本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種藥物篩選細(xì)胞模型，具體涉及一種靶向HBC二聚體形成的藥物篩選細(xì)胞模型及其構(gòu)建和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，其涉及范圍廣泛，全球有近4億慢性感染患者，而慢性HBV感染可以導(dǎo)致肝硬化、肝細(xì)胞癌等嚴(yán)重后果，每年因此死亡者近百萬。HBV為直徑42nm的球形顆粒，呈雙層殼結(jié)構(gòu)，外殼主要由三種表面蛋白(HBs)構(gòu)成，內(nèi)層核衣殼由核心蛋白(HBC)組成，為正20面體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含90或120個(gè)HBC二聚體，每個(gè)二聚體由兩個(gè)HBC單體組成。HBC在HBV復(fù)制過程中必不可少，它所構(gòu)成的核衣殼是包裝pgRNA和病毒聚合酶的場所，另外，HBC還介導(dǎo)病毒基因組DNA進(jìn)入細(xì)胞核，繼而生成cccDNA作為復(fù)制的初始模板。由于核衣殼對于HBV復(fù)制周期的完成不可或缺，因此，干擾核衣殼的正常形成也成為一種很有吸引力的治療策略。干擾核衣殼的形成，可以從兩個(gè)方面來考慮，一是干擾二聚體之間的相互作用，使得最終形成的核衣殼結(jié)構(gòu)異常；二是干擾HBC單體之間形成二聚體，破壞核衣殼的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，從而阻礙核衣殼的形成?，F(xiàn)有一些處于臨床前階段的藥物如HAPs，AT130，AT61等的作用機(jī)制是第一種，但目前尚缺乏靶向HBC二聚體形成的候選藥物。研發(fā)靶向HBC二聚體形成藥物的難點(diǎn)之一，是缺乏合適的藥物篩選細(xì)胞模型。一個(gè)好的篩選模型，需要滿足如下條件：(1)靶點(diǎn)明確；(2)所模擬的生物過程最大程度地接近自然狀態(tài)；(3)檢測過程簡單方便。然而，目前為止，還沒有一種模型能夠滿足這些要求。目前使用的篩選模型，要么是一些支持HBV復(fù)制的穩(wěn)定細(xì)胞系，比如HepAD38，Hep2.2.15細(xì)胞等，它們的缺點(diǎn)是靶點(diǎn)不明確，檢測較繁瑣；要么使用原核表達(dá)的核心蛋白進(jìn)行體外組裝，這種模型的缺點(diǎn)是與真正病毒的復(fù)制環(huán)境差別較大。申請人在前期專利申請中(專利申請公開號(hào)CN106188310A)建立了一種能指示HBC二聚體形成的新方法。該方法的核心策略是：利用兩個(gè)蛋白單體形成二聚體后，物理距離將非常靠近這一原理，將蛋白單體帶上一種距離敏感的信號(hào)，使得當(dāng)兩個(gè)單體距離較遠(yuǎn)時(shí)不發(fā)出信號(hào)，僅當(dāng)其足夠靠近時(shí)才能發(fā)出信號(hào)，那么這種信號(hào)就可以用來指示二聚體的形成情況。具體來講，是將海腎熒光素酶(Rluc)基因分為N(1-229aa)，C(229-311aa)兩段，分別與核心蛋白基因通過長片段接頭融合，構(gòu)建了兩種分別表達(dá)RlucN-HBC，RlucC-HBC的重組質(zhì)粒，并通過實(shí)驗(yàn)證明，RlucN-HBC及RlucC-HBC可形成二聚體，其發(fā)光信號(hào)可以反映二聚體的形成情況。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對上述技術(shù)問題，提供一種質(zhì)粒，所述質(zhì)粒的核酸序列如SEQIDNo:1所示。本發(fā)明一方面提供了一種靶向HBC二聚體形成的藥物篩選細(xì)胞模型，是將前述SEQIDNo:1所示的質(zhì)粒酶切線性化，然后將該線性化片段轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)細(xì)胞，通過篩選得到的能夠表達(dá)具有Rluc熒光素酶活性的產(chǎn)物的細(xì)胞系。在上述技術(shù)方案中，所述體外培養(yǎng)細(xì)胞為HEK293細(xì)胞。在上述技術(shù)方案中，所述細(xì)胞系在四環(huán)素調(diào)控下表達(dá)具有Rluc熒光素酶活性的產(chǎn)物。本發(fā)明的另一方面提供了一種前述的靶向HBC二聚體形成的藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，是將如SEQIDNo:1所示的質(zhì)粒酶切線性化，然后將該線性化片段轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)細(xì)胞，篩選出能夠表達(dá)具有Rluc熒光素酶活性的產(chǎn)物的細(xì)胞系，即得。在上述細(xì)胞模型的構(gòu)建方法中，所述體外培養(yǎng)細(xì)胞為HEK293細(xì)胞。在上述細(xì)胞模型的構(gòu)建方法中，篩選出的細(xì)胞系是在四環(huán)素調(diào)控下表達(dá)具有Rluc熒光素酶活性的產(chǎn)物。本發(fā)明的另一方面提供了一種前述的靶向HBC二聚體形成的藥物篩選細(xì)胞模型在篩選抑制HBC二聚體形成的化合物中的應(yīng)用。本發(fā)明利用了分裂的海腎熒光素酶。海腎熒光素酶(Rluc)是一種從海洋動(dòng)物海腎中分離到的蛋白質(zhì)分子，能催化腔腸熒光素發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而發(fā)出綠色熒光。Rluc全長311個(gè)氨基酸，重組表達(dá)的Rluc常用作報(bào)告基因，廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究。前人研究證明，將Rluc從第229位氨基酸分成N、C兩段以后，各自將失去催化活性，但若通過某種手段將兩段復(fù)合后，則能部分恢復(fù)其酶活性。利用這一特性，這種分裂的Rluc可被用來指示蛋白分子間的相互作用。申請人在之前的專利申請中將海腎熒光素酶(Rluc)基因分為N(1-229aa)，C(229-311aa)兩段，分別與核心蛋白基因通過長片段接頭融合，構(gòu)建了兩種分別表達(dá)RlucN-HBC，RlucC-HBC的重組質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)證明，RlucN-HBC及RlucC-HBC可形成二聚體，其發(fā)光信號(hào)可以反映二聚體的形成情況。在本發(fā)明中，我們以前期構(gòu)建的質(zhì)粒RlucN-HBC和RlucC-HBC為基礎(chǔ)，對其做進(jìn)一步構(gòu)建和改造，使RlucN-HBC及RlucC-HBC在同一個(gè)載體上實(shí)現(xiàn)四環(huán)素調(diào)控下的表達(dá)，然后，利用該載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，篩選并鑒定出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞NCTP6，該細(xì)胞株即可作為靶向HBC二聚體形成的藥物篩選細(xì)胞模型。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明得到的質(zhì)粒NCTPuro可以成功應(yīng)用于藥物篩選模型細(xì)胞系NCTP6的構(gòu)建當(dāng)中，構(gòu)建的藥物篩選模型細(xì)胞系NCTP6經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明能夠在四環(huán)素調(diào)控下表達(dá)具有Rluc熒光素酶活性的產(chǎn)物，成功篩選出了能夠抑制HBC二聚體形成的化合物。利用該細(xì)胞模型可以方便快捷地對影響HBC二聚體形成的化合物進(jìn)行初篩，篩選到的化合物若能夠阻止HBC二聚體的形成，則亦可能有效地阻止乙肝病毒的復(fù)制，那么可以據(jù)此開發(fā)阻止HBC二聚體形成的藥物來治療乙肝，在乙肝病毒相關(guān)科學(xué)研究以及抗病毒藥物篩選方面有非常好的應(yīng)用價(jià)值。附圖說明圖1是質(zhì)粒pTRE-RN-RC構(gòu)建流程示意圖。圖2是質(zhì)粒NCTPuro構(gòu)建流程示意圖。圖3是穩(wěn)定細(xì)胞系NCTP6的構(gòu)建流程示意圖。圖4是篩選細(xì)胞系NCTP6過程中細(xì)胞克隆的Rluc熒光素酶活性表達(dá)檢測結(jié)果。圖5是四環(huán)素撤除后細(xì)胞克隆中Rluc活性隨時(shí)間變化結(jié)果圖。圖6是用本發(fā)明細(xì)胞模型進(jìn)行化合物篩選的流程示意圖。圖7是用本發(fā)明細(xì)胞模型進(jìn)行化合物初步篩選的部分結(jié)果圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明實(shí)施例中所用試劑來源如下：2×PrimeSTARHSMix：Takara公司，日本膠回收試劑盒、基因組DNA提取試劑盒：QIAGEN公司，德國質(zhì)粒模板PTRE-HBV1.1由美國印第安納大學(xué)醫(yī)學(xué)院郭海濤教授贈(zèng)送質(zhì)粒模板pXPR由美國麻省理工大學(xué)張峰博士實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，從Addgene購買大腸桿菌JM109、Rellina熒光素酶檢測試劑盒、Glomax熒光素酶檢測儀：Promega公司，美國BsmBI、Tangobuffer、DTT、Puromycin：Thermoscientific公司，美國DMEM：GIBICO公司，美國T7ligase：Enzymatics公司，美國ATP、NotI內(nèi)切酶：NewEnglandBiolabs公司，美國X-tremeGENETMHPDNA轉(zhuǎn)染試劑：Roche公司，德國HEK293細(xì)胞：美國模式菌種收集中心HepAD38細(xì)胞：由四川大學(xué)華西醫(yī)院唐紅教授贈(zèng)送本發(fā)明實(shí)施例中所用擴(kuò)增引物序列如下：實(shí)施例一、構(gòu)建質(zhì)粒NCTPuro本申請中使用到的質(zhì)粒RlucN-HBC和RlucC-HBC和申請人在前期的專利申請(公開號(hào)CN106188310A，申請?zhí)朇N201610564291.6)中構(gòu)建的質(zhì)粒RlucN-HBC和RlucC-HBC相同。質(zhì)粒NCTPuro需實(shí)現(xiàn)以下功能：(1)能表達(dá)RlucN-HBC和RlucC-HBC；(2)RlucN-HBC和RlucC-HBC的表達(dá)都受四環(huán)素控制，為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，RlucN-HBC和RlucC-HBC表達(dá)框需置于四環(huán)素響應(yīng)元件+MiniCMV啟動(dòng)子下游，且需表達(dá)四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄激活蛋白(tTA)；(3)需帶有方便穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選的抗puromycin抗性基因。該質(zhì)粒的構(gòu)建步驟如下：一、構(gòu)建質(zhì)粒PTRE-RlucN構(gòu)建質(zhì)粒PTRE-RlucN，將驅(qū)動(dòng)RlucN-HBC表達(dá)的啟動(dòng)子CMV替換為TRE-miniCMV啟動(dòng)子，按照如下步驟操作：1、以質(zhì)粒PTRE-HBV1.1為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：質(zhì)粒PTRE-HBV1.110ng，引物Fptregg3(10μM)及RBsmb1vect(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補(bǔ)齊體積至50μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；94℃15s，58℃15s，72℃20s，35個(gè)循環(huán)。用膠回收試劑盒回收擴(kuò)增片段，將該回收片段命名為frag1。2、第二個(gè)片段的擴(kuò)增，以RlucN-HBC為模板進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系為：質(zhì)粒RlucN-HBC10ng，引物FrlucNGG(10μM)及Ramp(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補(bǔ)齊體積至50μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min30s，35個(gè)循環(huán)。用膠回收試劑盒回收擴(kuò)增片段，將該回收片段命名為frag2。3、第三個(gè)片段的擴(kuò)增，以RlucN-HBC為模板進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系為：模板RlucN-HBC10ng，F(xiàn)amp(10μM)及RCMVGG(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補(bǔ)齊體積至50μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)。用膠回收試劑盒回收擴(kuò)增片段，將該回收片段命名為frag3。4、將以上得到的三個(gè)片段frag1、frag2和frag3做Goldengate連接反應(yīng)，反應(yīng)體系為：BsmBI酶0.75μlTangobuffer1μlDTT1μlT7ligase0.25μlATP1μlfrag12μl(40ng)frag22μl(100ng)frag32μl(80ng)總體積10μl反應(yīng)條件：37℃5min，20℃5min，循環(huán)25次；80℃20min滅活反應(yīng)。將Goldengate產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)菌，涂板，克隆初篩，測序鑒定，正確的克隆命名為質(zhì)粒PTRE-RlucN，其結(jié)構(gòu)如圖1中所示。二、構(gòu)建質(zhì)粒PTRE-RlucC構(gòu)建質(zhì)粒PTRE-RlucC，將驅(qū)動(dòng)RlucN-HBC表達(dá)的啟動(dòng)子CMV替換為TRE-miniCMV啟動(dòng)子。構(gòu)建步驟與上述PTRE-RlucN的構(gòu)建步驟類似，使用的frag1和frag3即是PTRE-RlucN構(gòu)建過程中的frag1和frag3。另一個(gè)片段frag4的擴(kuò)增是以RlucC-HBC為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為：模板RlucC-HBC10ng，F(xiàn)rlucCGG(10μM)及RCMVGG(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補(bǔ)齊體積至50μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min30s，35個(gè)循環(huán)。用膠回收試劑盒回收擴(kuò)增片段，將該回收片段命名為frag4。將以上得到的三個(gè)片段frag1、frag4和frag3做Goldengate連接反應(yīng)，反應(yīng)體系為：BsmBI酶0.75μlTangobuffer1μlDTT1μlT7ligase0.25μlATP1μlfrag140ngfrag490ngfrag380ngddH2O補(bǔ)齊至10μl總體積10μl反應(yīng)條件：37℃5min，20℃5min，循環(huán)25次；80℃20min滅活反應(yīng)。將Goldengate產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)菌，涂板，克隆初篩，測序鑒定，正確的克隆命名為質(zhì)粒PTRE-RlucC，其結(jié)構(gòu)如圖1中所示。三、質(zhì)粒PTRE-RN-RC構(gòu)建質(zhì)粒PTRE-RN-RC是以前述兩個(gè)質(zhì)粒PTRE-RlucN和PTRE-RlucC為基礎(chǔ)構(gòu)建的，目的是將RlucN和RlucC的表達(dá)片段克隆到同一個(gè)質(zhì)粒上。首先以PTRE-RlucC為模板，用引物FCMV55和RSV40GG3擴(kuò)增片段frag5，然后以PTRE-RlucN為模板，用引物Fpch9gg和Ramp擴(kuò)增片段frag6，以PTRE-RlucN為模板，用引物Rpch9gg和Famp擴(kuò)增片段frag7，再將片段frag5，frag6和frag7做Goldengate連接反應(yīng)，最終測序鑒定正確的質(zhì)粒命名為PTRE-RN-RC(其構(gòu)建過程和其結(jié)構(gòu)如圖1中所示)。片段frag5的擴(kuò)增體系為：模板PTRE-RlucC10ng，F(xiàn)CMV55(10μM)及RSV40GG3(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補(bǔ)齊體積至50μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)。片段frag6的擴(kuò)增體系為：模板PTRE-RlucN10ng，F(xiàn)pch9gg(10μM)及Ramp(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補(bǔ)齊體積至50μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)。片段frag7的擴(kuò)增體系為：模板PTRE-RlucN10ng，Rpch9gg(10μM)及Famp(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補(bǔ)齊體積至50μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min30s，35個(gè)循環(huán)。Goldengate連接反應(yīng)的反應(yīng)體系為：BsmBI酶0.75μlTangobuffer1μlDTT1μlT7ligase0.25μlATP1μlfrag560ngfrag660ngfrag7100ngddH2O補(bǔ)齊至10μl總體積10μl反應(yīng)條件：37℃5min，20℃5min，循環(huán)25次；80℃20min滅活反應(yīng)。四、質(zhì)粒PCH9-tTA構(gòu)建PCH9-tTA是能表達(dá)四環(huán)素調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活因子的質(zhì)粒，我們從HepAD38細(xì)胞基因組中擴(kuò)增tTA基因，并將其克隆PCH9上。按照如下步驟操作：1、用QIAGEN基因組DNA提取試劑盒提取HepAD38細(xì)胞的基因組DNA，然后以其為模板擴(kuò)增tTA基因。反應(yīng)體系為：HepAD38細(xì)胞基因組DNA500ng，F(xiàn)Tta(10μM)及RTta(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補(bǔ)齊體積至50μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃30s，55℃15s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)。用膠回收試劑盒回收擴(kuò)增片段，將該回收片段命名為frag8。2、以RlucN-HBC為模板，擴(kuò)增PCH9的質(zhì)粒骨架片段：反應(yīng)體系為：模板RlucN-HBC10ng，F(xiàn)SV40GG2(10μM)及RBsmb1vect(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補(bǔ)齊體積至50μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；94℃15s，57℃15s，72℃2min，35個(gè)循環(huán)。用膠回收試劑盒回收擴(kuò)增片段，將該回收片段命名為frag9。3、將以上得到的兩個(gè)片段frag8和frag9做Goldengate連接反應(yīng)，反應(yīng)體系為：BsmBI酶0.75μlTangobuffer1μlDTT1μlT7ligase0.25μlATP1μlfrag850ngfrag9120ngddH2O補(bǔ)齊至10μl總體積10μl反應(yīng)條件：37℃5min，20℃5min，循環(huán)25次。80℃20min滅活反應(yīng)。Goldengate產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)菌，涂板，克隆初篩，測序鑒定，正確的克隆命名為質(zhì)粒PCH9-tTA，其結(jié)構(gòu)如圖2中所示。五、質(zhì)粒PCH9-puro構(gòu)建以質(zhì)粒pXPR為模板，擴(kuò)增puromycin抗性基因片段。反應(yīng)體系為：模板pXPR10ng，F(xiàn)puroGG(10μM)及RpuroGG(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補(bǔ)齊體積至50μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；94℃15s，57℃15s，72℃40s，35個(gè)循環(huán)。用膠回收試劑盒回收擴(kuò)增片段，將該回收片段命名為frag10。將frag10與前述片段frag9做Goldengate連接反應(yīng)(反應(yīng)體系與反應(yīng)條件參照frag8和frag9的Goldengate連接反應(yīng))，轉(zhuǎn)化所得克隆經(jīng)測序驗(yàn)證后命名為PCH9-puro。六、質(zhì)粒tTA-puro構(gòu)建為了將tTA和puro抗性基因表達(dá)片段克隆到同一個(gè)質(zhì)粒上，首先以PCH9-puro為模板，用引物FCMV55和RSV40GG3擴(kuò)增片段frag11，然后以PCH9-tTA為模板，用引物Fpch9gg和Ramp擴(kuò)增片段frag12，以PCH9-tTA為模板，用引物Rpch9gg和Famp擴(kuò)增片段frag13，再將片段frag11，frag12和frag13做Goldengate連接反應(yīng)，最終測序鑒定正確的質(zhì)粒命名為tTA-puro(其結(jié)構(gòu)如圖2中所示)。PCR反應(yīng)的擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件、以及Goldengate反應(yīng)體系和條件參照“三、質(zhì)粒PTRE-RN-RC構(gòu)建”中的反應(yīng)。七、質(zhì)粒NCTPuro構(gòu)建首先，以tTA-puro為模板，用引物FCMVup(帶有NotI酶切位點(diǎn))及Ramp擴(kuò)增得到片段frag14，然后以前述構(gòu)建的質(zhì)粒PTRE-RN-RC為模板，用引物Famp及Rpch9GG2擴(kuò)增片段frag15，再將片段frag14和frag15做Goldengate連接反應(yīng)，最終測序鑒定正確的質(zhì)粒命名為NCTPuro(其構(gòu)建過程和其結(jié)構(gòu)如圖2中所示)，其核酸序列如SEQIDNo:1所示。frag14擴(kuò)增體系：模板PTRE-RN-RC10ng，F(xiàn)CMVup(10μM)及Ramp(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補(bǔ)齊體積至50μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；94℃15s，58℃15s，72℃2min30s，35個(gè)循環(huán)。frag15的擴(kuò)增體系：模板PTRE-RN-RC10ng，F(xiàn)amp(10μM)及Rpch9GG2(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，滅菌超純水補(bǔ)齊體積至50μl。反應(yīng)條件同frag14的PCR反應(yīng)條件。Goldengate反應(yīng)體系和條件參照“四、質(zhì)粒PCH9-tTA構(gòu)建”中的反應(yīng)。實(shí)施例二、四環(huán)素調(diào)控的RlucN-HBC與RlucC-HBC共表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建為了方便后續(xù)藥物篩選，需構(gòu)建RlucN-HBC與RlucC-HBC共表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系(該方法步驟流程如圖3所示)，按照如下步驟操作：1、首先用NotI內(nèi)切酶將20μg實(shí)施例一中構(gòu)建的NCTPuro質(zhì)粒酶切線性化，然后將該線性化片段轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞(6cm培養(yǎng)皿)，48小時(shí)后，開始用2μg/mlPuromycin篩選，篩選3天后，將存活細(xì)胞用胰酶消化，以有限稀釋法稀釋接種至96孔板，繼續(xù)篩選約2周，待細(xì)胞克隆長大后鑒定。2、將最終獲得的20個(gè)單克隆細(xì)胞進(jìn)行鑒定，分別將這些細(xì)胞接種到96孔板，并分別用含有和不含有2μg/ml四環(huán)素的培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)后，將細(xì)胞裂解，檢測裂解液中的Rluc熒光素酶活性。如圖4所示，在20個(gè)細(xì)胞克隆中，6號(hào)克隆和8號(hào)克隆在用無四環(huán)素培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，與用含四環(huán)素的培養(yǎng)基相比，Rluc熒光素酶活性顯著上升(>100倍)，其中6號(hào)克隆這種差異更顯著。這證明6號(hào)和8號(hào)克隆可以表達(dá)具有Rluc熒光素酶活性的產(chǎn)物，并且其表達(dá)受到四環(huán)素調(diào)控，是滿足我們需求的細(xì)胞克隆。我們進(jìn)一步檢測了四環(huán)素撤除后，6號(hào)隆中的Rluc活性隨時(shí)間變化情況，如圖5所示，隨著四環(huán)素撤除時(shí)間延長，Rluc活性逐漸升高，4天后信號(hào)值可達(dá)到約400,000，而未撤除四環(huán)素的細(xì)胞，熒光素酶信號(hào)則一直處于背景水平。最終選擇6號(hào)克隆作為后續(xù)藥物篩選的細(xì)胞，將其命名為細(xì)胞系NCTP6。實(shí)施例三、利用NCTP6進(jìn)行初步藥物篩選在獲得穩(wěn)定細(xì)胞系NCTP6以后，即可用于藥物篩選。我們利用該細(xì)胞，篩選了一個(gè)含有218種天然化合物的庫，篩選流程如下：復(fù)蘇NCTP6細(xì)胞，用含2μg/ml四環(huán)素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于10cm培養(yǎng)皿中。在接種前一天，將培養(yǎng)基更換為無四環(huán)素DMEM培養(yǎng)基。第二天上午，將細(xì)胞以約90％匯合度接種于96孔板。細(xì)胞接種后約6小時(shí)待細(xì)胞貼壁，將待測化合物分別加入96孔板中，終濃度為20μM，每種化合物做3個(gè)復(fù)孔。加藥后約48小時(shí)，吸去培養(yǎng)基，每孔加入細(xì)胞裂解液，室溫?fù)u動(dòng)孵育20min，然后取裂解液用熒光素酶檢測儀進(jìn)行檢測(操作流程如圖6所示)。在篩選的218種天然化合物中，能使Rluc活性降低3倍或以上的化合物共有32種(圖7a、7b顯示了部分篩選結(jié)果)，除去那些能引起明顯細(xì)胞死亡的，有7種化合物可以作為下一步深入研究的對象。能使Rluc活性升高2倍以上的化合物有2種，它們也可以作為候選化合物進(jìn)行更深入研究。這些篩選結(jié)果表明，不同化合物對NCTP6細(xì)胞中的Rluc活性有不同影響，該細(xì)胞模型可以方便快捷地對影響HBC二聚體形成的化合物進(jìn)行初篩。序列表<110>重慶醫(yī)科大學(xué)<120>靶向HBC二聚體形成的藥物篩選細(xì)胞模型及其構(gòu)建和應(yīng)用<130>1<160>19<210>1<211>11147<212>DNA<213>人工序列<223>質(zhì)粒NCTPuro的核酸序列<400>1cgtttaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggcc1ctttcgtcttcactcgaatatctgcaggcgtatcacgaggccctttcgtcttcactcgag120tttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcag180tgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaa240gtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagctcggtacccgg300gtcgaggtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcgtcgagcaccagcacctgcaac360tttttcacctctgcctaatcatctcttgttcatgtcctactgttcaagcctccaagctgt420gccttgggtggctttggggcatgacttcgaaagtttatgatccagaacaaaggaaacgga480tgataactggtccgcagtggtgggccagatgtaaacaaatgaatgttcttgattcattta540ttaattattatgattcagaaaaacatgcagaaaatgctgttatttttttacatggtaacg600cggcctcttcttatttatggcgacatgttgtgccacatattgagccagtagcgcggtgta660ttataccagaccttattggtatgggcaaatcaggcaaatctggtaatggttcttataggt720tacttgatcattacaaatatcttactgcatggtttgaacttcttaatttaccaaagaaga780tcatttttgtcggccatgattggggtgcttgtttggcatttcattatagctatgagcatc840aagataagatcaaagcaatagttcacgctgaaagtgtagtagatgtgattgaatcatggg900atgaatggcctgatattgaagaagatattgcgttgatcaaatctgaagaaggagaaaaaa960tggttttggagaataacttcttcgtggaaaccatgttgccatcaaaaatcatgagaaagt1020tagaaccagaagaatttgcagcatatcttgaaccattcaaagagaaaggtgaagttcgtc1080gtccaacattatcatggcctcgtgaaatcccgttagtaaaaggtggttcgtctggatcag1140gcggtggcggttcaggaggtggtggctcaggcggaggaggttccggtggcggcggcagtg1200gtggtggaggctctggtggtggaggctctggaggcggaggttcaggaggtggtggatctg1260gaggaggtggatcaggcggtggcggttcaggaggtggtggctcaggcggaggaggttccg1320gtggcggcggcagtggtggtggaggctctggtggtggaggctctggaggcggaggttcag1380gaggtggtggatctggaggaggtggatctgacatcgacccttataaagaatttggagcta1440ctgtggagttactctcgtttttgccttctgacttctttccttcagtacgagatcttctag1500ataccgcctcagctctgtatcgggaagccttagagtctcctgagcattgttcacctcacc1560atactgcactcaggcaagcaattctttgctggggggaactaatgactctagctacctggg1620tgggtgttaatttggaagatccagcgtctagagacctagtagtcagttatgtcaacacta1680atatgggcctaaagttcaggcaactcttgtggtttcacatttcttgtctcacttttggaa1740gagaaacagttatagagtatttggtgtctttcggagtgtggattcgcactcctccagctt1800atagaccaccaaatgcccctatcctatcaacacttccggagactactgttgttagacgac1860gaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcgccgc1920gtcgcagaagatctcaatctcgggaatctcaatgttaggagattaggttaaaggtctttg1980tactaggaggctgtaggcataaattggtctgcgcaccagcaccatgcaactttttcacct2040ctgcctaatcatctcttgttcatgtcctactgttcaagcctccaagctgtgccttgggtg2100gctttggggcatggacatcgacccttataaagaatttggagctactgtggagttactctc2160gtttttgccttctgacttctttccttcagtacgagatccccactcccgggcggccgcgac2220tctagatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcc2280cacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgttta2340ttgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcat2400ttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttcccgggtga2460gggcgagctcgctagccctatagtgagtcgtattaatagctcgacacaggaaacagctat2520gaccatgattacgccaagctgcttgggctgcagattattgactagttattaatagtaatc2580aattacggggtcattagttcatagccgttcgaaaagtgccactgacgtctaagaaaccat2640tattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcttcactc2700gaatatctgcaggcgtatcacgaggccctttcgtcttcactcgagtttaccactccctat2760cagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtg2820aaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccact2880ccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagctcggtacccgggtcgaggtaggcgtg2940tacggtgggaggcctatataagcgtcgagcaccagcacctgcaactttttcacctctgcc3000taatcatctcttgttcatgtcctactgttcaagcctccaagctgtgccttgggtggcttt3060gg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3>人工序列<223>FpuroGG<400>17actcaccgtctctcatgaccgagtacaagccca33<210>18<211>39<212>DNA<213>人工序列<223>RpuroGG<400>18tgcgtccgtctctcttagattgtcgacttaacgcgttca39<210>19<211>44<212>DNA<213>人工序列<223>FCMVup<400>19actcaccgtctctgcggccgccagctatgaccatgattacgcca44當(dāng)前第1頁1 2 3