本發(fā)明涉及生物技術(shù)和基因治療領(lǐng)域，具體而言，涉及一種溶瘤腺病毒，用于制備該腺病毒的載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

結(jié)直腸癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一。2015年，我國新診斷結(jié)直腸患者超過37萬例，死亡19萬余例，分別占所有惡性腫瘤的8.77％和6.79％。結(jié)直腸癌的治療原則為以手術(shù)為主的綜合治療，其中，完整結(jié)腸系膜切除術(shù)(CME)和完整直腸系膜切除術(shù)(TME)，已經(jīng)作為局部進(jìn)展期結(jié)直腸癌的規(guī)范化手術(shù)予以推薦。然而，晚期結(jié)直腸癌患者往往出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，包括遠(yuǎn)處淋巴結(jié)有、肝臟或其他臟器的轉(zhuǎn)移等，手術(shù)治療無法達(dá)到根治的目的。此時，化療、免疫治療等輔助手段，雖能在一定程度提升腫瘤患者的生活質(zhì)量和延緩腫瘤的發(fā)展，但是仍然無法提高腫瘤患者的長期存活率。因此，急需探索新的、更加有效的治療手段和方案。

近年來，免疫治療發(fā)展迅速，以PD-1抗體為代表的腫瘤免疫治療被《Science》評為2013年十大科學(xué)突破之首，免疫治療有望成為繼放療、化療、手術(shù)治療之外的第四大腫瘤治療手段。然而，以PD-1抗體為代表的腫瘤治療藥物，容易引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴等毒副作用，如何管控這些毒副作用依然是阻擋免疫治療發(fā)展的絆腳石。2015年10月，美國FDA批準(zhǔn)了攜帶粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimutaing factor，GM-CSF)的單純皰疹溶瘤病(T-VEC)上市，不僅為溶瘤病毒的發(fā)展注入了一支強(qiáng)心針，也為腫瘤免疫治療開辟了新的途徑。

溶瘤病毒可在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并裂解腫瘤細(xì)胞，釋放病毒，進(jìn)一步感染周圍的其他腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮級聯(lián)放大作用，最終達(dá)到消滅腫瘤的目的。目前，應(yīng)用最為廣泛的溶瘤病毒是溶瘤腺病毒。然而，單純應(yīng)用溶瘤腺病毒的療效往往受到多種因素的制約：(1)人體內(nèi)普遍存在5型腺病毒抗體，可清除溶瘤腺病毒溶瘤病毒；(2)啟動病毒復(fù)制的腫瘤特異性啟動子效率達(dá)不到預(yù)想等?；蛐揎検翘岣呷芰鱿俨《警熜У闹匾侄?，近年來，包括自殺基因、血管新生抑制基因、免疫基因等被應(yīng)用于溶瘤病毒介導(dǎo)的基因治療。溶瘤腺病毒作為免疫基因治療的載體，其優(yōu)勢是：(1)溶瘤病毒裂解腫瘤細(xì)胞釋放大量腫瘤抗原，可為特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)的激活提供物質(zhì)基礎(chǔ)；(2)溶瘤病毒發(fā)揮溶瘤功能，可以降低腫瘤負(fù)荷，為免疫基因功能發(fā)揮贏得時間。因此，將溶瘤腺病毒與基因治療，特別是免疫基因治療聯(lián)合應(yīng)用，已經(jīng)成為腫瘤免疫治療的熱點(diǎn)領(lǐng)域和方向。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了制備一種聯(lián)合decorin和GM-CSF蛋白表達(dá)的溶瘤腺病毒，并將其應(yīng)用于結(jié)腸癌的治療，為結(jié)腸癌的治療提供一種有效的免疫基因治療方案。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種溶瘤腺病毒重組載體，所述重組載體上同時攜帶有decorin基因表達(dá)框及GM-CSF基因表達(dá)框；

優(yōu)選的，所述表達(dá)框均插入在腺病毒基因組E1區(qū)中。

核心蛋白聚糖(decorin，DCN)作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成份，可以通過多種途徑抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，是重要的抑癌基因。臨床數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，DCN在乳腺癌、前列腺癌、腎癌等多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)。我們系統(tǒng)地分析了II/III期結(jié)腸癌患者腫瘤組織中DCN及其靶基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，DCN在結(jié)腸癌組織中表達(dá)下調(diào)；而DCN的重要靶基因，如Met、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)等，均表達(dá)上調(diào)。此外，DCN的相對表達(dá)水平與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移、預(yù)后等密切相關(guān)：轉(zhuǎn)移患者的DCN表達(dá)水平相對更低；回顧性分析結(jié)果提示，DCN表達(dá)水平低與腫瘤復(fù)發(fā)關(guān)系密切。已有研究報道，高表達(dá)DCN能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型中，溶瘤腺病毒介導(dǎo)的DCN高表達(dá)，能夠抑制骨轉(zhuǎn)移的發(fā)展、促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移的愈合。因此，作為連接腫瘤與腫瘤微環(huán)境的重要分子，DCN已經(jīng)成為腫瘤治療的重要靶標(biāo)。

DCN抑制腫瘤生長、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的主要的分子機(jī)制包括：(1)激活EGFR/MAPK/p21信號通路，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；(2)結(jié)合并滅活轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factorβ，TGFβ)，降低VEGF表達(dá)水平，進(jìn)而抑制腫瘤血管新生和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)。TGF-β也是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，可通過多種機(jī)制抑制腫瘤微環(huán)境的抗腫瘤免疫。研究證實(shí)，阻斷TGFβ信號，可抑制骨髓來源抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)和CD4⁺Foxp3⁺調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Regulatory T cells，Tregs)，促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞(Natural Killer cells，NK)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocytes,CTLs)的活性，增強(qiáng)干擾素γ(Interferonγ，IFNγ)的表達(dá)及分泌，進(jìn)而激活抗腫瘤免疫反應(yīng)。在理論上，作為TGFβ的抑制分子，decorin必然具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，促進(jìn)抗腫瘤免疫的形成。然而，對于decorin在結(jié)腸癌中的免疫調(diào)節(jié)作用尚無明確報道。

作為多功能的細(xì)胞因子，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimutaing factor，GM-CSF)，可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)、巨噬細(xì)胞的成熟和分化，目前已被廣泛應(yīng)用于腫瘤的免疫與基因治療中。研究證實(shí)，攜帶GM-CSF的溶瘤病毒局部給藥，可調(diào)節(jié)腫瘤局部和機(jī)體的免疫狀態(tài)，促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。2015年10月，美國FDA批準(zhǔn)了攜帶GM-CSF的單純皰疹溶瘤病毒(T-VEC)進(jìn)入市場，成為免疫基因治療的重要里程碑。

綜上所述，目前對于結(jié)腸癌，特別是晚期和轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者仍然缺乏有效的治療手段。Decorin與GM-CSF聯(lián)合溶瘤腺病毒應(yīng)用于腫瘤治療，可集合溶瘤病毒治療、靶向治療、基因治療和免疫治療的優(yōu)勢，有效干預(yù)腫瘤微環(huán)境和機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，有望為結(jié)腸癌的治療提供一種更加有效的免疫基因治療方案。

本發(fā)明證實(shí)，攜帶decorin和GM-CSF的溶瘤腺病毒，能夠有效殺傷腫瘤細(xì)胞，并實(shí)現(xiàn)腫瘤局部目的基因的高效表達(dá)；同時，腫瘤細(xì)胞裂解釋放的大量腫瘤抗原，在GM-CSF協(xié)助下，有效激活機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

優(yōu)選的，如上所述的溶瘤腺病毒重組載體，所述decorin基因表達(dá)框由CMV啟動子和decorin蛋白開放讀碼框序列組成。

優(yōu)選的，如上所述的溶瘤腺病毒重組載體，所述重組載體上還包含腺病毒復(fù)制調(diào)控基因序列；

所述腺病毒復(fù)制調(diào)控基因序列包括端粒酶啟動子TERTp、腺病毒E1區(qū)復(fù)制起始基因E1A和E1B55K；

更優(yōu)選的，從序列的5’至3’方向?yàn)椋篸ecorin基因表達(dá)框-腺病毒復(fù)制調(diào)控基因序列-GM-CSF基因表達(dá)框；

優(yōu)選的，如上所述的溶瘤腺病毒重組載體，所述E1A由端粒酶啟動子TERTp調(diào)控，所述E1B55K由天然E1B啟動子調(diào)控；

更優(yōu)選的，從序列5’至3’方向?yàn)椋憾肆Ｃ竼幼覶ERTp-腺病毒E1A基因-天然E1B啟動子-E1B55K；

優(yōu)選的，如上所述的溶瘤腺病毒重組載體，所述GM-CSF基因表達(dá)框位于所述天然E1B啟動子下游，由核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)IRES連接GM-CSF和E1B55K，實(shí)現(xiàn)共同表達(dá)；

Internal ribosome entry site,IRES。IRES能招募核糖體對mRNA進(jìn)行翻譯。

優(yōu)選的，從序列的5’至3’方向?yàn)椋禾烊籈1B啟動子-GM-CSF基因表達(dá)框-IRES序列-E1B55K。

如上所述的溶瘤腺病毒重組載體的構(gòu)建方法，包括：

1)、將decorin基因表達(dá)框序列插入到穿梭載體中得到第一重組穿梭載體；

2)、從TE-TP-E1A-GM-55K載體上酶切得到包含GM-CSF基因表達(dá)框的核酸片段，并將其定向克隆至步驟1)得到的第一重組穿梭載體中，得到第二重組穿梭載體；

3)、將所述第二重組穿梭載體與復(fù)制缺陷型病毒載體同源重組，得到如上所述的溶瘤腺病毒重組載體。

TE-TP-E1A-GM-55K載體為現(xiàn)有載體，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)Cancer Gene Ther.2008Mar；15(3):173-82.Epub 2007Dec 21.A simplified system for generating oncolytic adenovirus vector carrying one or two transgenes.文章中記載的相關(guān)內(nèi)容自行構(gòu)建該載體，此處不做贅述。

優(yōu)選的，如上所述的溶瘤腺病毒重組載體的構(gòu)建方法，所述穿梭載體為pShuttle-CMV。

優(yōu)選的，如上所述的溶瘤腺病毒重組載體的構(gòu)建方法，所述復(fù)制缺陷型病毒載體為pAdEasy。

一種溶瘤腺病毒，其如上所述的溶瘤腺病毒重組載體線性化后轉(zhuǎn)染至病毒包裝細(xì)胞中進(jìn)行包裝、擴(kuò)增、純化后獲得；

優(yōu)選的，所述腺病毒包裝細(xì)胞為HEK293細(xì)胞。

如上所述的溶瘤腺病毒重組載體及權(quán)利要求如上所述的溶瘤腺病毒在制備用于治療結(jié)腸癌的藥物中的應(yīng)用。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

附圖1溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM和對照病毒的構(gòu)建；

A，溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM、rAd.DCN、rAd.GM、rAd.Null和復(fù)制缺陷型腺病毒Ad.Null和Ad.DCN的基因組結(jié)構(gòu)示意圖；B，pShuttle-CMV-DCN的BglII和XhoI酶切鑒定結(jié)果：M為λ-HindIII Marker，C1為pShuttle-CMV載體的酶切產(chǎn)物，C2為DCN基因，1-8為pShuttle-CMV-DCN的1-8號克?。籆，重組腺病毒載體PacI酶切鑒定結(jié)果：M1為DL2000Marker；M2為λ-HindIII Marker；C1為pShuttle-CMV-DCN酶切產(chǎn)物，1為pAd.DCN.GM.RE酶切產(chǎn)物，2為pAd.DCN.RE酶切產(chǎn)物；

附圖2磺酰羅丹明B比色法測定溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM對結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、SW620和CT26的殺傷作用；

附圖3溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的復(fù)制能力檢測結(jié)果；

附圖4 ELISA檢測溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM介導(dǎo)DCN蛋白表達(dá)的能力；

附圖5溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM及對照病毒治療小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26移植瘤的療效評價：A為腫瘤生長曲線；B為治療后第22天(Day29)剝離腫瘤的體重與Buffer組相比，***，p<0.001,**,p<0.01；與rAd.Null組相比，##，p<0.01；

附圖6溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM治療后5天，腫瘤組織中DCN及其靶基因Met、β-catenin和VEGF表達(dá)的real-time檢測結(jié)果*,與rAd.Null組相比，p<0.05；

附圖7溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM治療后5天，外周血中CD4⁺T淋巴細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞的比例與Buffer組相比，*,p<0.05，**，p<0.01；

附圖8溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM治療后5天，脾臟細(xì)胞中書突狀細(xì)胞(DCs)與骨髓來源抑制細(xì)胞(MDSCs)的比例；

附圖9溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM治療后5天，脾臟中細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ和TGF-β表達(dá)的real-time檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中，本發(fā)明采用AdEasy系統(tǒng)，將“端粒酶啟動子TERTp調(diào)控E1A的表達(dá)框，E1B啟動子調(diào)控GM-CSF和E1B-55KDa的表達(dá)框，及cmv啟動子調(diào)控decorin的表達(dá)框”構(gòu)建到穿梭質(zhì)粒。采用限制性內(nèi)切酶PmeI將其線性化并去磷酸化，并于BJ5183菌株中與骨架質(zhì)粒AdEasy-1同源重組。得到的重組腺病毒質(zhì)粒，經(jīng)PacI線性化后，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，包裝得到溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM。并在人結(jié)腸癌細(xì)胞、小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞中鑒定目的基因sTGFβRIIFc的表達(dá)；在體外證實(shí)了rAd.DCN.GM對結(jié)腸癌細(xì)胞的溶瘤作用；在小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26移植瘤模型中明確其治療效果和機(jī)制。

在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明采用的方法具體為：

1、溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM的構(gòu)建與制備：

采用本實(shí)驗(yàn)建立的“一種簡單的能夠攜帶1-2個基因的溶瘤腺病毒制備體系”，構(gòu)建并制備溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM。具體為：從本實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒載體TE-TP-E1A-GM-55K中，通過酶切方式，獲得“由端粒酶啟動子TERTp啟動腺病毒復(fù)制必需基因E1A表達(dá)，由E1B啟動子啟動GM-CSF和E1B55K表達(dá)”的序列TERTp-E1A-E1Bp-GM-IRES-E1B55K，并克隆到攜帶DCN基因的穿梭質(zhì)粒上；最后，采用AdEasy系統(tǒng)制備重組腺病毒載體pAd.DCN.GM。并于HEK293細(xì)胞中包裝獲得重組腺病毒rAd.DCN.GM。

此外，在更優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，為了進(jìn)行功能和機(jī)制研究，還制備了多種對照病毒：(1)rAd.Null，具有溶瘤功能，不攜帶目的基因的對照病毒；(2)rAd.DCN，僅攜帶DCN基因的溶瘤腺病毒；(3)rAd.GM，僅攜帶GM-CSF的基因溶瘤腺病毒；(4)Ad.Null，不攜帶目的基因的復(fù)制缺陷性腺病毒；(5)Ad.DCN，攜帶DCN基因的復(fù)制缺陷性腺病毒。

2、溶瘤腺病毒介導(dǎo)的目的基因表達(dá)和溶瘤功能評價；

為明確目的基因在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及其效率，采用溶瘤腺病毒和對照病毒感染結(jié)腸癌細(xì)胞48h后，采用Western-blotting和ELISA檢測目的基因DCN和GM-CSF的表達(dá)水平。

為檢測病毒復(fù)制和殺傷效應(yīng)，采用不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)的溶瘤腺病毒感染結(jié)腸癌細(xì)胞，采用SRB檢測病毒對不同結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷效率；采用病毒擴(kuò)增法，檢測溶瘤病毒的復(fù)制能力。

3、溶瘤腺病毒體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)評價

為評價小鼠體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)，建立了小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞的小鼠移植瘤模型，通過瘤內(nèi)給藥方式進(jìn)行治療后，觀察溶瘤腺病毒對移植瘤生長的抑制作用，明確其治療效果。

4、溶瘤腺病毒體內(nèi)抗腫瘤機(jī)制研究

為明確溶瘤病毒的體內(nèi)抗腫瘤機(jī)制，檢測了腫瘤局部DCN及其相關(guān)靶基因表達(dá)水平，檢測脾臟及腫瘤局部炎癥因子表達(dá)水平、免疫細(xì)胞表型等，初步闡明了其作用機(jī)制。

本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于有效集合溶瘤腺病毒、靶向治療、基因治療和免疫治療的優(yōu)勢，聯(lián)合發(fā)揮decorin對腫瘤微環(huán)境和免疫調(diào)控作用、GM-CSF對DC和巨噬細(xì)胞的活化作用、以及溶瘤病毒的溶瘤及免疫激活效應(yīng)。

具體為，(1)溶瘤病毒裂解腫瘤細(xì)胞，減輕腫瘤負(fù)荷，為目的基因功能發(fā)揮贏得時間，為免疫激活贏得“時間可能”；同時，腫瘤細(xì)胞裂解釋放的大量腫瘤抗原利于抗腫瘤免疫反應(yīng)的激活。(2)Decorin通過多種途徑下調(diào)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移；同時，調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，改善腫瘤局部免疫抑制狀態(tài)，募集免疫細(xì)胞，為抗腫瘤免疫激活創(chuàng)造“空間可能”。(3)GM-CSF可促進(jìn)腫瘤局部DCs和巨噬細(xì)胞的成熟和分化，有利于形成強(qiáng)效的腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，從而最終清除腫瘤。

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1重組腺病毒rAd.DCN的構(gòu)建與制備

其方法是合成是人DCN基因，將其插入到pShuttle-CMV載體中，獲得pShuttle-CMV-DCN；MfeI酶切由本實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒載體TE-TP-E1A-GM-55K，獲取含有復(fù)制相關(guān)基因、GM-CSF的基因片段——TERTp-E1A-E1Bp-GM-IRES-E1B55K，并將其正向克隆到pShuttle-CMV-DCN的相應(yīng)位點(diǎn)，獲得穿梭質(zhì)粒pSh.cmv.DCN.GM.RE；參照AdEasy系統(tǒng)，獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd.DCN.GM.RE；并于HEK293細(xì)胞制備獲得溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM。具體為：

(1)pShuttle-CMV-DCN的構(gòu)建

通過基因合成技術(shù)，合成人DCN基因的全序列，并在上下游分別加入BglII和XhoI的酶切位點(diǎn)，將其酶切后，連接到pShuttle-CMV的相應(yīng)位點(diǎn)，獲得攜帶目的基因的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-DCN。

(2)pShuttle-CMV-DCN-GM-RE的構(gòu)建

質(zhì)粒TE-TP-E1A-GM-55K，含有TERTp啟動子啟動E1A表達(dá)、E1B啟動子調(diào)控GM-CSF和E1B55K表達(dá)兩個表達(dá)框，其中，GM-CSF編碼區(qū)和E1B55K編碼區(qū)之間通過核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry sites，IRES)連接。MfeI酶切TE-TP-E1A-GM-55K，獲得此部分序列TERTp-E1A-E1Bp-GM-IRES-E1B55K，然后將其正向克隆到pShuttle-CMV-DCN的相應(yīng)位點(diǎn)(MfeI)，獲得含有全部目的序列的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-DCN-GM-RE(如SEQ ID NO：1所示)。

(3)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM的制備

參照AdEasy系統(tǒng)制備重組腺病毒質(zhì)粒：PmeI酶切穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-DCN-GM-RE,電轉(zhuǎn)BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，與AdEasy-1同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd.DCN.GM.RE。PacI酶切重組腺病毒質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，制備獲得溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM(附圖1所示)。鑒定正確后，進(jìn)行擴(kuò)增、純化和滴度測定；結(jié)果顯示，病毒滴度和純度均符合要求(表1所示)。

(4)對照病毒的構(gòu)建和制備

按照溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM構(gòu)建、制備流程，采用pShuttle-CMV替換pSh.cmv.DCN，構(gòu)建和制備僅攜帶GM-CSF基因的溶瘤腺病毒rAd.GM；采用TE-TP-E1A(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存)替換TE-TP-E1A-GM-55K，構(gòu)建和制備僅攜帶DCN基因的溶瘤腺病毒rAd.DCN；同時采用pShuttle-CMV和TE-TP-E1A制備不攜帶目的基因的對照溶瘤病毒rAd.Null。同時，采用AdEasy系統(tǒng)，制備復(fù)制缺陷型對照病毒Ad.DCN和Ad.Null。對照病毒經(jīng)鑒定正確后，進(jìn)行擴(kuò)增、純化和滴度測定；結(jié)果顯示，病毒滴度和純度均符合要求(表1所示)。

表1病毒滴度、純度檢測結(jié)果

實(shí)施例2溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM體外功能驗(yàn)證

其方法是，在結(jié)腸癌細(xì)胞中，采用磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色法，檢測溶瘤病毒的殺傷效應(yīng)；通過Adeno-X Rapid Titer Kit測定從感染后3h到48h，溶瘤病毒在結(jié)腸癌細(xì)胞中的擴(kuò)增倍數(shù)，明確病毒的復(fù)制能力；通過Western-blotting和ELISA檢測目的基因DCN和GM-CSF在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)。具體為：

(1)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM的殺傷能力檢測

將人腎癌癌細(xì)胞系SW620、SW480和小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系CT26，分別以1×103細(xì)胞/100μl培養(yǎng)基/孔接種96孔板。第二天，溶瘤腺病毒rAd.DCN,對照溶瘤病毒rAd.GM、rAd.DCN、rAd.Null，和復(fù)制缺陷性對照病毒Ad.Null和Ad.DCN，分別以5倍梯度稀釋的方式感染細(xì)胞(1.25×106Vps/細(xì)胞-80Vps/細(xì)胞)。第七天(感染后第六天)，采用SRB染色檢測每孔中細(xì)胞的存活率，明確溶瘤腺病毒的細(xì)胞殺傷作用。計(jì)算方法為：細(xì)胞存活率＝相應(yīng)感染滴度下的OD值/對照孔的OD值。結(jié)果顯示，溶瘤病毒不但能夠有效地殺傷人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620和SW480，還能殺傷小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26(如附圖2所示)。

(2)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM的復(fù)制能力檢測

接下來，我們進(jìn)一步明確了溶瘤病毒在結(jié)腸癌細(xì)胞中的復(fù)制能力。具體為：將25000VPs/細(xì)胞的溶瘤病毒rAd.DCN和對照病毒感染結(jié)腸癌細(xì)胞SW620、SW480和CT26；于感染后3h，PBS洗滌細(xì)胞去除病毒；洗滌后即刻和48h，收集細(xì)胞和上清，反復(fù)凍融后，將其感染24孔板中的HEK293細(xì)胞(提前一天按照1×105細(xì)胞/孔接種)。

48h后，采用Adeno-X Rapid Titer Kit進(jìn)行染色并計(jì)算病毒滴度，明確病毒擴(kuò)增倍數(shù)。結(jié)果顯示，與復(fù)制缺陷型腺病毒相比，溶瘤病毒rAd.DCN.GM、rAd.GM、rAd.DCN和rAd.Null均能在人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620和SW480中有效復(fù)制；而在小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26中卻無明顯復(fù)制能力(如附圖3所示)。

(3)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM可在結(jié)腸癌細(xì)胞中高效表達(dá)目的基因DCN和GM-CSF

采用25000VPs/細(xì)胞的溶瘤病毒rAd.DCN.GM和對照病毒感染結(jié)腸癌細(xì)胞細(xì)胞SW620、SW480和CT26后，孵育16h后，將細(xì)胞培養(yǎng)基替換為無血清培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24h-32h，分別收集上清和細(xì)胞，采用ELISA分別檢測目的基因DCN和GM-CSF的表達(dá)。結(jié)果顯示，無論復(fù)制缺陷型腺病毒Ad.DCN，還是溶瘤腺病毒rAd.DCN和rAd.DCN.GM均能在結(jié)腸癌細(xì)胞中高效地表達(dá)治療基因DCN；而rAd.GM和rAd.DCN.GM能夠表達(dá)治療基因GM-CSF(如附圖4所示)。

實(shí)施例3溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM治療小鼠結(jié)腸癌移植瘤的療效評價

其方法是，采用小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26建立小鼠移植瘤模型，通過瘤內(nèi)給予溶瘤病毒的方式進(jìn)行治療，通過對其生長情況的監(jiān)測，評價溶瘤病毒對小鼠腎癌移植瘤的治療作用。具體為：

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26，以單細(xì)胞懸液(2×106細(xì)胞/小鼠)皮下荷瘤6-8周的Babl/c小鼠，觀察腫瘤的生長情況，于荷瘤后8d，檢測腫瘤的體積，并按照體積進(jìn)行分層隨機(jī)分組，劃分為Buffer組、rAd.Null組、rAd.DCN組、rAd.GM組和rAd.DC.GM組。并以未荷瘤小鼠作為正常對照，來評價其免疫指標(biāo)。

荷瘤后第7天，溶瘤腺病毒以2.5×1010VPs/100μl的劑量，瘤內(nèi)注射進(jìn)行治療；第10天，相同劑量溶瘤腺病毒再次給藥。治療后，監(jiān)測小鼠健康狀況、小鼠體重、腫瘤生長曲線等。

待任意一組小鼠的腫瘤出現(xiàn)破潰或者體積大于2000mm3時，終止實(shí)驗(yàn)。處死小鼠后，檢測腫瘤的體重。結(jié)果顯示，與Buffer組和rAd.Null組相比，攜帶目的基因的溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM、rAd.GM和rAd.DCN均能有效抑制腫瘤的生長(p<0.05)(如附圖5所示)。

實(shí)施例4溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM治療小鼠結(jié)腸癌移植瘤的機(jī)制研究

為進(jìn)一步明確rAd.DCN.GM治療結(jié)腸癌的機(jī)制，分別檢測腫瘤組織中DCN相關(guān)靶基因的表達(dá)水平、EMT水平以及炎癥因子的表達(dá)水平；檢測血液和脾臟中T淋巴細(xì)胞亞型、骨髓來源抑制細(xì)胞(Bone marrow derived suppressor cells,MDSCs)/細(xì)胞因子的表達(dá)等，明確rAd.DCN.GM對機(jī)體抗腫瘤免疫的調(diào)節(jié)作用。具體為：

(1)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM對DCN靶基因和轉(zhuǎn)移相關(guān)分子表達(dá)的影響

荷瘤后第12d(第一次給藥后第5d)和第29天，分別處死小鼠，分離小鼠腫瘤組織，提取RNA。檢測DCN及其重要靶基因Met、β-catenin和VEGF的表達(dá)水平；檢測EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，rAd.dcn和rAd.dcn.GM均能高效介導(dǎo)目的基因DCN在腫瘤局部的表達(dá)；同時，可檢測到DCN的重要靶基因Met、β-catenin和VEGF均表達(dá)下調(diào)(如附圖6所示)。上述結(jié)果提示，rAd.DCN.GM可通過高表達(dá)DCN，抑制結(jié)腸癌抑制瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。

(2)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM對機(jī)體抗腫瘤免疫的調(diào)控作用

溶瘤腺病毒可以裂解腫瘤細(xì)胞，釋放大量腫瘤抗原，為機(jī)體免疫激活提供基礎(chǔ)；而GM-CSF是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，對于機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的激活具有重要意義。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)溶瘤病毒治療可以通過調(diào)節(jié)CD4⁺T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的比例，促進(jìn)細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放(如附圖7所示)。與單純的溶瘤腺病毒相比，攜帶DCN和GM-CSF的溶瘤腺病毒具有更強(qiáng)的免疫激活效應(yīng)：例如，攜帶DCN的溶瘤腺病毒能夠有效降低脾臟細(xì)胞中MDSCs的數(shù)量和比例；而攜帶GM-CSF的溶瘤腺病毒則能夠明顯提升脾臟中DC細(xì)胞的數(shù)量和比例。此外，聯(lián)合應(yīng)用DCN和GM-CSF獲得的溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM則能夠同時發(fā)揮DCN和GM-CSF對機(jī)體免疫的調(diào)節(jié)作用(如附圖8所示)。

此外，對于細(xì)胞因子的檢測結(jié)果顯示，攜帶GM-CSF的溶瘤腺病毒可以誘導(dǎo)TH1型細(xì)胞因子，例如IL-2、IL-12、IFN-γ的表達(dá)；而攜帶DCN的溶瘤腺病毒則可降低TH2型細(xì)胞因子，如IL-6、TGF-β的表達(dá)水平。而rAd.DCN.GM則可以同時調(diào)控TH1型細(xì)胞因子和TH2型細(xì)胞因子，有望最大程度激活機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)(如附圖9所示)。

綜上所述，我們成功構(gòu)建了由端粒酶啟動子調(diào)控溶瘤(TERTp啟動E1A表達(dá))、由E1B啟動子(E1Bp)調(diào)控GM-CSF和E1B55K表達(dá)、由cmv啟動子調(diào)控DCN蛋白表達(dá)的溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM。體外結(jié)果證實(shí)，該溶瘤腺病毒能夠在體外人結(jié)腸癌癌細(xì)胞系中大量復(fù)制并殺傷細(xì)胞；能夠?qū)崿F(xiàn)目的基因在結(jié)腸癌細(xì)胞中的高效表達(dá)。在小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26的小鼠移植瘤模型中，rAd.DCN.GM不但能夠有效抑制腫瘤的生長，降低腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的表達(dá)水平；還能夠激活機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。其中，DCN和GM-CSF能夠發(fā)揮各自的免疫調(diào)節(jié)作用，從不同角度協(xié)同產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，該溶瘤腺病毒有望成為結(jié)腸癌晚期或轉(zhuǎn)移患者治療的重要候選藥物，成為手術(shù)治療、放療、化療和免疫治療的重要補(bǔ)充。

盡管已用具體實(shí)施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。

<110> 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所；北京知光醫(yī)學(xué)科技股份有限公司

<120> 溶瘤腺病毒，用于制備該腺病毒的載體及其應(yīng)用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 13033

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60

ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120

gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180

gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240

taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300

agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tactgtaata gtaatcaatt 360

acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 420

ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 480

cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 540

actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 600

aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 660

acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag 720

tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt 780

gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac 840

aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc 900

agagctggtt tagtgaaccg tcagatccgc tagagatcta tgaaggccac tatcatcctc 960

cttctgcttg cacaagtttc ctgggctgga ccgtttcaac agagaggctt atttgacttt 1020

atgctagaag atgaggcttc tgggataggc ccagaagttc ctgatgaccg cgacttcgag 1080

ccctccctag gcccagtgtg ccccttccgc tgtcaatgcc atcttcgagt ggtccagtgt 1140

tctgatttgg gtctggacaa agtgccaaag gatcttcccc ctgacacaac tctgctagac 1200

ctgcaaaaca acaaaataac cgaaatcaaa gatggagact ttaagaacct gaagaacctt 1260

cacgcattga ttcttgtcaa caataaaatt agcaaagtta gtcctggagc atttacacct 1320

ttggtgaagt tggaacgact ttatctgtcc aagaatcagc tgaaggaatt gccagaaaaa 1380

atgcccaaaa ctcttcagga gctgcgtgcc catgagaatg agatcaccaa agtgcgaaaa 1440

gttactttca atggactgaa ccagatgatt gtcatagaac tgggcaccaa tccgctgaag 1500

agctcaggaa ttgaaaatgg ggctttccag ggaatgaaga agctctccta catccgcatt 1560

gctgatacca atatcaccag cattcctcaa ggtcttcctc cttcccttac ggaattacat 1620

cttgatggca acaaaatcag cagagttgat gcagctagcc tgaaaggact gaataatttg 1680

gctaagttgg gattgagttt caacagcatc tctgctgttg acaatggctc tctggccaac 1740

acgcctcatc tgagggagct tcacttggac aacaacaagc ttaccagagt acctggtggg 1800

ctggcagagc ataagtacat ccaggttgtc taccttcata acaacaatat ctctgtagtt 1860

ggatcaagtg acttctgccc acctggacac aacaccaaaa aggcttctta ttcgggtgtg 1920

agtcttttca gcaacccggt ccagtactgg gagatacagc catccacctt cagatgtgtc 1980

tacgtgcgct ctgccattca actcggaaac tataagtaac tcgagcctaa gcttctagat 2040

aagatatccg atccaccgga tctagataac tgatcataat cagccatacc acatttgtag 2100

aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga 2160

atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 2220

gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 2280

aactcatcaa tgtatcttaa cgcgcggccg ctggcccctc cctcgggtta ccccacagct 2340

taggccgatt cgacctctct ccgctggggc cctcgctggc gtccctgcac cctgggagcg 2400

cgagcggcgc gcgggcgggg aagcgcggcc cagacccccg ggtccgcccg gagcagctgc 2460

gctgtcgggg ccaggccggg ctcccagtgg attcgcgggc acagacgccc aggaccgcgc 2520

ttcccacgtg gcggagggac tggggacccg ggcacccgtc ctgccccttc accttccagc 2580

tccgcctcct ccgcgcggac cccgccccgt cccgacccct cccgggtccc cggcccagcc 2640

ccctccgggc cctcccagcc cctccccttc ctttccgcgg ccccgccctc tcctcgcggc 2700

gcgagtttca ggcagcgctg cgtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc 2760

cccgcggaat tcatgagaca tattatctgc cacggaggtg ttattaccga agaaatggcc 2820

gccagtcttt tggaccagct gatcgaagag gtactggctg ataatcttcc acctcctagc 2880

cattttgaac cacctaccct tcacgaactg tatgatttag acgtgacggc ccccgaagat 2940

cccaacgagg aggcggtttc gcagattttt cccgactctg taatgttggc ggtgcaggaa 3000

gggattgact tactcacttt tccgccggcg cccggttctc cggagccgcc tcacctttcc 3060

cggcagcccg agcagccgga gcagagagcc ttgggtccgg tttctatgcc aaaccttgta 3120

ccggaggtga tcgatcttac ctgccacgag gctggctttc cacccagtga cgacgaggat 3180

gaagagggtg aggagtttgt gttagattat gtggagcacc ccgggcacgg ttgcaggtct 3240

tgtcattatc accggaggaa tacgggggac ccagatatta tgtgttcgct ttgctatatg 3300

aggacctgtg gcatgtttgt ctacagtaag tgaaaattat gggcagtggg tgatagagtg 3360

gtgggtttgg tgtggtaatt ttttttttaa tttttacagt tttgtggttt aaagaatttt 3420

gtattgtgat ttttttaaaa ggtcctgtgt ctgaacctga gcctgagccc gagccagaac 3480

cggagcctgc aagacctacc cgccgtccta aaatggcgcc tgctatcctg agacgcccga 3540

catcacctgt gtctagagaa tgcaatagta gtacggatag ctgtgactcc ggtccttcta 3600

acacacctcc tgagatacac ccggtggtcc cgctgtgccc cattaaacca gttgccgtga 3660

gagttggtgg gcgtcgccag gctgtggaat gtatcgagga cttgcttaac gagcctgggc 3720

aacctttgga cttgagctgt aaacgcccca ggccataagg tgtaaacctg tgattgcgtg 3780

tgtggttaac gcctttgttt gctgaatgag ttgatgtaag tttaataaag ggtgagataa 3840

tgtttaactt gcatggcgtg ttaaatgggg cggggcttaa agggtatata atgcgccgtg 3900

ggctaatctt ggttacatct gacctcacta gtatgtggct gcagagcctg ctgctcttgg 3960

gcactgtggc ctgcagcatc tctgcacccg cccgctcgcc cagccccagc acgcagccct 4020

gggagcatgt gaatgccatc caggaggccc ggcgtctcct gaacctgagt agagacactg 4080

ctgctgagat gaatgaaaca gtagaagtca tctcagaaat gtttgacctc caggagccga 4140

cctgcctaca gacccgcctg gagctgtaca agcagggcct gcggggcagc ctcaccaagc 4200

tcaagggccc cttgaccatg atggccagcc actacaagca gcactgccct ccaaccccgg 4260

aaacttcctg tgcaacccag attatcacct ttgaaagttt caaagagaac ctgaaggact 4320

ttctgcttgt catccccttt gactgctggg agccagtcca ggagtgagtc gacgaattaa 4380

ttcgctgtct gcgagggcca gctgttgggg tgagtactcc ctctcaaaag cgggcatgac 4440

ttctgcgcta agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat ttgatattca cctggcccgc 4500

ggtgatgcct ttgagggtgg ccgcgtccat ctggtcagaa aagacaatct ttttgttgtc 4560

aagcttgagg tgtggcaggc ttgagatctg gccatacact tgagtgacaa tgacatccac 4620

tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc caggtccaac tgcaggtcga gcatgcatct 4680

agggcggcca attccgcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct 4740

tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgtgattttc caccatattg ccgtcttttg 4800

gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt 4860

cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg 4920

aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac 4980

ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg 5040

cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct 5100

caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg 5160

atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aaacgtctag 5220

gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa gcttgccaca 5280

actcgacgag ttttataaag gataaatgga gcgaagaaac ccatctgagc ggggggtacc 5340

tgctggattt tctggccatg catctgtgga gagcggttgt gagacacaag aatcgcctgc 5400

tactgttgtc ttccgtccgc ccggcgataa taccgacgga ggagcagcag cagcagcagg 5460

aggaagccag gcggcggcgg caggagcaga gcccatggaa cccgagagcc ggcctggacc 5520

ctcgggaatg aatgttgtac aggtggctga actgtatcca gaactgagac gcattttgac 5580

aattacagag gatgggcagg ggctaaaggg ggtaaagagg gagcgggggg cttgtgaggc 5640

tacagaggag gctaggaatc tagcttttag cttaatgacc agacaccgtc ctgagtgtat 5700

tacttttcaa cagatcaagg ataattgcgc taatgagctt gatctgctgg cgcagaagta 5760

ttccatagag cagctgacca cttactggct gcagccaggg gatgattttg aggaggctat 5820

tagggtatat gcaaaggtgg cacttaggcc agattgcaag tacaagatca gcaaacttgt 5880

aaatatcagg aattgttgct acatttctgg gaacggggcc gaggtggaga tagatacgga 5940

ggatagggtg gcctttagat gtagcatgat aaatatgtgg ccgggggtgc ttggcatgga 6000

cggggtggtt attatgaatg taaggtttac tggccccaat tttagcggta cggttttcct 6060

ggccaatacc aaccttatcc tacacggtgt aagcttctat gggtttaaca atacctgtgt 6120

ggaagcctgg accgatgtaa gggttcgggg ctgtgccttt tactgctgct ggaagggggt 6180

ggtgtgtcgc cccaaaagca gggcttcaat taagaaatgc ctctttgaaa ggtgtacctt 6240

gggtatcctg tctgagggta actccagggt gcgccacaat gtggcctccg actgtggttg 6300

cttcatgcta gtgaaaagcg tggctgtgat taagcataac atggtatgtg gcaactgcga 6360

ggacagggcc tctcagatgc tgacctgctc ggacggcaac tgtcacctgc tgaagaccat 6420

tcacgtagcc agccactctc gcaaggcctg gccagtgttt gagcataaca tactgacccg 6480

ctgttccttg catttgggta acaggagggg ggtgttccta ccttaccaat gcaatttgag 6540

tcacactaag atattgcttg agcccgagag catgtccaag gtgaacctga acggggtgtt 6600

tgacatgacc atgaagatct ggaaggtgct gaggtacgat gagacccgca ccaggtgcag 6660

accctgcgag tgtggcggta aacatattag gaaccagcct gtgatgctgg atgtgaccga 6720

ggagctgagg cccgatcact tggtgctggc ctgcacccgc gctgagtttg gctctagcga 6780

tgaagataca gattgaggta ctgaaatgtg tgggcgtggc ttaagggtgg gaaagaatat 6840

ataaggtggg ggtcttatgt agttttgtat ctgttttgca gcagccgccg ccgccatgag 6900

caccaactcg tttgatggaa gcattgtgag ctcatatttg acaacgcgca tgcccccatg 6960

ggccggggtg cgtcagaatg tgatgggctc cagcattgat ggtcgccccg tcctgcccgc 7020

aaactctact accttgacct acgagaccgt gtctggaacg ccgttggaga ctgcagcctc 7080

cgccgccgct tcagccgctg cagccaccgc ccgcgggatt gtgactgact ttgctttcct 7140

gagcccgctt gcaagcagtg cagcttcccg ttcatccgcc cgcgatgaca agttgacggc 7200

tcttttggca caattggatt ctttgacccg ggaacttaat gtcgtttctc agcagctgtt 7260

ggatctgcgc cagcaggttt ctgccctgaa ggcttcctcc cctcccaatg cggtttaaaa 7320

cataaataaa aaaccagact ctgtttggat ttggatcaag caagtgtctt gctgtcttta 7380

tttaggggtt ttgcgcgcgc ggtaggcccg ggaccagcgg tctcggtcgt tgagggtcct 7440

gtgtattttt tccaggacgt ggtaaaggtg actctggatg ttcagataca tgggcataag 7500

cccgtctctg gggtggaggt agcaccactg cagagcttca tgctgcgggg tggtgttgta 7560

gatgatccag tcgtagcagg agcgctgggc gtggtgccta aaaatgtctt tcagtagcaa 7620

gctgattgcc aggggcaggc ccttggtgta agtgtttaca aagcggttaa gctgggatgg 7680

gtgcatacgt ggggatatga gatgcatctt ggactgtatt tttaggttgg ctatgttccc 7740

agccatatcc ctccggggat tcatgttgtg cagaaccacc agcacagtgt atccggtgca 7800

cttgggaaat ttgtcatgta gcttagaagg aaatgcgtgg aagaacttgg agacgccctt 7860

gtgacctcca agattttcca tgcattcgtc cataatgatg gcaatgggcc cacgggcggc 7920

ggcctgggcg aagatatttc tgggatcact aacgtcatag ttgtgttcca ggatgagatc 7980

gtcataggcc atttttacaa agcgcgggcg gagggtgcca gactgcggta taatggttcc 8040

atccggccca ggggcgtagt taccctcaca gatttgcatt tcccacgctt tgagttcaga 8100

tggggggatc atgtctacct gcggggcgat gaagaaaacg gtttccgggg taggggagat 8160

cagctgggaa gaaagcaggt tcctgagcag ctgcgactta ccgcagccgg tgggcccgta 8220

aatcacacct attaccggct gcaactggta gttaagagag ctgcagctgc cgtcatccct 8280

gagcaggggg gccacttcgt taagcatgtc cctgactcgc atgttttccc tgaccaaatc 8340

cgccagaagg cgctcgccgc ccagcgatag cagttcttgc aaggaagcaa agtttttcaa 8400

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gctccgggct gcgcgctggc cagggtgcgc ttgaggctgg tcctgctggt gctgaagcgc 8700

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