶解度一般為10^-5-10^-6mol/L)限制了底物與胞內(nèi)生物酶的有效接觸，這一問題已成為限制催化反應(yīng)效率的關(guān)鍵瓶頸。

研究者采用了很多方法提高底物的溶解度，如底物微粒化、環(huán)糊精包合、濁點(diǎn)系統(tǒng)和離子液體等，這些方法有的操作繁瑣，有的成本較高。目前為止，添加有機(jī)溶劑是工業(yè)上甾體生物合成工藝中普遍用來改善底物溶解性的方法。但有機(jī)溶劑的添加，尤其是高劑量的有機(jī)溶劑會(huì)對(duì)微生物細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，進(jìn)而影響全細(xì)胞的生物催化效率，有機(jī)溶劑的用量受到嚴(yán)格控制，這大大限制了轉(zhuǎn)化體系中底物的投料量，最終影響產(chǎn)率。為了突破這一瓶頸，迫切的需要構(gòu)建高有機(jī)溶劑耐性的微生物菌株。

IrrE是來源于耐輻射異常球菌(Deinococcus radiodurans)R1的一個(gè)調(diào)節(jié)蛋白，對(duì)細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)具有重要的調(diào)控作用。研究者發(fā)現(xiàn)將該基因?qū)氪竽c桿菌中能夠顯著提高其輻射抗性、氧化抗性和耐鹽能力。

相容性溶質(zhì)是微生物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫而產(chǎn)生的重要保護(hù)物質(zhì)，它能夠使植物和微生物耐受多種環(huán)境脅迫(如高鹽、低溫、干旱和有毒物質(zhì)等)，其中海藻糖是生物界分布最廣的相容性溶質(zhì)之一。海藻糖是一種非常重要的天然代謝產(chǎn)物，非還原性糖，由兩分子葡萄糖基(α-D-吡喃葡糖-1-1α-D-葡萄糖苷)組成。研究發(fā)現(xiàn)海藻糖不僅可以作為能源物質(zhì)，還可作為細(xì)胞在壓力環(huán)境下的保護(hù)劑。海藻糖通過維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)大分子蛋白和核酸的結(jié)構(gòu)等途徑使細(xì)胞免受外界環(huán)境壓力(如熱激，乙醇，高滲，干旱等)的破壞。

目前尚未發(fā)現(xiàn)利用irrE基因、海藻糖合成基因otsA和otsB表達(dá)構(gòu)建高有機(jī)溶劑耐受性的簡(jiǎn)單節(jié)桿菌工程菌株，以及利用該工程菌株進(jìn)行C_1,2脫氫反應(yīng)的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種高有機(jī)溶劑耐受性的簡(jiǎn)單節(jié)桿菌工程菌株構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種高有機(jī)溶劑耐受性的簡(jiǎn)單節(jié)桿菌工程菌株的構(gòu)建方法，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將基因片段轉(zhuǎn)入到宿主菌中，獲得高有機(jī)溶劑耐受性的工程菌株，所述宿主菌為簡(jiǎn)單節(jié)桿菌。

優(yōu)選的，基因片段為全局轉(zhuǎn)錄因子或功能基因中的一種。

優(yōu)選的，全局轉(zhuǎn)錄因子為irrE基因，核苷酸序列如SEQ ID：3所示。

優(yōu)選的，功能基因?yàn)橄嗳菪匀苜|(zhì)的合成基因，所述相容性溶質(zhì)的合成基因?yàn)楹Ｔ逄呛铣苫颍龊Ｔ逄呛铣苫驗(yàn)閛tsA基因或otsB基因中的一種，otsA基因核苷酸序列如SEQ ID：6所示，otsB基因核苷酸序列如SEQ ID：9所示。

一種高有機(jī)溶劑耐受性的簡(jiǎn)單節(jié)桿菌工程菌株的構(gòu)建方法，構(gòu)建方法步驟如下：

步驟一：根據(jù)基因序列信息設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，利用所述上游引物與所述下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得基因序列。

步驟二：通過雙酶切法獲得所用的基因片段和質(zhì)粒pART2進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH 5α感受態(tài)中，獲得重組質(zhì)粒。

步驟三：制備宿主菌感受態(tài)細(xì)胞，通過電轉(zhuǎn)化的方法將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到宿主菌感受態(tài)細(xì)胞中，篩選后獲得高有機(jī)溶劑耐受性的簡(jiǎn)單節(jié)桿菌工程菌株。

其中，步驟三中所述宿主菌感受態(tài)細(xì)胞制備過程如下：

挑取簡(jiǎn)單節(jié)桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)菌體形成菌液，加入細(xì)胞壁處理劑處理，震蕩后，將裝有菌液的容器置于冰浴上冷卻，離心后棄上清；加預(yù)冷的電擊緩沖液洗滌菌體，離心后棄上清；洗滌后加入電擊緩液重懸菌體，搖勻，形成簡(jiǎn)單節(jié)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，保存待用；

優(yōu)選的，挑取簡(jiǎn)單節(jié)桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，30-36℃、150-250r/min震蕩培養(yǎng)20-36h，至菌體OD₆₀₀為1.5-3.0形成種子液，取1mL種子液接入裝有50mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30-36℃、150-250r/min培養(yǎng)6-12h，至OD₆₀₀為0.8-1.5，加入細(xì)胞壁處理劑振蕩處理0.5-4h后，將裝有菌液的三角瓶置于冰浴上冷卻10-20min，4℃下5000-7000r/min離心5-15min，棄上清；加25-50mL預(yù)冷至0℃的電擊緩沖液洗滌菌體后，4℃下5000r/min離心10min，棄上清；重復(fù)洗滌兩次后，加入0.5-1.5mL電擊緩液重懸菌體，搖勻，獲得簡(jiǎn)單節(jié)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，于-80℃保存待用。

其中，電擊緩沖液由10-15％甘油和0.5-1.0mol/L山梨醇組成。

所述電轉(zhuǎn)化方法步驟如下：

取簡(jiǎn)單節(jié)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入構(gòu)建好的所述重組質(zhì)粒，混合均勻后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電脈沖杯內(nèi)冰??；打開電脈沖儀電擊轉(zhuǎn)化；電激后立即向電脈沖杯內(nèi)加入無菌復(fù)蘇培養(yǎng)基，混勻后緩慢振蕩培養(yǎng)，涂布到選擇平板上，倒置培養(yǎng)，篩選獲得含有重組質(zhì)粒的基因工程菌株；

優(yōu)選的，取70-150μL簡(jiǎn)單節(jié)桿菌感受態(tài)細(xì)胞于1.5mL離心管中，加入10-50μL構(gòu)建好的重組質(zhì)粒，混合均勻后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電脈沖杯內(nèi)冰浴1-5min；打開電脈沖儀，0.8-1.5kV電擊轉(zhuǎn)化；電激后立即向電脈沖杯內(nèi)加入0.8-1.5mL無菌復(fù)蘇培養(yǎng)基，混勻后，30-36℃緩慢振蕩培養(yǎng)8-12h后，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的選擇平板上，30-36℃倒置培養(yǎng)48-96h，獲得含有重組質(zhì)粒的工程菌株。

其中，復(fù)蘇培養(yǎng)基是含有0.5-1.0moL/L山梨醇的LB液體培養(yǎng)基。

優(yōu)選的，所述細(xì)胞壁處理劑為青霉素G、溶菌酶、蘇氨酸和甘氨酸中的一種。

其中，青霉素G濃度為10-200μg/mL。

其中，溶菌酶濃度為10-40ug/mL。

其中，蘇氨酸濃度為0.5-4.0％。

其中，甘氨酸濃度為0.5-4.0％。

利用一種高有機(jī)溶劑耐受性的簡(jiǎn)單節(jié)桿菌工程菌株的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的高有機(jī)溶劑耐受性的簡(jiǎn)單節(jié)桿菌工程菌株。

優(yōu)選的，高有機(jī)溶劑耐受性的簡(jiǎn)單節(jié)桿菌工程菌株為irrE工程菌株、otsA工程菌株和otsB工程菌株中的一種。

高有機(jī)溶劑耐受性的簡(jiǎn)單節(jié)桿菌工程菌株在甾體類化合物生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，高有機(jī)溶劑耐受性的簡(jiǎn)單節(jié)桿菌工程菌株在甾體類化合物生物轉(zhuǎn)化中的反應(yīng)為甾體A環(huán)的C_1,2脫氫反應(yīng)，反應(yīng)環(huán)境中的有機(jī)溶劑為甲醇或乙醇中的一種，優(yōu)選乙醇，所述甾體類化合物為醋酸可的松。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所構(gòu)建載體pART2-irrE驗(yàn)證結(jié)果，其中a：質(zhì)粒PCR；b：酶切產(chǎn)物；M：DNA Marker；0：質(zhì)粒pART2；1：重組質(zhì)粒pART2-irrE；2：重組質(zhì)粒pART2-irrE的BamH I/Xba I雙酶切產(chǎn)物

圖2為本發(fā)明構(gòu)建的irrE工程菌株與對(duì)照菌株的蛋白SDS-PAGE電泳圖，其中M：蛋白Marker；1：對(duì)照菌株的全蛋白；2；對(duì)照菌株經(jīng)his純化后的蛋白；3；irrE工程菌株的全蛋白；4；irrE工程菌株經(jīng)his純化后的蛋白

圖3為本發(fā)明構(gòu)建的irrE工程菌株與對(duì)照菌株的蛋白Western blot圖；其中1：對(duì)照菌株；2：irrE工程菌株。

圖4為本發(fā)明所構(gòu)建的irrE工程菌株與對(duì)照菌株在不同濃度乙醇和甲醇?jí)毫ο屡囵B(yǎng)46h的相對(duì)OD₆₀₀值；其中1：對(duì)照菌株；2：irrE工程菌株。

圖5為本發(fā)明所構(gòu)建的irrE工程菌株與對(duì)照菌株16％乙醇沖擊1h后的存活率；其中，1：對(duì)照菌株；2：irrE工程菌株。

圖6為本發(fā)明所構(gòu)建載體pART2-otsA和pART2-otsB驗(yàn)證結(jié)果，其中a：pART2-otsA質(zhì)粒PCR；b：pART2-otsA雙酶切；c：pART2-otsB質(zhì)粒PCR；d：pART2-otsB雙酶切。M：DNA Marker；1：重組質(zhì)粒pART2-otsA的PCR產(chǎn)物；2：重組質(zhì)粒pART2-otsA的BamH I/Xba I雙酶切產(chǎn)物；3：重組質(zhì)粒pART2-otsB的PCR產(chǎn)物；4：重組質(zhì)粒pART2-otsB的BamH I/Xba I雙酶切產(chǎn)物。

圖7為本發(fā)明構(gòu)建的otsA工程菌株、otsB工程菌株與對(duì)照菌株在細(xì)胞生長(zhǎng)不同時(shí)期的胞內(nèi)海藻糖含量；其中1：對(duì)照菌株；2：otsA工程菌株；3：otsB工程菌株。

圖8為本發(fā)明所構(gòu)建的otsA工程菌株和otsB工程菌株與對(duì)照菌株在4％乙醇和6％甲醇?jí)毫ο屡囵B(yǎng)不同時(shí)間的相對(duì)OD₆₀₀值；其中a：4％乙醇?jí)毫ο碌木w相對(duì)OD₆₀₀值；b：6％甲醇?jí)毫ο碌木w相對(duì)OD₆₀₀值；1：對(duì)照菌株；2：otsA工程菌株；3：otsB工程菌株。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

以下實(shí)驗(yàn)所用主要材料來源：大腸桿菌DH5α菌株、核酸操作工具酶來自寶生物工程(大連)有限公司，引物合成、核苷酸序列人工合成以及基因測(cè)序委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成；PVDF膜用His探針抗體為His-probe Antibody(H-15)，Santa公司)，H-15；羊抗兔二抗(Goat anti-Rabbit IgG(H+L)Secondary Antibody)來自Invitrogen公司，

本發(fā)明涉及一種高有機(jī)溶劑耐受性工程菌株的構(gòu)建方法，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將基因片段轉(zhuǎn)入到宿主菌中，獲得高有機(jī)溶劑耐受性工程菌株，本發(fā)明涉及的外源基因?yàn)槿洲D(zhuǎn)錄因子irrE，海藻糖合成基因，otsA基因或otsB基因，宿主菌為簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(Arthrobacter simplex)，菌種編號(hào)為(ACCC 12070)。

實(shí)施例1 irrE工程菌株的構(gòu)建及應(yīng)用

1制備含有重組質(zhì)粒pART2-irrE的基因工程菌

(1)重組質(zhì)粒pART2-irrE的構(gòu)建

以耐輻射異常球菌(Deinococcus radiodurans)(購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。菌種編號(hào):1.633)基因組為模板，利用引物irrE3-F(如SEQ ID：1所示)和irrE3-R(如SEQ ID：2所示)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增獲得耐輻射異常球菌全局轉(zhuǎn)錄因子irrE(如SEQ ID：3所示)基因序列，

SEQ ID：1 cgggatccca gtgccaacgt cagccc

SEQ ID：2 tgctctagac tgtgcagcgt cctgcg

PCR反應(yīng)體系如下：

PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃30s，63℃30s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)后72℃10min。

全局轉(zhuǎn)錄因子irrE序列和質(zhì)粒pART2分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XbaⅠ處理(37℃，4h)，利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)分別回收目的片段，將酶切后的質(zhì)粒和全局轉(zhuǎn)錄因子irrE序列按1:3(物質(zhì)的量之比)的比例進(jìn)行連接反應(yīng)(16℃，12h)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿DH5α，經(jīng)篩選獲得重組質(zhì)粒pART2-irrE。

獲得的重組質(zhì)粒pART2-irrE用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示。

(2)irrE工程菌株的獲得

①感受態(tài)細(xì)胞的制備：

挑取簡(jiǎn)單節(jié)桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，34℃、220r/min震蕩培養(yǎng)30h，至菌體OD₆₀₀為2.5形成種子液，取1mL種子液接入裝有50mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，34℃、220r/min培養(yǎng)10h，至OD₆₀₀為1.2，加入細(xì)胞壁處理劑青霉素G(濃度為10-200μg/mL)振蕩處理0.5-2h后，將裝有菌液的三角瓶置于冰浴上冷卻15min，4℃下6500r/min離心12min，棄上清；加40mL預(yù)冷至0℃的電擊緩沖液洗滌菌體后，4℃下5000r/min離心10min，棄上清；重復(fù)洗滌兩次后，加入1.2mL電擊緩液重懸菌體，搖勻，獲得簡(jiǎn)單節(jié)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，于-80℃保存待用。

其中，電擊緩沖液由14％甘油和0.9mol/L山梨醇組成。

其中，細(xì)胞壁處理劑青霉素G添加量與震蕩處理時(shí)長(zhǎng)安排如下表所示：

②重組質(zhì)粒pART2-irrE的電激轉(zhuǎn)化

取120μL簡(jiǎn)單節(jié)桿菌感受態(tài)細(xì)胞于1.5mL離心管中，加入40μL構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pART2-irrE，混合均勻后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電脈沖杯內(nèi)冰浴3min；打開電脈沖儀，1.2kV電擊轉(zhuǎn)化；電激后立即向電脈沖杯內(nèi)加入1.2mL無菌復(fù)蘇培養(yǎng)基，混勻后，34℃緩慢振蕩培養(yǎng)11h后，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的選擇平板上，34℃倒置培養(yǎng)80h，獲得含有重組質(zhì)粒pART2-irrE的工程菌株，即irrE工程菌株。

其中，復(fù)蘇培養(yǎng)基是含有0.8moL/L山梨醇的LB液體培養(yǎng)基。

2 全局轉(zhuǎn)錄因子IrrE的表達(dá)

(1)菌體培養(yǎng)

分別從斜面挑取irrE工程菌株(含有重組質(zhì)粒pART2-irrE)和對(duì)照菌株(含有空質(zhì)粒)接種于LB液體培養(yǎng)基中，32℃，160r/min振蕩培養(yǎng)40h。以4％(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接入新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，32℃，160r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀約為4.0。實(shí)驗(yàn)中含質(zhì)粒菌株培養(yǎng)基中還需添加終濃度為50μg/ml的卡那霉素。

其中，LB液體培養(yǎng)基組成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。

(2)蛋白純化

將上述培養(yǎng)液置于冰上至少10min，然后7000g，4℃離心15min，收集菌體。用冷卻的PBS緩沖溶液洗滌兩次，加入10mL菌體破碎液渦旋振蕩重懸菌體。將重懸后的菌體在冰浴條件下超聲破碎，破碎程序?yàn)椋浩扑楣β?50W，時(shí)間3:3(s/s)超聲約60min，直至菌液透亮，7000r/min，4℃離心10min，收集上清中的可溶性蛋白，將菌體裂解液稀釋后負(fù)載到His純化柱上，流速為1.0mL/min收集流穿液。用Binding Buffer沖洗柱子，洗去雜蛋白。使用Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰即為蛋白峰。將收集到的蛋白峰，按比例加入5倍蛋白上樣緩沖液，混勻后沸水浴5min，以蛋白凝膠每孔30uL蛋白樣品的量上樣；在濃縮膠和分離膠中分別用8V/cm和12V/cm進(jìn)行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶接近分離膠末端時(shí)停止；將蛋白膠轉(zhuǎn)入染色槽中，加入考馬斯亮藍(lán)染色液，緩慢震蕩染色2h以上，以達(dá)到充分染色。染色結(jié)束后，沖洗掉多余的染色液，加入脫色液，緩慢震蕩脫色約2h，直至條帶清晰。irrE工程菌株與對(duì)照菌株全蛋白經(jīng)過HIS純化后蛋白的SDS-PAGE電泳圖見圖2。

其中，菌體破碎液組成：5mL PBS緩沖液，100μL的PMSF，500μL甘油，2mL 0.5mol/L的NaCl，50μL 20mg/mL溶菌酶。

(3)Western Blot實(shí)驗(yàn)

蛋白凝膠電泳后，將蛋白凝膠從電泳槽上取下，去除濃縮膠和多余部分，用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(PVDF)上，將轉(zhuǎn)印的PVDF膜放置到ddH₂O中漂洗1-2min，洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液，用5％脫脂奶粉(用TBST配制)封閉，置于水平搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉2h。棄除封閉液，PVDF膜用His探針抗體4℃過夜孵育。再根據(jù)一抗選擇相應(yīng)的羊抗兔二抗，在室溫下二抗孵育2h，孵育完成后用TBST清洗干凈。用掃膜儀將洗干凈的PVDF膜置于暗室中用掃膜以進(jìn)行掃描。Western Blot結(jié)果如圖3所示。

由圖2和圖3可知，與對(duì)照菌株相比，irrE工程菌株在35KDa處出現(xiàn)了一條明顯的差異條帶，其大小與irrE的理論大小相符，這說明全局轉(zhuǎn)錄因子irrE已在簡(jiǎn)單節(jié)桿菌中成功表達(dá)。

3 irrE工程菌株有機(jī)溶劑耐受性的分析

(1)irrE工程菌株在不同濃度甲醇及乙醇?jí)毫ο碌纳L(zhǎng)情況

分別從斜面挑取irrE工程菌株和對(duì)照菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，32℃，160r/min下振蕩培養(yǎng)40h，以一定的接種量轉(zhuǎn)接入含有不同濃度甲醇(4％、6％、8％)和乙醇(2％、4％、6％)的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，并將初始OD₆₀₀值調(diào)為相同(均為0.2)，32℃，160r/min震蕩培養(yǎng)46h后取樣測(cè)定OD₆₀₀值，并計(jì)算相對(duì)OD ₆₀₀值(相對(duì)OD₆₀₀＝有機(jī)溶劑壓力下的菌液OD₆₀₀/無壓力下的菌液OD₆₀₀)。實(shí)驗(yàn)中含質(zhì)粒菌株培養(yǎng)基中還需添加終濃度為50μg/ml的卡那霉素。由圖4可知，與對(duì)照菌株相比，irrE工程菌株在2％、4％和6％乙醇?jí)毫ο屡囵B(yǎng)46h后的相對(duì)OD₆₀₀值分別提高14.9％、73.9％和90.0％；4％和6％甲醇?jí)毫ο屡囵B(yǎng)46h后的相對(duì)OD₆₀₀值分別提高21.1％和13.9％，這說明重組表達(dá)的irrE工程菌株對(duì)甲醇和乙醇的耐受性均明顯提高。

(2)irrE工程菌株在高濃度乙醇沖擊下的存活情況

分別從斜面挑取irrE工程菌株和對(duì)照菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，32℃，160r/min下振蕩培養(yǎng)40h，以一定的接種量轉(zhuǎn)接入新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，并將初始OD₆₀₀值調(diào)為相同(均為0.2)，32℃，160r/min振蕩培養(yǎng)到各自的對(duì)數(shù)中后期。6000r/min離心10min收集菌體，將收集得到的菌體用新鮮的LB液體培養(yǎng)基懸浮并將菌液的OD₆₀₀值均調(diào)節(jié)至1.0，然后加入16％乙醇沖擊1h。將沖擊后的培養(yǎng)液采用10倍逐級(jí)稀釋法在LB平板上涂布，32℃培養(yǎng)一定時(shí)間后觀察平板上的菌落數(shù)并計(jì)算存活率。實(shí)驗(yàn)中含質(zhì)粒菌株培養(yǎng)基中還需添加終濃度為50μg/ml的卡那霉素。

存活率計(jì)算方法如下：

存活率(％)＝菌株壓力條件下的菌落數(shù)/菌株無壓力條件下的菌落數(shù)×100％

由圖5可知，經(jīng)過16％乙醇沖擊1h后，irrE工程菌株的存活率為69％，比對(duì)照菌株提高了2倍。

4 irrE工程菌株轉(zhuǎn)化醋酸可的松能力的測(cè)定

(1)靜息細(xì)胞的制備

分別從斜面挑取irrE工程菌株和對(duì)照菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，32℃，160r/min振蕩培養(yǎng)40h，以一定的接種量轉(zhuǎn)接到裝有50mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，初始OD₆₀₀值調(diào)整為0.2，32℃，160r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別加入終濃度為0.5g/L的底物醋酸可的松(CA)誘導(dǎo)C1,2位脫氫酶產(chǎn)生，32℃，160r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)18h至各個(gè)菌株的對(duì)數(shù)中后期。培養(yǎng)液經(jīng)4℃，7000r/min離心10min，收集的菌體用預(yù)冷的pH 7.2的0.1M的KH₂PO₄-NaOH溶液(PBS緩沖溶)洗滌2次，將菌體懸浮于適量的PBS緩沖液中制備得到靜息細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中含質(zhì)粒菌株培養(yǎng)基中還需添加終濃度為50μg/ml的卡那霉素。

(2)不同轉(zhuǎn)化體系下全細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率

利用上述靜息細(xì)胞制備30mL的轉(zhuǎn)化體系。

轉(zhuǎn)化體系I-低底物濃度和助溶劑轉(zhuǎn)化體系：菌體OD₆₀₀為2.0，底物CA濃度為2g/L，4％乙醇助溶；

轉(zhuǎn)化體系II-高底物濃度和助溶劑體系：菌體OD₆₀₀為2.0，底物CA濃度為8g/L，8％乙醇助溶。

上述兩個(gè)體系在34℃，180r/min振蕩轉(zhuǎn)化10h后，取樣測(cè)定產(chǎn)物醋酸潑尼松(PA)的濃度。每次取樣0.4mL加入0.8mL乙酸乙酯終止反應(yīng)，超聲萃取10min以上，12000r/min離心10min，吸取100μL上清液于新的1.5ml離心管中，在通風(fēng)櫥中過夜揮發(fā)，再用1ml流動(dòng)相復(fù)溶，通過HPLC法測(cè)定產(chǎn)物的生成量。

HPLC檢測(cè)條件為：

高效液相色譜儀：Agilent 1100Series LC(G1314Pump,G1322ADEGASSER G1314VWD檢測(cè)器，20μL AN進(jìn)樣器，HP ChemStation)；

色譜柱：Kromasil 100-5SIL 250mm×4.6mm×5μm；

流動(dòng)相：二氯甲烷:乙醚:甲醇(體積比86:12:2)，0.45μm微孔濾膜過濾；

流速：1mL/min；

柱溫：30℃；

檢測(cè)器：UV Detector，波長(zhǎng)：240nm。

進(jìn)樣量：20μL

表1 irrE工程菌株與對(duì)照菌株轉(zhuǎn)化醋酸可的松生成醋酸潑尼松的轉(zhuǎn)化結(jié)果比較

由表1可知，利用本發(fā)明獲得的高有機(jī)溶劑耐受性的irrE工程菌株進(jìn)行甾體C_1,2脫氫反應(yīng)，體系中乙醇濃度由4％增加到8％時(shí)，底物CA的投加量提高了3倍，轉(zhuǎn)化10h后產(chǎn)物PA的生成量由原來的1.61g/L增加到6.39g/L，提高了約3倍，而對(duì)照菌株此時(shí)的PA生成量為工程菌株的53.3％，僅為3.41g/L。

實(shí)施例2：otsA工程菌株的構(gòu)建及應(yīng)用

1制備含有重組質(zhì)粒pART2-otsA的基因工程菌

(1)重組質(zhì)粒pART2-otsA的構(gòu)建

以簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(Arthrobacter simplex)ACCC 12070基因組為模板，利用引物otsA-F(如SEQ ID：4所示)和otsA-R(如SEQ ID：5所示)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增獲得簡(jiǎn)單節(jié)桿菌海藻糖合成基因otsA基因序列(如SEQ ID：6所示)，

SEQ ID：4 cgggatccag tgggccatga cctcgtgatc

SEQ ID：5 tgctctagat caggagcgtg ttgctggtcg

PCR反應(yīng)體系如下：

PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃30s，63℃30s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)后72℃10min。

海藻糖合成基因otsA序列和質(zhì)粒pART2分別用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Xba Ⅰ處理(37℃，4h)，利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)分別回收目的片段，將酶切后的質(zhì)粒和海藻糖合成基因otsA序列按1:3(物質(zhì)的量之比)的比例進(jìn)行連接反應(yīng)(16℃，12h)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿DH5α，經(jīng)篩選獲得重組質(zhì)粒pART2-otsA。

獲得的重組質(zhì)粒pART2-otsA用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖6所示。

(2)otsA工程菌株的獲得

①感受態(tài)細(xì)胞的制備：

挑取簡(jiǎn)單節(jié)桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)20h，至菌液OD₆₀₀為1.5形成種子液，取1mL種子液接入裝有50mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃、150r/min培養(yǎng)6h，至OD₆₀₀為0.8，加入細(xì)胞壁處理劑溶菌酶(濃度為10-40ug/mL)震蕩處理0.5-1.5h后，將裝有菌液的三角瓶置于冰浴上冷卻10min，4℃下5000r/min離心5min，棄上清；加25mL預(yù)冷至0℃的電擊緩沖液洗滌菌體后，4℃下5000r/min離心10min，棄上清；重復(fù)洗滌兩次后，加入0.5mL電擊緩液重懸菌體，搖勻，獲得簡(jiǎn)單節(jié)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，于-80℃保存待用。

其中，電擊緩沖液由10％甘油和0.5mol/L山梨醇組成。

其中，細(xì)胞壁處理劑溶菌酶添加量與震蕩處理時(shí)長(zhǎng)安排如下表所示：

②質(zhì)粒pART2-otsA的電激轉(zhuǎn)化

取70μL簡(jiǎn)單節(jié)桿菌感受態(tài)細(xì)胞于1.5mL離心管中，加入10μL構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pART2-otsA，混合均勻后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電脈沖杯內(nèi)冰浴1min；打開電脈沖儀，0.8kV電擊轉(zhuǎn)化；電激后立即向電脈沖杯內(nèi)加入0.8mL無菌復(fù)蘇培養(yǎng)基，混勻后，30℃緩慢振蕩培養(yǎng)8h后，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的選擇平板上，30℃倒置培養(yǎng)48h，獲得含有重組質(zhì)粒pART2–otsA的基因工程菌株，即過表達(dá)otsA簡(jiǎn)單節(jié)桿菌工程菌株。

其中，復(fù)蘇培養(yǎng)基是含有0.5moL/L山梨醇的LB液體培養(yǎng)基。

2海藻糖合成基因otsA的表達(dá)

(1)菌體制備

分別從斜面挑取otsA工程菌株(含有重組質(zhì)粒pART2-otsA)和對(duì)照菌株(含有空質(zhì)粒)接種于LB液體培養(yǎng)基中，32℃，160r/min，震蕩培養(yǎng)至菌體的生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)前期(32h)、對(duì)數(shù)中期(38h)和對(duì)數(shù)末期(48h)，5000r/min，4℃離心10min收集菌體，并用PBS洗滌一遍，將菌體放置-80℃冷凍24h后，真空冷凍干燥24h。

其中，LB液體培養(yǎng)基組成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。

(2)海藻糖的提取

取0.05g凍干的菌體在室溫下用研缽研碎，，加入500μL 0.5M預(yù)冷的三氯乙酸，置于冰上提取30min，其間每隔5分鐘震蕩5次，5000r/min室溫離心10min，收集上清。

(3)海藻糖含量的測(cè)定

通過HPLC方法檢測(cè)菌體內(nèi)的海藻糖含量。HPLC檢測(cè)條件為：

高效液相色譜儀：Agilent 1200型高效液相色譜儀，示差檢測(cè)器；

色譜柱：Prevail Carbohydrate 250mm×4.6mm×5μm；

流動(dòng)相：乙腈:H₂O(體積比為85∶15)，0.45μm微孔濾膜過濾；

流速：1mL/min；

柱溫：30℃；

檢測(cè)器：RID Detector，檢測(cè)器溫度：35℃。

進(jìn)樣量：10μL

工程菌株和對(duì)照菌株在不同生長(zhǎng)階段時(shí)胞內(nèi)海藻糖含量如圖7所示，工程菌株otsA在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)不同時(shí)期胞內(nèi)海藻糖均明顯高于對(duì)照菌株，這說明海藻糖合成基因otsA已在簡(jiǎn)單節(jié)桿菌中成功過表達(dá)。

3 otsA工程菌株有機(jī)溶劑耐受性的分析

分別從斜面挑取otsA工程菌株和對(duì)照菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，32℃，160r/min振蕩培養(yǎng)36h，以一定的接種量分別轉(zhuǎn)接到含有4％乙醇和6％甲醇的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，并將初始OD₆₀₀值調(diào)為相同(均為0.13)，32℃，160r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)24h、48h和72h后分別取樣測(cè)定OD₆₀₀值，并計(jì)算相對(duì)OD ₆₀₀值(相對(duì)OD₆₀₀＝有機(jī)溶劑壓力下的菌液OD₆₀₀/無壓力下的菌液OD₆₀₀)。實(shí)驗(yàn)中含質(zhì)粒菌株培養(yǎng)基中還需添加終濃度為50μg/ml的卡那霉素。由圖8可知，工程菌株otsA在4％乙醇?jí)毫ο屡囵B(yǎng)72h后的相對(duì)OD₆₀₀值分別比對(duì)照菌株提高了16.7％；在6％甲醇?jí)毫ο屡囵B(yǎng)72h后的相對(duì)OD₆₀₀值分別比對(duì)照菌株提高了82.9％。這說明otsA工程菌株對(duì)甲醇和乙醇的耐受性明顯提高。

4 otsA工程菌株轉(zhuǎn)化醋酸可的松能力的測(cè)定

分別從斜面挑取otsA工程菌株和對(duì)照菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，32℃，160r/min振蕩培養(yǎng)36h，以一定的接種量轉(zhuǎn)接到裝有50mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，初始OD₆₀₀值調(diào)整為0.13，32℃，160r/min震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別加入終濃度為0.5g/L的底物醋酸可的松(CA)誘導(dǎo)C_1,2位脫氫酶產(chǎn)生，32℃，160r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)18h至各個(gè)菌株的對(duì)數(shù)中后期。培養(yǎng)液經(jīng)4℃，7000r/min離心10min，收集的菌體用預(yù)冷的pH 7.2的0.1M的KH₂PO₄-NaOH溶液(PBS緩沖溶)洗滌2次，將菌體懸浮于適量的PBS緩沖液中制備得到靜息細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中含質(zhì)粒菌株培養(yǎng)基中還需添加終濃度為50μg/ml的卡那霉素。

利用上述靜息細(xì)胞制備30mL的轉(zhuǎn)化體系。

轉(zhuǎn)化體系I-低底物濃度和助溶劑轉(zhuǎn)化體系：菌體OD₆₀₀為2.0，底物CA濃度為2g/L，4％乙醇助溶；

轉(zhuǎn)化體系II-高底物濃度和助溶劑體系：菌體OD₆₀₀為2.0，底物CA濃度為8g/L，8％乙醇助溶。

上述兩個(gè)體系在34℃，180r/min振蕩轉(zhuǎn)化12h后，取樣測(cè)定產(chǎn)物醋酸潑尼松(PA)的濃度。每次取樣0.4mL加入0.8mL乙酸乙酯終止反應(yīng)，超聲萃取10min以上，12000r/min離心10min，吸取100μL上清液于新的1.5ml離心管中，在通風(fēng)櫥中過夜揮發(fā)，再用1ml流動(dòng)相復(fù)溶，通過HPLC法測(cè)定產(chǎn)物的生成量。

HPLC檢測(cè)條件為：

高效液相色譜儀：Agilent 1100Series LC(G1314Pump,G1322ADEGASSER G1314VWD檢測(cè)器，20μL AN進(jìn)樣器，HP ChemStation)；

色譜柱：Kromasil 100-5SIL 250mm×4.6mm×5μm；

流動(dòng)相：二氯甲烷:乙醚:甲醇(體積比86:12:2)，0.45μm微孔濾膜過濾；

流速：1mL/min；

柱溫：30℃；

檢測(cè)器：UV Detector，波長(zhǎng)：240nm。

進(jìn)樣量：20μL

表2 otsA工程菌株與對(duì)照菌株轉(zhuǎn)化醋酸可的松生成醋酸潑尼松的轉(zhuǎn)化結(jié)果比較

由表2可知，利用本發(fā)明獲得的高有機(jī)溶劑耐受性的otsA工程菌株進(jìn)行甾體C_1,2脫氫反應(yīng)，體系中乙醇濃度由4％增加到8％時(shí)，底物CA的投加量提高了3倍，工程菌株otsA轉(zhuǎn)化12h后產(chǎn)物PA的生成量分別由原來的1.85g/L增加到2.78g/L，而對(duì)照菌株此時(shí)的PA生成量?jī)H為2.35g/L，是工程菌株otsA的84.5％。

實(shí)施例3：otsB工程菌株的構(gòu)建及應(yīng)用

1制備含有重組質(zhì)粒pART2-otsB的基因工程菌

(1)重組質(zhì)粒pART2-otsB的構(gòu)建

以簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(Arthrobacter simplex)ACCC 12070基因組為模板，利用引物otsB-F(如SEQ ID：7所示)和otsB-R(如SEQ ID：8所示)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增獲得簡(jiǎn)單節(jié)桿菌海藻糖合成基因otsB基因序列(如SEQ ID：9所示)，

SEQ ID：7 cgggatccag tgaggttccc gacgcgcg

SEQ ID：8 tgctctagac tagccgagcc ggcggacc

PCR反應(yīng)體系如下：

PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃30s，63℃30s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)后72℃10min。

海藻糖合成基因otsB序列和質(zhì)粒pART2分別用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Xba Ⅰ處理(37℃，4h)，利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)分別回收目的片段，將酶切后的質(zhì)粒和海藻糖合成基因otsB序列按1:3(物質(zhì)的量之比)的比例進(jìn)行連接反應(yīng)(16℃，12h)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿DH5α，經(jīng)篩選獲得重組質(zhì)粒pART2-otsB。

獲得的重組質(zhì)粒pART2-otsB用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖6所示。

(2)過表達(dá)otsB基因簡(jiǎn)單節(jié)桿菌工程菌株的獲得

①感受態(tài)細(xì)胞的制備：

挑取簡(jiǎn)單節(jié)桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，36℃、250r/min振蕩培養(yǎng)36h，至菌液OD₆₀₀為3.0形成種子液，取1mL種子液接入裝有50mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，36℃、250r/min培養(yǎng)12h，至OD₆₀₀為1.5，加入細(xì)胞壁處理劑蘇氨酸(濃度為0.5-4.0％)處理振蕩2-4h后，將裝有菌液的三角瓶置于冰浴上冷卻20min，4℃下7000r/min離心15min，棄上清；加50mL預(yù)冷至0℃的電擊緩沖液洗滌菌體后，4℃下5000r/min離心10min，棄上清；重復(fù)洗滌兩次后，加入1.5mL電擊緩液重懸菌體，搖勻，獲得簡(jiǎn)單節(jié)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，于-80℃保存待用。

其中，電擊緩沖液由15％甘油和1.0mol/L山梨醇組成。

其中，細(xì)胞壁處理劑蘇氨酸添加量與震蕩處理時(shí)長(zhǎng)安排如下表所示：

②質(zhì)粒pART2-otsB的電激轉(zhuǎn)化

取150μL簡(jiǎn)單節(jié)桿菌感受態(tài)細(xì)胞于1.5mL離心管中，加入50μL構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pART2-otsB，混合均勻后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電脈沖杯內(nèi)冰浴5min；打開電脈沖儀，1.5kV電擊轉(zhuǎn)化；電激后立即向電脈沖杯內(nèi)加入1.5mL無菌復(fù)蘇培養(yǎng)基，混勻后，36℃緩慢振蕩培養(yǎng)12h后，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的選擇平板上，36℃倒置培養(yǎng)96h，獲得含有重組質(zhì)粒pART2–otsB的基因工程菌株，即過表達(dá)otsB基因簡(jiǎn)單節(jié)桿菌工程菌株。

其中，復(fù)蘇培養(yǎng)基是含有1.0moL/L山梨醇的LB液體培養(yǎng)基。

2海藻糖合成基因otsB的表達(dá)

(1)菌體制備

分別從斜面挑取otsB工程菌株(含有重組質(zhì)粒pART2-otsB)和對(duì)照菌株(含有空質(zhì)粒)接種于LB液體培養(yǎng)基中，32℃，160r/min震蕩培養(yǎng)至菌體的生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)前期(32h)、對(duì)數(shù)中期(38h)和對(duì)數(shù)末期(48h)，5000r/min，4℃離心10min收集菌體，并用PBS洗滌一遍，將菌體放置-80℃冷凍24h后，真空冷凍干燥24h。

(2)海藻糖的提取

取0.05g凍干的菌體在室溫下用研缽研碎，加入500μL 0.5M預(yù)冷的三氯乙酸，置于冰上提取30min，其間每隔5分鐘震蕩5次，5000r/min室溫離心10min，收集上清。

(3)海藻糖含量的測(cè)定

通過HPLC方法檢測(cè)菌體內(nèi)的海藻糖含量。HPLC檢測(cè)條件為：

高效液相色譜儀：Agilent 1200型高效液相色譜儀，示差檢測(cè)器；

色譜柱：Prevail Carbohydrate 250mm×4.6mm×5μm；

流動(dòng)相：乙腈:H₂O(體積比為85∶15)，0.45μm微孔濾膜過濾；

流速：1mL/min；

柱溫：30℃；

檢測(cè)器：RID Detector，檢測(cè)器溫度：35℃。

進(jìn)樣量：10μL

otsB工程菌株和對(duì)照菌株在不同生長(zhǎng)階段的胞內(nèi)海藻糖含量如圖7所示，工程菌株otsB在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)不同時(shí)期胞內(nèi)海藻糖均明顯高于對(duì)照菌株，這說明海藻糖合成基因otsB已在簡(jiǎn)單節(jié)桿菌中成功過表達(dá)。

3 過表達(dá)otsB基因簡(jiǎn)單節(jié)桿菌工程菌株有機(jī)溶劑耐受性的分析

分別從斜面挑取otsB工程菌株和對(duì)照菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，32℃，160r/min振蕩培養(yǎng)36h，以一定的接種量分別轉(zhuǎn)接到含有4％乙醇和6％甲醇的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，并將初始OD₆₀₀值調(diào)為相同(均為0.13)，32℃，160r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)24h、48h和72h后分別取樣測(cè)定OD₆₀₀值，并計(jì)算相對(duì)OD ₆₀₀值(相對(duì)OD₆₀₀＝有機(jī)溶劑壓力下的菌液OD₆₀₀/無壓力下的菌液OD₆₀₀)。實(shí)驗(yàn)中含質(zhì)粒菌株培養(yǎng)基中還需添加終濃度為50μg/ml的卡那霉素。由圖8可知，工程菌株otsB在4％乙醇?jí)毫ο屡囵B(yǎng)72h后的相對(duì)OD₆₀₀值分別比對(duì)照菌株提高了25.0％；在6％甲醇?jí)毫ο屡囵B(yǎng)72h后的相對(duì)OD₆₀₀值分別比對(duì)照菌株提高了68.3％。這說明otsB工程菌株對(duì)甲醇和乙醇的耐受性明顯提高。

4 過表達(dá)otsB基因簡(jiǎn)單節(jié)桿菌工程菌株轉(zhuǎn)化醋酸可的松能力的測(cè)定

分別從斜面挑取otsB工程菌株和對(duì)照菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，32℃，160r/min振蕩培養(yǎng)36h，以一定的接種量轉(zhuǎn)接到裝有50mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，初始OD₆₀₀值調(diào)整為0.13，32℃，160r/min震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別加入終濃度為0.5g/L的底物醋酸可的松(CA)誘導(dǎo)C_1,2位脫氫酶產(chǎn)生，32℃，160r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)18h至各個(gè)菌株的對(duì)數(shù)中后期。培養(yǎng)液經(jīng)4℃，7000r/min離心10min，收集的菌體用預(yù)冷的pH 7.2的0.1M的KH₂PO₄-NaOH溶液(PBS緩沖溶)洗滌2次，將菌體懸浮于適量的PBS緩沖液中制備得到靜息細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中含質(zhì)粒菌株培養(yǎng)基中還需添加終濃度為50μg/ml的卡那霉素。

利用上述靜息細(xì)胞制備30mL的轉(zhuǎn)化體系。

轉(zhuǎn)化體系I-低底物濃度和助溶劑轉(zhuǎn)化體系：菌體OD₆₀₀為2.0，底物CA濃度為2g/L，4％乙醇助溶；

轉(zhuǎn)化體系II-高底物濃度和助溶劑體系：菌體OD₆₀₀為2.0，底物CA濃度為8g/L，8％乙醇助溶。

上述兩個(gè)體系在34℃，180r/min振蕩轉(zhuǎn)化12h后，取樣測(cè)定產(chǎn)物醋酸潑尼松(PA)的濃度。每次取樣0.4mL加入0.8mL乙酸乙酯終止反應(yīng)，超聲萃取10min以上，12000r/min離心10min，吸取100μL上清液于新的1.5ml離心管中，在通風(fēng)櫥中過夜揮發(fā)，再用1ml流動(dòng)相復(fù)溶，通過HPLC法測(cè)定產(chǎn)物的生成量。

HPLC檢測(cè)條件為：

高效液相色譜儀：Agilent 1100Series LC(G1314Pump,G1322ADEGASSER G1314VWD檢測(cè)器，20μL AN進(jìn)樣器，HP ChemStation)；

色譜柱：Kromasil 100-5SIL 250mm×4.6mm×5μm；

流動(dòng)相：二氯甲烷:乙醚:甲醇(體積比86:12:2)，0.45μm微孔濾膜過濾；

流速：1mL/min；

柱溫：30℃；

檢測(cè)器：UV Detector，波長(zhǎng)：240nm。

進(jìn)樣量：20μL

表3 otsB工程菌株與對(duì)照菌株轉(zhuǎn)化醋酸可的松生成醋酸潑尼松的轉(zhuǎn)化結(jié)果比較

由表3可知，利用本發(fā)明獲得的高有機(jī)溶劑耐受性的otsB工程菌株進(jìn)行甾體C1,2脫氫反應(yīng)，體系中乙醇濃度由4％增加到8％時(shí)，底物CA的投加量提高了3倍，工程菌株otsB轉(zhuǎn)化12h后產(chǎn)物PA的生成量分別由原來的1.87g/L增加到3.43g/L，而對(duì)照菌株此時(shí)的PA生成量?jī)H為2.35g/L，是工程菌株otsB的68.5％。

實(shí)施例4 irrE工程菌株的構(gòu)建及應(yīng)用

1 制備含有重組質(zhì)粒pART2-irrE的基因工程菌

(1)重組質(zhì)粒pART2-irrE的構(gòu)建

以耐輻射異常球菌(Deinococcus radiodurans)(購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。菌種編號(hào)：1.633)基因組為模板，利用引物irrE3-F(如SEQ ID：1所示)和irrE3-R(如SEQ ID：2所示)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增獲得耐輻射異常球菌全局轉(zhuǎn)錄因子irrE基因序列(如SEQ ID：3所示)，PCR反應(yīng)體系如下：

PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃30s，63℃30s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)后72℃10min。

全局轉(zhuǎn)錄因子irrE序列和質(zhì)粒pART2分別用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Xba Ⅰ處理(37℃，4h)，利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)分別回收目的片段，將酶切后的質(zhì)粒和全局轉(zhuǎn)錄因子irrE序列按1:3(物質(zhì)的量之比)的比例進(jìn)行連接反應(yīng)(16℃，12h)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿DH5α，經(jīng)篩選獲得重組質(zhì)粒pART2-irrE。

獲得的重組質(zhì)粒pART2-irrE用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示。

(2)irrE工程菌株的獲得

①感受態(tài)細(xì)胞的制備：

挑取簡(jiǎn)單節(jié)桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，32℃、200r/min震蕩培養(yǎng)25h，至菌體OD₆₀₀為2.0形成種子液，取1mL種子液接入裝有50mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，32℃、200r/min培養(yǎng)8h，至OD₆₀₀為1.0，加入細(xì)胞壁處理劑甘氨酸(濃度為0.5-4.0％)處理，震蕩處理2-4h后，將裝有菌液的三角瓶置于冰浴上冷卻12min，4℃下6000r/min離心10min，棄上清；加30mL預(yù)冷至0℃的電擊緩沖液洗滌菌體后，4℃下5000r/min離心10min，棄上清；重復(fù)洗滌兩次后，加入1mL電擊緩液重懸菌體，搖勻，獲得簡(jiǎn)單節(jié)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，于-80℃保存待用。

其中，電擊緩沖液由12％甘油和0.7mol/L山梨醇組成。

其中，細(xì)胞壁處理劑甘氨酸添加量與震蕩處理時(shí)長(zhǎng)安排如下表所示：

②重組質(zhì)粒pART2-irrE的電激轉(zhuǎn)化

取100μL簡(jiǎn)單節(jié)桿菌感受態(tài)細(xì)胞于1.5mL離心管中，加入20μL構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pART2-irrE，混合均勻后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電脈沖杯內(nèi)冰浴2min；打開電脈沖儀，1kV電擊轉(zhuǎn)化；電激后立即向電脈沖杯內(nèi)加入1mL無菌復(fù)蘇培養(yǎng)基，混勻后，32℃緩慢振蕩培養(yǎng)10h后，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的選擇平板上，32℃倒置培養(yǎng)72h，獲得含有重組質(zhì)粒pART2-irrE的工程菌株，即irrE工程菌株。

其中，復(fù)蘇培養(yǎng)基是含有0.6moL/L山梨醇的LB液體培養(yǎng)基。

2 全局轉(zhuǎn)錄因子IrrE的表達(dá)

(1)菌體培養(yǎng)

分別從斜面挑取irrE工程菌株(含有重組質(zhì)粒pART2-irrE)和對(duì)照菌株(含有空質(zhì)粒)接種于LB液體培養(yǎng)基中，32℃，160r/min振蕩培養(yǎng)40h。以4％(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接入新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，32℃，160r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀約為4.0。實(shí)驗(yàn)中含質(zhì)粒菌株培養(yǎng)基中還需添加終濃度為50μg/ml的卡那霉素。

其中，LB液體培養(yǎng)基組成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。

(2)蛋白純化

將上述培養(yǎng)液置于冰上至少10min，然后7000g，4℃離心15min，收集菌體。用冷卻的PBS緩沖溶液洗滌兩次，加入10mL菌體破碎液渦旋振蕩重懸菌體。將重懸后的菌體在冰浴條件下超聲破碎，破碎程序?yàn)椋浩扑楣β?50W，時(shí)間3:3(s/s)超聲約60min，直至菌液透亮，7000r/min，4℃離心10min，收集上清中的可溶性蛋白，將菌體裂解液稀釋后負(fù)載到His純化柱上，流速為1.0mL/min收集流穿液。用Binding Buffer沖洗柱子，洗去雜蛋白。使用Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰即為蛋白峰。將收集到的蛋白峰，按比例加入5倍蛋白上樣緩沖液，混勻后沸水浴5min，以蛋白凝膠每孔30uL蛋白樣品的量上樣；在濃縮膠和分離膠中分別用8V/cm和12V/cm進(jìn)行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶接近分離膠末端時(shí)停止；將蛋白膠轉(zhuǎn)入染色槽中，加入考馬斯亮藍(lán)染色液，緩慢震蕩染色2h以上，以達(dá)到充分染色。染色結(jié)束后，沖洗掉多余的染色液，加入脫色液，緩慢震蕩脫色約2h，直至條帶清晰。irrE工程菌株與對(duì)照菌株全蛋白經(jīng)過HIS純化后蛋白的SDS-PAGE電泳圖見圖2。

其中，菌體破碎液組成：5mL PBS緩沖液，100μL的PMSF，500μL甘油，2mL 0.5mol/L的NaCl，50μL 20mg/mL溶菌酶。

(3)Western Blot實(shí)驗(yàn)

蛋白凝膠電泳后，將蛋白凝膠從電泳槽上取下，去除濃縮膠和多余部分，用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(PVDF)上，將轉(zhuǎn)印的PVDF膜放置到ddH₂O中漂洗1-2min，洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液，用5％脫脂奶粉(用TBST配制)封閉，置于水平搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉2h。棄除封閉液，PVDF膜用His探針抗體4℃過夜孵育。再根據(jù)一抗選擇相應(yīng)的羊抗兔二抗，在室溫下二抗孵育2h，孵育完成后用TBST清洗干凈。用掃膜儀將洗干凈的PVDF膜置于暗室中用掃膜以進(jìn)行掃描。Western Blot結(jié)果如圖3所示。

由圖2和圖3可知，與對(duì)照菌株相比，irrE工程菌株在35KDa處出現(xiàn)了一條明顯的差異條帶，其大小與irrE的理論大小相符，這說明全局轉(zhuǎn)錄因子irrE已在簡(jiǎn)單節(jié)桿菌中成功表達(dá)。

3 irrE工程菌株有機(jī)溶劑耐受性的分析

(1)irrE工程菌株在不同濃度甲醇及乙醇?jí)毫ο碌纳L(zhǎng)情況

分別從斜面挑取irrE工程菌株和對(duì)照菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，32℃，160r/min下振蕩培養(yǎng)40h，以一定的接種量轉(zhuǎn)接入含有不同濃度甲醇(4％、6％、8％)和乙醇(2％、4％、6％)的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，并將初始OD₆₀₀值調(diào)為相同(均為0.2)，32℃，160r/min震蕩培養(yǎng)46h后取樣測(cè)定OD₆₀₀值，并計(jì)算相對(duì)OD₆₀₀值(相對(duì)OD600＝有機(jī)溶劑壓力下的菌液OD₆₀₀/無壓力下的菌液OD₆₀₀)。實(shí)驗(yàn)中含質(zhì)粒菌株培養(yǎng)基中還需添加終濃度為50μg/ml的卡那霉素。由圖4可知，與對(duì)照菌株相比，irrE工程菌株在2％、4％和6％乙醇?jí)毫ο屡囵B(yǎng)46h后的相對(duì)OD₆₀₀值分別提高14.9％、73.9％和90.0％；4％和6％甲醇?jí)毫ο屡囵B(yǎng)46h后的相對(duì)OD₆₀₀值分別提高21.1％和13.9％，這說明重組表達(dá)的irrE工程菌株對(duì)甲醇和乙醇的耐受性均明顯提高。

(2)irrE工程菌株在高濃度乙醇沖擊下的存活情況

分別從斜面挑取irrE工程菌株和對(duì)照菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，32℃，160r/min下振蕩培養(yǎng)40h，以一定的接種量轉(zhuǎn)接入新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，并將初始OD₆₀₀值調(diào)為相同(均為0.2)，32℃，160r/min振蕩培養(yǎng)到各自的對(duì)數(shù)中后期。6000r/min離心10min收集菌體，將收集得到的菌體用新鮮的LB液體培養(yǎng)基懸浮并將菌液的OD₆₀₀值均調(diào)節(jié)至1.0，然后加入16％乙醇沖擊1h。將沖擊后的培養(yǎng)液采用10倍逐級(jí)稀釋法在LB平板上涂布，32℃培養(yǎng)一定時(shí)間后觀察平板上的菌落數(shù)并計(jì)算存活率。實(shí)驗(yàn)中含質(zhì)粒菌株培養(yǎng)基中還需添加終濃度為50μg/ml的卡那霉素。

存活率計(jì)算方法如下：

存活率(％)＝菌株壓力條件下的菌落數(shù)/菌株無壓力條件下的菌落數(shù)×100％

由圖5可知，經(jīng)過16％乙醇沖擊1h后，irrE工程菌株的存活率為69％，比對(duì)照菌株提高了2倍。

4 irrE工程菌株轉(zhuǎn)化醋酸可的松能力的測(cè)定

(1)靜息細(xì)胞的制備

分別從斜面挑取irrE工程菌株和對(duì)照菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，32℃，160r/min振蕩培養(yǎng)40h，以一定的接種量轉(zhuǎn)接到裝有50mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，初始OD₆₀₀值調(diào)整為0.2，32℃，160r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別加入終濃度為0.5g/L的底物醋酸可的松(CA)誘導(dǎo)C1,2位脫氫酶產(chǎn)生，32℃，160r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)18h至各個(gè)菌株的對(duì)數(shù)中后期。培養(yǎng)液經(jīng)4℃，7000r/min離心10min，收集的菌體用預(yù)冷的pH 7.2的0.1M的KH₂PO₄-NaOH溶液(PBS緩沖溶)洗滌2次，將菌體懸浮于適量的PBS緩沖液中制備得到靜息細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中含質(zhì)粒菌株培養(yǎng)基中還需添加終濃度為50μg/ml的卡那霉素。

(2)不同轉(zhuǎn)化體系下全細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率

利用上述靜息細(xì)胞制備30mL的轉(zhuǎn)化體系。

轉(zhuǎn)化體系I-低底物濃度和助溶劑轉(zhuǎn)化體系：菌體OD₆₀₀為2.0，底物CA濃度為2g/L，4％乙醇助溶；

轉(zhuǎn)化體系II-高底物濃度和助溶劑體系：菌體OD₆₀₀為2.0，底物CA濃度為8g/L，8％乙醇助溶。

上述兩個(gè)體系在34℃，180r/min振蕩轉(zhuǎn)化10h后，取樣測(cè)定產(chǎn)物醋酸潑尼松(PA)的濃度。每次取樣0.4mL加入0.8mL乙酸乙酯終止反應(yīng)，超聲萃取10min以上，12000r/min離心10min，吸取100μL上清液于新的1.5ml離心管中，在通風(fēng)櫥中過夜揮發(fā)，再用1ml流動(dòng)相復(fù)溶，通過HPLC法測(cè)定產(chǎn)物的生成量。

HPLC檢測(cè)條件為：

高效液相色譜儀：Agilent 1100Series LC(G1314Pump,G1322ADEGASSER G1314VWD檢測(cè)器，20μL AN進(jìn)樣器，HP ChemStation)；

色譜柱：Kromasil 100-5SIL 250mm×4.6mm×5μm；

流動(dòng)相：二氯甲烷:乙醚:甲醇(體積比86:12:2)，0.45μm微孔濾膜過濾；

流速：1mL/min；

柱溫：30℃；

檢測(cè)器：UV Detector，波長(zhǎng)：240nm。

進(jìn)樣量：20μL

表4 irrE工程菌株與對(duì)照菌株轉(zhuǎn)化醋酸可的松生成醋酸潑尼松的轉(zhuǎn)化結(jié)果比較

由表4可知，利用本發(fā)明獲得的高有機(jī)溶劑耐受性的irrE工程菌株進(jìn)行甾體C_1,2脫氫反應(yīng)，體系中乙醇濃度由4％增加到8％時(shí)，底物CA的投加量提高了3倍，轉(zhuǎn)化10h后產(chǎn)物PA的生成量由原來的1.61g/L增加到6.39g/L，提高了約3倍，而對(duì)照菌株此時(shí)的PA生成量為工程菌株的53.3％，僅為3.41g/L。

以上對(duì)本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。凡依本發(fā)明申請(qǐng)范圍所作的均等變化與改進(jìn)等，均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。