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一種優(yōu)化的pBBR1MCS系列載體及其應用的制作方法

文檔序號:12249199閱讀:4965來源:國知局
一種優(yōu)化的pBBR1MCS系列載體及其應用的制作方法與工藝

本發(fā)明屬于生物技術領域,涉及一種廣宿主的表達載體的構建。



背景技術:

pBBR1MCS系列載體包括pBBR1MCS、pBBR1MCS2-5等一系列廣宿主載體,這類載體可以在多種宿主中復制,像Acetobacter xylinum,Alcaligenes eutrophus,Bartonella bacilliformis,Bordetella spp.,Brucella spp.,Caulobacter crescentus,Escherichia coli,Paracoccous denitrificans,Pseudomonas fluorescens,Rhizobium meliloti,Rhodobacter sphaeroides,Vibrio cholerae,Xanthomonas campestris等。這些載體的共同特征包括:(1)載體大小較小(﹤5.3kb),可以插入的外源片段較大;(2)擁有一個擴展的多克隆位點(MCS),(3)含有LacZα短肽編碼基因,可以利用α互補直接篩選插入了外源片段的重組子,(4)可以與包括IncP,IncQ和IncW等在內的多種不兼容群的質粒兼容。

但是,Sonja等人(2013)的研究發(fā)現(xiàn),若利用pBBR1MCS系列載體表達外源基因,因為表達的外源蛋白的N端同β-半乳糖苷酶α端的大約20個短肽融合表達,可能會影響目的蛋白的活性。因此,若要將此系列載體應用于外源基因的表達,需要對其表達元件進行改造。



技術實現(xiàn)要素:

本發(fā)明需要解決的問題是克服pBBR1MCS系列載體的缺陷,提供一種優(yōu)化的pBBR1MCS系列載體,將該載體的LacZα短肽編碼基因、lac啟動子替換成來源于pGEX4T-1的tac啟動子,使該載體更適用于基因的表達,目的基因可以用IPTG誘導表達且N端不含β-半乳糖苷酶α端的短肽,該載體的LacZα表達相關的終止序列可以被替換成pGEX4T-1的終止序列,也可以不用替換。

本發(fā)明提供的優(yōu)化的表達載體構建流程如下:利用PCR技術分別擴增來源于pGEX4T-1的包括Ptac啟動子和調控序列LacIq的片段Ptac、終止序列Ter和來自pBBR1MCS系列載體的多克隆位點MCS,其中,MCS位點在設計引物時引入了Bgl II酶切位點;利用融合PCR技術將Ptac、Ter和MCS序列融合,獲得表達元件PMT,在設計PMT片段引物時兩端分別引入Kpn I和Sac I酶切位點;利用PCR擴增得到pBBR1MCS系列載體上除lac啟動子、LacZα編碼序列、MCS及終止序列以外的骨架結構pMCS,設計引物時PMCS兩端分別引入Kpn I和Sac I酶切位點;利用Kpn I和Sac I對表達元件PMT和骨架結構pMCS進行酶切后利用Takara公司的連接試劑盒進行連接,獲得改造的表達載體pBBRtac。

同原有質粒相比,優(yōu)化載體的多克隆位點引入了Bgl II的酶切位點,便于基因的克隆和功能鑒定。

本發(fā)明構建的表達載體為pBBRtac系列載體,即pBBRtac,pBBRtac2-5。

本發(fā)明構建的廣宿主載體pBBRtac采用Ptac啟動子,同Plac啟動子相比,該啟動子是trp啟動子和lacUV5的拼接雜合啟動子,轉錄水平更高,更有利于目的蛋白的表達,同時,去除了N端融合的20個左右氨基酸的β-半乳糖苷酶α端的短肽將有利于外源蛋白的正確折疊,使其形成有活性的蛋白,這非常有利于目標基因在多種宿主中的高效表達。

本發(fā)明構建的廣宿主載體已成功應用于大腸桿菌中。

附圖說明

圖1市售pBBR1MCS3質粒圖譜

圖2 pBBRtac3質粒圖譜

圖3 UgpG表達的SDS-PAGE分析

具體實施方式

實施例1pBBRtac3載體構建

本發(fā)明以廣宿主載體pBBR1MCS3為改造模板,將該載體的LacZα編碼基因、lac啟動子替換成來源于pGEX4T-1的tac啟動子,使其適用于外源基因的表達,該載體的LacZα表達相關的終止序列可以被替換成pGEX4G-1的終止序列,也可以不用替換,本實施例中將pBBR1MCS3終止序列替換成pGEX4T-1的終止序列。同時,對該載體的多克隆位點進行改造,引入了Bgl II的酶切位點,得到重組質粒pBBRtac3。

pBBRtac3的設計思路和技術路線如下:

1.PCR擴增包含tac啟動子和調控序列l(wèi)acIq的片段Ptac以及終止序列Ter

以質粒pGEX-4T-1(GenBank No.U13853)為模板,根據(jù)基因的序列,利用primer5.0設計引物并擴增包含tac啟動子和lacIq調控序列的片段Ptac以及終止序列Ter。設計引物序列為:Ptac-F:GATAACCGTATTACCGCCTTTG(SEQ ID NO.1)

Ptac-R:TCGACCTCGAGGGGGGGCCCACCTAGTATAGGGGACATGAA(SEQ ID NO.2)

Ter-F:GCCACCGCGGTGAGATCTATCTGCCTCGCGCGTTTCGGT(SEQ ID NO.3)

Ter-R:CGCGTTATTGAAGCATTTATCAGGGT(SEQ ID NO.4)

使用的酶是Takara公司高保真的HS DNA Polymerase,PCR反應條件為:95℃5min;95℃45s;50℃/55℃45s;72℃2.5min/30s,30個循環(huán);72℃10min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳及測序驗證。

2.PCR擴增pBBR1MCS-3的多克隆位點MCS片段

以pBBR1MCS-3為模板,以MCS-R和MCS-F為引物,利用購自Takara公司的 HS DNA Polymerase,采用常規(guī)PCR方法擴增多克隆位點MCS片段,序列如SEQID NO.7所示。在設計引物時去掉了原有的Kpn I和Sac I位點,引入了Bgl II的酶切位點(下劃線部分)。測序結果表明,該多克隆位點既包含了原質粒上的的Xho I、Sma I、Spe I等酶切位點,同時也成功引入了酶切位點Bgl II。

SEQ ID NO.5:

CAATTTCACACAGGAAACAGTACATATGGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGAGATCTATCTGCCTCGCGCGTTT

設計引物如下:

MCS-F:CAATTTCACACAGGAAACAGTACATATGGGGCCCCCCCTCGAGGTCGAC(SEQ ID NO.6)

MCS-R:AAACGCGCGAGGCAGATAGATCTCACCGCGGTGGCGGCCG(SEQ ID NO.7)

PCR反應條件:95℃5min;95℃45s;55℃45s;72℃30s,30個循環(huán);72℃10min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳及測序驗證。

3.融合PCR構建表達元件PMT

該過程通過兩步來實現(xiàn)。第一步,融合PCR。在設計擴增Ptac、MCS和Ter片段的引物時,分別引入了同相鄰片段重疊的序列,這些序列可以作為融合PCR的引物,并且,通過計算使PCR體系中各片段的摩爾濃度一致。PCR體系(25μL)為:2×GC Buffer 12.5μL,dNTP 2μL, HS DNA Polymerase 0.4μL,MCS 2.8μL,Ptac 5.6μL,Ter 1.7μL,PCR反應條件:95℃5min;95℃45s,65℃2.5min,72℃3.5min,25個循環(huán);72℃10min。

第二步,巢氏PCR。以融合PCR產物為模板,以PMT-F和PMT-R為引物進行巢氏PCR擴增,條件如下:95℃5min;95℃45s;60℃45s;72℃2.5min,30個循環(huán);72℃10min。

引物序列如下:

PMT-F:AGGGGTACCATTCCGACACCATCGAATGGTGCAAAAC(SEQ ID NO.8)

PMT-R:CGGCCGAGCTCGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTT(SEQ ID NO.9)

4.PCR擴增pBBR1MCS-3質粒的骨架pMCS-3

以pBBR1MCS-3(GenBank No.U25059)為模板,以pMCS3-F和pMCS3-R為引物,利用HS DNA Polymerase擴增pBBR1MCS-3質粒上除lac啟動子、LacZα編碼序列、MCS及終止序列的骨架結構片段pMCS-3,PCR反應條件:95℃5min;95℃45s;60℃45s;72℃5min,30個循環(huán);72℃10min。

引物序列如下:

pMCS3-F:GCGGCGAGCTCTTGTAAGCGTTAATATTTTG(SEQ ID NO.10)

pMCS3-R:ACGGGTACCAATTGCGTTGCGCTCACTGC(SEQ ID NO.11)

5.pBBRtac3表達載體構建

將PMT片段和pMCS片段分別進行切膠回收,利用限制性內切酶Kpn I和Sac I對純化后的片段進行雙酶切,經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收,回收后的片段利用Takara的連接試劑盒進行連接,連接體系為:pMCS3片段3μL,PMT片段6μL,Solution I 9μL,16℃過夜連接。將連接產物加入氯化鈣法制備的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,冰浴30min,42℃水浴熱激90s,快速置于冰上1-3min。加入新鮮LB培養(yǎng)基800μL,于37℃振蕩培養(yǎng)45min。取200μL菌液涂布于含有終濃度為12.5μg/ml四環(huán)素的LB固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)至有單菌落出現(xiàn)。挑取單菌落至含有四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩過夜培養(yǎng),根據(jù)天根質粒提取試劑盒操作說明提取質粒。以質粒為模板,設計兩對引物PMT-F-in、PMT-R-in和SacI-F、SacI-R分別進行PCR反應,同時,采用Kpn I和Sac I雙酶切的辦法對質粒加以鑒定。將鑒定正確的質粒送往上海生工生物公司測序,所得的質粒命名為pBBRtac3,序列如SEQ ID NO.12所示。其中,3019-5464位為PMT序列。

SEQ ID NO.12

CTCGGGCCGTCTCTTGGGCTTGATCGGCCTTCTTGCGCATCTCACGCGCTCCTGCGGCGGCCTGTAGGGCAGGCTCATACCCCTGCCGAACCGCTTTTGTCAGCCGGTCGGCCACGGCTTCCGGCGTCTCAACGCGCTTTGAGATTCCCAGCTTTTCGGCCAATCCCTGCGGTGCATAGGCGCGTGGCTCGACCGCTTGCGGGCTGATGGTGACGTGGCCCACTGGTGGCCGCTCCAGGGCCTCGTAGAACGCCTGAATGCGCGTGTGACGTGCCTTGCTGCCCTCGATGCCCCGTTGCAGCCCTAGATCGGCCACAGCGGCCGCAAACGTGGTCTGGTCGCGGGTCATCTGCGCTTTGTTGCCGATGAACTCCTTGGCCGACAGCCTGCCGTCCTGCGTCAGCGGCACCACGAACGCGGTCATGTGCGGGCTGGTTTCGTCACGGTGGATGCTGGCCGTCACGATGCGATCCGCCCCGTACTTGTCCGCCAGCCACTTGTGCGCCTTCTCGAAGAACGCCGCCTGCTGTTCTTGGCTGGCCGACTTCCACCATTCCGGGCTGGCCGTCATGACGTACTCGACCGCCAACACAGCGTCCTTGCGCCGCTTCTCTGGCAGCAACTCGCGCAGTCGGCCCATCGCTTCATCGGTGCTGCTGGCCGCCCAGTGCTCGTTCTCTGGCGTCCTGCTGGCGTCAGCGTTGGGCGTCTCGCGCTCGCGGTAGGCGTGCTTGAGACTGGCCGCCACGTTGCCCATTTTCGCCAGCTTCTTGCATCGCATGATCGCGTATGCCGCCATGCCTGCCCCTCCCTTTTGGTGTCCAACCGGCTCGACGGGGGCAGCGCAAGGCGGTGCCTCCGGCGGGCCACTCAATGCTTGAGTATA CTCACTAGACTTTGCTTCGCAAAGTCGTGACCGCCTACGGCGGCTGCGGCGCCCTACGGGCTTGCTCTCCGGGCTTCGCCCTGCGCGGTCGCTGCGCTCCCTTGCCAGCCCGTGGATATGTGGACGATGGCCGCGAGCGGCCACCGGCTGGCTCGCTTCGCTCGGCCCGTGGACAACCCTGCTGGACAAGCTGATGGACAGGCTGCGCCTGCCCACGAGCTTGACCACAGGGATTGCCCACCGGCTACCCAGCCTTCGACCACATACCCACCGGCTCCAACTGCGCGGCCTGCGGCCTTGCCCCATCAATTTTTTTAATTTTCTCTGGGGAAAAGCCTCCGGCCTGCGGCCTGCGCGCTTCGCTTGCCGGTTGGACACCAAGTGGAAGGCGGGTCAAGGCTCGCGCAGCGACCGCGCAGCGGCTTGGCCTTGACGCGCCTGGAACGACCCAAGCCTATGCGAGTGGGGGCAGTCGAAGGCGAAGCCCGCCCGCCTGCCCCCCGAGCCTCACGGCGGCGAGTGCGGGGGTTCCAAGGGGGCAGCGCCACCTTGGGCAAGGCCGAAGGCCGCGCAGTCGATCAACAAGCCCCGGAGGGGCCACTTTTTGCCGGAGGGGGAGCCGCGCCGAAGGCGTGGGGGAACCCCGCAGGGGTGCCCTTCTTTGGGCACCAAAGAACTAGATATAGGGCGAAATGCGAAAGACTTAAAAATCAACAACTTAAAAAAGGGGGGTACGCAACAGCTCATTGCGGCACCCCCCGCAATAGCTCATTGCGTAGGTTAAAGAAAATCTGTAATTGACTGCCACTTTTACGCAACGCATAATTGTTGTCGCGCTGCCGAAAAGTTGCAGCTGATTGCGCATGGTGCCGCAACCGTGCGGCACCCTACCGCATGGAGATAAGCATGGCCACGCAGTCCAGAGAAATCGGCATTCAAGCCAAGAACAAGCCCGGTCACTGGGTGCAAACGGAACGCAAAGCGCATGAGGCGTGGGCCGGGCTTATTGCGAGGAAACCCACGGCGGCAATGCTGCTGCATCACCTCGTGGCGCAGATGGGCCACCAGAACGCCGTGGTGGTCAGCCAGAAGACACTTTCCAAGCTCATCGGACGTTCTTTGCGGACGGTCCAATACGCAGTCAAGGACTTGGTGGCCGAGCGCTGGATCTCCGTCGTGAAGCTCAACGGCCCCGGCACCGTGTCGGCCTACGTGGTCAATGACCGCGTGGCGTGGGGCCAGCCCCGCGACCAGTTGCGCCTGTCGGTGTTCAGTGCCGCCGTGGTGGTTGATCACGACGACCAGGACGAATCGCTGTTGGGGCATGGCGACCTGCGCCGCATCCCGACCCTGTATCCGGGCGAGCAGCAACTACCGACCGGCCCCGGCGAGGAGCCGCCCAGCCAGCCCGGCATTCCGGGCATGGAACCAGACCTGCCAGCCTTGACCGAAACGGAGGAATGGGAACGGCGCGGGCAGCAGCGCCTGCCGATGCCCGATGAGCCGTGTTTTCTGGACGATGGCGAGCCGTTGGAGCCGCCGACACGGGTCACGCTGCCGCGCCGGTAGCACTTGGGTTGCGCAGCAACCCGTAAGTGCGCTGTTCCAGACTATCGGCTGTAGCCGCCTCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCGTTTTTATCAGGCTCTGGGAGGCAGAATAAATGATCATATCGTCAATTATTACCTCCACGGGGAGAGCCTGAGCAAACTGGC CTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCAATAAACCGGTAAACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCCTGCCCTGAACCGACGACCGGGTCGAATTTGCTTTCGAATTTCTGCCATTCATCCGCTTATTATCACTTATTCAGGCGTAGCACCAGGCGTTTAAGGGCACCAATAACTGCCTTAAAAAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAAGAGCTCGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGATAGATCTCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCACCTAGTATAGGGGACATGAATACTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAATATTTGCCAGAACCGTTATGATGTCGGCGCAAAAAACATTATCCAGAACGGGAGTGCGCCTTGAGCGACACGAATTATGCAGTGATTTACGACCTGCACAGCCATACCACAGCTTCCGATGGCTGCCTGACGCCAGAAGCATTGGTGCACCGTGCAGTCGATAACGTAATTCCAACGCCATCAAAAATAATTCGCGTCTGGCCTTCCTGTAGCCAGCTTTCATCAACATTAAATGTGAGCGAGTAACAACCCGTCGGATTCTCCGTGGGAACAAACGGCGGATTGACCGTAATGGGATAGGTTACGTTGGTGTAGATGGGCGCATCGTAACCGTGCATCTGCCAGTTTGAGGGGACGACGACAGTATCGGCCTCAGGAAGATCGCACTCCAGCCAGCTTTCCGGCACCGCTTCTGGTGCCGGAAACCAGGCAAAGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATCCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGT CTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCACCATTCGATGGTGTCGGAATGGTACCAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCATTTGCGCATTCACAGTTCTCCGCAAGAATTGATTGGCTCCAATTCTTGGAGTGGTGAATCCGTTAGCGAGGTGCCGCCGGCTTCCATTCAGGTCGAGGTGGCCCGGCTCCATGCACCGCGACGCAACGCGGGGAGGCAGACAAGGTATAGGGCGGCGCCTACAATCCATGCCAACCCGTTCCATGTGCTCGCCGAGGCGGCATAAATCGCCGTGACGATCAGCGGTCCAGTGATCGAAGTTAGGCTGGTAAGAGCCGCGAGCGATCCTTGAAGCTGTCCCTGATGGTCGTCATCTACCTGCCTGGACAGCATGGCCTGCAACGCGGGCATCCCGATGCCGCCGGAAGCGAGAAGAATCATAATGGGGAAGGCCATCCAGCCTCGCGTCGCGAACGCCAGCAAGACGTAGCCCAGCGCGTCGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATG CAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGATCGCGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGACTGGGCGGCGGCCAAAGCGGTCGGACAGTGCTCCGAGAACGGGTGCGCATAGAAATTGCATCAACGCATATAGCGCTAGCAGCACGCCATAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTACCGGCATAACCAAGCCTATGCCTACAGCATCCAGGGTGACGGTGCCGAGGATGACGATGAGCGCATTGTTAGATTTCATACACGGTGCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGCCCGCGTTCCTGCTGGCGCTGGGCCTGTTTCTGGCGCTGGACTTCCCGCTGTTCCGTCAGCAGCTTTTCGCCCACGGCCTTGATGATCGCGGCGGCCTTGGCCTGCATATCCCGATTCAACGGCCCCAGGGCGTCCAGAACGGGCTTCAGGCGCTCCCGAAGGT

引物序列:

PMT-F-in:ACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGC(SEQ ID NO.13)

PMT-R-in:GCGGATTGACCGTAATGGGATAGG(SEQ ID NO.14)

SacI-F:GGTGATGACGGTGAAAACCTCTG(SEQ ID NO.15)

SacI-R:CGGCACCTCGCTAACGGATTCACC(SEQ ID NO.16)

實施例2:載體pBBRtac3在大腸桿菌中表達檢測

本實施例以鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.WG,保藏號為CCTCC No:M2013161)中UDP-葡萄糖焦磷酸化酶UgpG(GenBank No.KTF67651)基因在大腸桿菌中的表達為例,驗證載體的有效性。所用引物序列如下:

UgpG-F:GCTCTAGAATGACGATCAAGCCGCTGCG(SEQ ID NO.17)

UgpG-R:GAAGATCTTCAACCGAGCGCACGC(SEQ ID NO.18)

1.重組表達載體及重組菌株的構建

以UgpG-F和UgpG-R為引物,以鞘氨醇單胞菌基因組為模板擴增UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因ugpG片段,分別利用Xba I和Bgl II對該片段和pBBRtac3進行雙酶切,經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收,回收后的片段利用Takara的連接試劑盒進行連接,連接體系為:目的片段4μL,載體12μL,Solution I 16μL,16℃過夜連接。將連接產物轉化氯化鈣法制備 的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,冰浴30min,42℃水浴熱激90s,快速置于冰上1-3min。加入新鮮LB培養(yǎng)基800μL,于37℃振蕩培養(yǎng)45min。取200μL菌液涂布于含有終濃度為12.5μg/ml四環(huán)素的LB固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。挑取單菌落至含有四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩過夜培養(yǎng),根據(jù)天根質粒提取試劑盒操作說明提取質粒。以提取的質粒為模板,以UgpG-F和UgpG-R為引物進行PCR反應,同時,采用XbaI和BglII雙酶切的辦法對質粒加以鑒定。將鑒定正確的質粒送往上海生工生物公司測序,表明UgpG片段已經連接至該載體,所得的重組質粒命名為pBBRtac-UgpG。

將該質粒采用相同的方法轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,挑取四環(huán)素平板上的單菌落,得到UgpG的表達菌株。

2.UgpG蛋白的誘導表達

將獲得的表達菌株接種到10mL的LB培養(yǎng)基中活化后,轉接至50mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至OD600=0.6-0.8時,加入一定量的100mmol/L的IPTG使其終濃度為0.2mmol/L進行誘導,28℃誘導6h后停止培養(yǎng)。8,000rpm離心10min收集菌體,去離子水洗滌菌體兩次,并將菌體重新懸浮于pH 7.2的PBS緩沖液中,進行超聲破碎,超聲破碎程序設定為超聲2s、停5s,全程時間15min,功率<400。將破碎后的樣品8,000rpm離心25min,收集上清,進行SDS-PAGE分析。整個過程均以未轉化質粒的大腸桿菌BL21(DE3)宿主作為對照。

3.蛋白表達的SDS-PAGE

在20μL待檢測樣品中加入5μL的5×Loading Buffer,混勻,在100℃水浴中煮沸5min后離心,取上清進行SDS-PAGE電泳,采用12%的分離膠和5%的堆積膠。附圖2即SDS-PAGE分析結果,同對照相比,在37kDa處有顯著的條帶,大小與預期相符,應該為目的條帶,證明UgpG為可溶性表達。

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