本發(fā)明屬于分子生物學與獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定表達豬瘟病毒E2蛋白的重組細胞系及制備方法、所述重組細胞系在制備豬瘟病毒亞單位疫苗中的應用、包含所述重組細胞系的豬瘟病毒亞單位疫苗以及豬瘟病毒亞單位疫苗的制備方法。

背景技術(shù)：

豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的豬的一種急性高度致死性疾病，強毒株可導致易感豬100％發(fā)病，并導致50％以上的死亡率，國際獸疫局(OIE)將其定為必須通報的疫病，我國將其列為一類動物疫病。由于不同日齡、性別和品種的豬均可感染發(fā)病，因此豬瘟給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大地經(jīng)濟損失。該病呈世界性分布，在各養(yǎng)豬國家都有不同程度的流行。目前在中國，豬瘟是影響?zhàn)B豬業(yè)的最重要的疾病。當前我國豬瘟發(fā)病狀況具有多樣性，流行范圍較廣，呈散發(fā)流行趨勢。從感染情況看，發(fā)病日齡小，成年豬帶毒現(xiàn)象嚴重，非典型和繁殖障礙型豬瘟增多。豬瘟經(jīng)常與豬藍耳病、豬圓環(huán)病毒病、豬偽狂犬病、豬鏈球菌病、豬肺疫等混合感染，導致豬的死亡率增加。由于我國大多數(shù)生豬養(yǎng)殖企業(yè)規(guī)模較小，養(yǎng)殖技術(shù)和管理水平相對落后，豬的死亡率較高達近12％，由此造成的損失近百億元，這也是導致近些年來豬肉價格不斷升高的原因之一。

采用免疫接種是目前我國控制豬瘟的主要措施，疫苗質(zhì)量的好壞直接影響疫病的免疫防治效果?，F(xiàn)有技術(shù)中的豬瘟弱毒疫苗(C株)對世界范圍內(nèi)豬瘟防控發(fā)揮了卓著貢獻。該疫苗目前仍被全世界多個國家所使用。豬瘟弱毒疫苗分為乳兔苗、免脾淋苗、原代細胞苗及傳代細胞苗等。乳兔苗和脾淋苗又稱為組織苗，是采用健康家兔生產(chǎn)制備的。組織苗的生產(chǎn)需要大量動物，且工藝復雜，成本高；原代細胞苗及傳代細胞苗的生產(chǎn)也受到諸多因素困擾，如細胞培養(yǎng)用血清中的牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)及抗體會干擾病毒生長，病毒生產(chǎn)滴度低、產(chǎn)量不穩(wěn)定等。而且母源抗體干擾弱毒疫苗的免疫效果，這也是導致豬瘟疫苗免疫失敗的因素之一。

CSFV為有囊膜病毒，病毒粒子大小約為40nm至60nm。病毒基因組為單股正鏈RNA，長約12.3kb，包含一個大的開放性閱讀框(ORF)，編碼一個大的具有3898個氨基酸殘基的多聚蛋白，該多聚蛋白的分子量約為438kDa。豬瘟病毒含有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，其中結(jié)構(gòu)蛋白包括C、E0、E1和E2蛋白。E2蛋白為CSFV的一種重要的囊膜糖蛋白，又稱為gp55，是病毒主要的抗原蛋白。E2蛋白誘導產(chǎn)生病毒的中和抗體，是豬瘟病毒主要的免疫保護性抗原，也是研究豬瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白。鑒于現(xiàn)有豬瘟疫苗的種種缺陷與不足，以及隨著現(xiàn)代基因工程技術(shù)與細胞生物工程技術(shù)的發(fā)展，許多科研人員試圖以現(xiàn)代分子生物學手段研制出可以克服現(xiàn)有疫苗缺陷的新型豬瘟疫苗。

這些新型的豬瘟疫苗有病毒活載體疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、大腸桿菌和昆蟲桿狀病毒表達的E2蛋白亞單位疫苗。目前得到應用的有歐洲科研人員研制的以昆蟲桿狀病毒表達的E2蛋白亞單位疫苗，該疫苗免疫不受母源抗體影響，而且可以與病毒感染進行抗體檢測鑒別診斷。已有研究表明，用20μg昆蟲細胞表達的E2油佐劑疫苗免疫豬，能抵抗CSFV強毒株的攻擊。該疫苗已于上世紀九十年代在歐洲批準上市，在歐洲國家的豬瘟根除計劃發(fā)揮了重要作用。

但該疫苗是通過昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的，相對原核表達系統(tǒng)而言，該表達系統(tǒng)表達蛋白后可以在一定程度上進行翻譯后加工與修飾。但與病毒天然抗原蛋白結(jié)構(gòu)仍有一定差異，蛋白表達后折疊與修飾不如哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。而且該系統(tǒng)生產(chǎn)制備抗原時，細胞經(jīng)病毒感染后細胞會裂解與死亡，對下游純化等生產(chǎn)工藝增加難度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明探索了利用慢病毒載體介導在不同的哺乳動物細胞系中表達豬瘟病毒E2蛋白，并最終找到了合適的穩(wěn)定表達細胞系，克服了表達豬瘟病毒E2囊膜糖蛋白對細胞毒性作用，并且建立了大規(guī)模篩選等技術(shù)。結(jié)果成功制備了穩(wěn)定表達豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白E2蛋白的重組細胞系。該重組細胞系表達E2蛋白的表達量高。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種制備穩(wěn)定表達豬瘟病毒E2蛋白的重組細胞系的方法，包括以下步驟：

1)提供重組表達質(zhì)粒，該重組表達質(zhì)粒包含彼此有效連接的豬瘟病毒E2蛋白編碼序列和綠色熒光蛋白編碼序列；

2)通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將所述重組表達質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入真核細胞；

3)通過熒光檢測法篩選出表達所述重組表達質(zhì)粒的單細胞，并對該單克隆細胞進行多次傳代培養(yǎng)，獲得經(jīng)傳代培養(yǎng)后的細胞克??；

4)檢測所述細胞克隆中豬瘟病毒E2蛋白的表達量，篩選出經(jīng)所述多次傳代培養(yǎng)后仍然能夠表達豬瘟病毒E2蛋白的重組細胞系，

其中所述豬瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，所述編碼豬瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，在根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的方法中，所述豬瘟病毒E2蛋白為豬瘟病毒C株E2蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，在根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的方法中，所述方法還包括利用懸浮培養(yǎng)法或靜置培養(yǎng)法培養(yǎng)所得重組細胞系。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，在根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的方法中，將所述重組表達質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK-293T細胞。

根據(jù)本發(fā)明的第五方面，在根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的方法中，所述通過熒光檢測法篩選出表達所述重組表達質(zhì)粒的單細胞的步驟包括：通過熒光顯微鏡觀察經(jīng)所述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染的細胞，將表現(xiàn)出綠色熒光的細胞群體進行有限稀釋，從而篩選出表達所述重組表達質(zhì)粒的單細胞。

根據(jù)本發(fā)明的第六方面，在根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的方法中，所述多次傳代培養(yǎng)為進行2-50次傳代培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明的第七方面，在根據(jù)本發(fā)明的第一方面或第六方面所述的方法中，在步驟4)中，篩選出經(jīng)所述多次傳代培養(yǎng)后能夠表達至少100ug/ml的豬瘟病毒E2蛋白的重組細胞系。

根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供了一種根據(jù)本發(fā)明第一至第七方面任一方面所述的方法獲得的穩(wěn)定表達豬瘟病毒E2蛋白的重組細胞系。

根據(jù)本發(fā)明的第九方面，提供了一種豬瘟病毒亞單位疫苗，其包含有效劑量的由根據(jù)本發(fā)明第六方面所述的重組細胞系表達的豬瘟病毒E2蛋白和佐劑。

根據(jù)本發(fā)明的第十方面，在根據(jù)本發(fā)明第九方面所述的豬瘟病毒亞單位疫苗中，所述佐劑為礦物油佐劑。

根據(jù)本發(fā)明的第十一方面，在根據(jù)本發(fā)明第九方面所述的豬瘟病毒亞單位疫苗中，所述含豬瘟病毒E2蛋白的抗原液與佐劑的重量比為1:1至1:2。

根據(jù)本發(fā)明的第十二方面，在根據(jù)本發(fā)明第九方面所述的豬瘟病毒亞單位疫苗中，所述豬瘟病毒亞單位疫苗每頭份包含濃度為30ug至50ug的豬瘟病毒E2蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的第十三方面為根據(jù)本發(fā)明第八方面所述重組細胞系在制備豬瘟病毒亞單位疫苗中的應用。

根據(jù)本發(fā)明的第十四方面，提供了一種制備豬瘟亞單位疫苗的方法，包括以下步驟：

將根據(jù)第八方面所述的重組細胞系逐級放大培養(yǎng)至細胞密度為10⁷個以上時，連續(xù)收集培養(yǎng)上清液；

將所述上清液與佐劑按重量比1:1～1:2進行混合。

根據(jù)本發(fā)明的第十五方面，在根據(jù)本發(fā)明第十四方面所述的方法中，所述佐劑為礦物油佐劑。

本發(fā)明的有益效果如下：

1.將本發(fā)明的表達豬瘟病毒E2蛋白制備成疫苗，免疫動物后可以誘導產(chǎn)生針對CSFV的高效價抗體，抗體產(chǎn)生早且持續(xù)時間長，并能抵抗強毒的攻擊與感染。

2.本發(fā)明所選用的表達系統(tǒng)為真核(例如HEK-293T)細胞，得到的重組細胞系(例如HEK-293T-CE2)具有與親本細胞相似的生物特性，有利于抗原蛋白的規(guī)模生產(chǎn)；表達蛋白在表達細胞內(nèi)能得到接近病毒蛋白的天然構(gòu)象與修飾加工，抗原性好。

3.本發(fā)明的重組細胞系可以懸浮或靜止培養(yǎng)，適合于規(guī)?；笊a(chǎn)；細胞培養(yǎng)過程中不涉及到豬瘟病毒，具有良好的生物安全性。

4.本發(fā)明構(gòu)建的重組細胞系蛋白表達量高，最低產(chǎn)量可達200mg/L，生產(chǎn)成本低。

5.本發(fā)明構(gòu)建的重組細胞系含有綠色熒光蛋白，有利于細胞的篩選和克隆。

6.本發(fā)明的E2表達蛋白可以含有組氨酸標簽，利于后期純化。

7.利用本發(fā)明蛋白制備的疫苗免疫動物后，不產(chǎn)生豬瘟病毒E0蛋白抗體以及非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，可以利用檢測豬瘟病毒E0蛋白抗體或非結(jié)構(gòu)蛋白抗體來對疫苗免疫與病毒感染動物進行鑒別。

8本發(fā)明所制備的豬瘟疫苗為亞單位疫苗，不受母源抗體干擾，臨床使用方便。

9.本發(fā)明表達的E2蛋白抗原能對免疫豬誘導產(chǎn)生良好的免疫反應，免疫豬可以完全抵抗豬瘟強毒標準株即石門株的攻擊。該細胞系表達抗原所制備的疫苗可為豬瘟的預防提供新型、高效的預防制劑。對我國乃至世界范圍內(nèi)豬瘟的預防控制可以發(fā)揮重要作用。

附圖說明

圖1為重組真核細胞表達質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；

圖2為不同細胞克隆表達目的基因的RT-PCR檢測結(jié)果，其中M:Marker DL2000，大小依次為2000bp,1000bp,750bp,500bp,200bp和100bp；泳道1-5分別為：C1、C5、C7、C8和C9克隆細胞(C表示不同細胞克隆編號)；6：293T對照細胞；

圖3為不同代次細胞克隆表達的E2蛋白的SDS-PAGE結(jié)果，其中M：Marker，大小依次為98KDa,62KDa,49KDa,38KDa,28KDa；泳道1-4分別為：C5F19、C5F25、C5F29和C5F39代克隆細胞培養(yǎng)上清液(C表示細胞克隆編號，F(xiàn)表示細胞傳代代次，例如C5F19表示C5克隆細胞第19代，如此類推)；

圖4為不同代次細胞克隆表達的E2蛋白的Western Blot結(jié)果，其中M：Marker，大小依次為198KDa,98KDa,62KDa,49KDa,38KDa,28KDa；泳道1-4分別為：C5F19、C5F25、C5F29和C5F39代克隆細胞培養(yǎng)上清液(C表示細胞克隆編號，F(xiàn)表示細胞傳代代次，例如C5F19表示C5克隆細胞第19代，如此類推)；

圖5為家兔免疫后攻毒的體溫檢測結(jié)果；

圖6為2周齡仔豬免疫后血清豬瘟病毒ELISA抗體檢測結(jié)果，其中阻斷率≥40％為抗體陽性。

圖7為60日齡豬免疫后血清豬瘟病毒ELISA抗體檢測結(jié)果，其中阻斷率≥40％為抗體陽性。

具體實施方式

下文將參考實施例詳細描述本發(fā)明，所述實施例僅是意圖舉例說明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

本發(fā)明提供了一種制備穩(wěn)定表達豬瘟病毒E2蛋白的重組細胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟：

提供重組表達質(zhì)粒，該重組表達質(zhì)粒包含彼此有效連接的豬瘟病毒E2蛋白編碼序列和綠色熒光蛋白編碼序列；

通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將所述重組表達質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入真核細胞；

通過熒光檢測法篩選出表達所述重組表達質(zhì)粒的單細胞，并對該單克隆細胞進行多次傳代培養(yǎng)，獲得經(jīng)傳代培養(yǎng)后的細胞克??；

檢測所述細胞克隆中豬瘟病毒E2蛋白的表達量，篩選出經(jīng)所述多次傳代培養(yǎng)后仍然能夠表達(優(yōu)選表達量不低于100ug/ml)豬瘟病毒E2蛋白的重組細胞系，

其中所述豬瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，所述編碼豬瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

在一個具體的實施方案中，所述方法包括以下步驟：

(1)構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，將豬瘟病毒PCR產(chǎn)物回收后，與載體連接構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含彼此有效連接的豬瘟病毒E2蛋白編碼序列和綠色熒光蛋白編碼序列；

(2)通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將所述重組表達質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK-293T細胞；

(3)通過熒光檢測篩選表達重組表達質(zhì)粒的HEK-293T細胞，利用有限稀釋法對該細胞進行克隆；

(4)收獲克隆細胞培養(yǎng)上清液，檢測并比較豬瘟病毒E2蛋白表達量，獲得穩(wěn)定表達豬瘟病毒E2蛋白的重組細胞系，

其中，所述豬瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述編碼豬瘟病毒E2蛋白的氨基酸基因序列如SEQ ID No.2所示。

在本發(fā)明中，術(shù)語“穩(wěn)定表達”是指細胞系在經(jīng)過連續(xù)傳代(例如50代)后仍然能夠表達外源豬瘟病毒E2蛋白，優(yōu)選所述表達的表達量不低于100ug/ml。

在本發(fā)明中，術(shù)語“有效連接”是指所述豬瘟病毒E2蛋白編碼序列和所述綠色熒光蛋白編碼序列位于同一個編碼框中，能夠被通讀，從而被表達為重組蛋白。

在本發(fā)明中，豬瘟病毒E2蛋白優(yōu)選為具有良好免疫原性的豬瘟病毒C株E2蛋白，該毒株制備的疫苗為全世界公認的最優(yōu)豬瘟活疫苗。

在本發(fā)明中，本發(fā)明制備的穩(wěn)定表達豬瘟病毒E2蛋白的重組細胞系可懸浮培養(yǎng)或靜止培養(yǎng)，優(yōu)選懸浮培養(yǎng)。采用懸浮培養(yǎng)工藝培養(yǎng)重組細胞系，上清中的表達蛋白濃度可以提高十倍，且便于企業(yè)規(guī)?；a(chǎn)豬瘟E2蛋白亞單位疫苗。

在本發(fā)明中，能夠穩(wěn)定表達豬瘟病毒E2蛋白的重組細胞系，命名為HEK-293T-CE2，分類命名為人胚胎腎細胞(human kidney epithelial cells)。

在一個具體的實施方案中，所述通過熒光檢測法篩選出表達所述重組表達質(zhì)粒的單細胞的步驟包括：通過熒光顯微鏡觀察經(jīng)所述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染的細胞，將表現(xiàn)出綠色熒光的細胞群體進行有限稀釋，從而篩選出表達所述重組表達質(zhì)粒的單細胞。

在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的所述的方法獲得的穩(wěn)定表達豬瘟病毒E2蛋白的重組細胞系。

在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了一種安全、高效的豬瘟病毒亞單位疫苗，其包含有效劑量的經(jīng)所述重組細胞系表達的豬瘟病毒E2蛋白和佐劑。在優(yōu)選的實施方案中，所述佐劑為礦物油佐劑。在進一步的實施方案中，所述豬瘟病毒E2蛋白與佐劑的重量比為1:1。

在本發(fā)明中，所述豬瘟病毒亞單位疫苗每頭份包含30-50ug的豬瘟病毒E2蛋白。

在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了所述重組細胞系及其培養(yǎng)物在制備豬瘟病毒亞單位疫苗中的應用。

在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了一種制備豬瘟亞單位疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)將本發(fā)明所述的重組細胞系逐級放大培養(yǎng)至細胞密度為10⁷以上時，連續(xù)收集培養(yǎng)上清，經(jīng)離心取上清貯存于-40℃度以下保存；

(2)將培養(yǎng)液上清與佐劑按重量比1:1～1:2進行乳化，制備雙項油佐劑疫苗。

在本發(fā)明中，所述佐劑優(yōu)選為礦物油佐劑。

本發(fā)明制備的穩(wěn)定表達豬瘟病毒E2蛋白的重組細胞系可懸浮或靜止培養(yǎng)，細胞增殖速度快，細胞連續(xù)傳代后蛋白分泌穩(wěn)定，表達量高，蛋白與佐劑制備成疫苗后免疫豬能誘導動物機體產(chǎn)生高效價豬瘟病毒抗體，可抵抗豬瘟病毒強毒攻擊。

實施例

實施例1穩(wěn)定表達豬瘟病毒E2蛋白的重組細胞系的構(gòu)建與檢測

1.1材料和方法

1.1.1菌株、載體和主要試劑

轉(zhuǎn)移質(zhì)粒：pHBLV-CMVIE-IRES-ZSGreen購自漢恒生物。

JM109感受態(tài)細胞、RNA提取試劑盒、PrimeStar高保真聚合酶、DNA Marker為Takara產(chǎn)品；Reverse Transcription System、4-12％Bis-Tris Gel、SeeBlue Plus2pre-stained strandard為ThermoFisher公司產(chǎn)品；PGEM-T為Promega公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為Omega產(chǎn)品；XbaI為NEB產(chǎn)品；DMEM/F12(1:1)、Foetal Bovine Serum為GIBCO產(chǎn)品；Anti-Mouse IgG(Fc Specific)-peroxidase antibody produced in goat為Sigma產(chǎn)品；Vector VIP Peroxidase(HRP)substrate kit為Vector Laboratories產(chǎn)品；Plasmid maxi Kit為QIAGEN產(chǎn)品；豬瘟病毒E2蛋白抗體ELISA試劑盒為IDEXX公司產(chǎn)品；HEK293T細胞購自漢恒公司。

1.1.2目的片段的擴增和純化

根據(jù)Genebank中CSFV C株E2序列(登錄號AY663656.1)，利用引物設計軟件Primer 5.0，設計兩對引物(見表1)，由上海立菲生物科技有限公司合成。

表1 E2擴增引物

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，用隨機引物作為反轉(zhuǎn)錄引物，對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以F1/R1為引物進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物回收記為E2-1，以E2-1為模板，F(xiàn)1/R2為引物再次進行PCR，將PCR產(chǎn)物回收記為E2。

將PCR產(chǎn)物回收后，與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化到JM109細胞，取100μl涂布含有氨芐的LB瓊脂，37℃過夜培養(yǎng)。利用菌落PCR的方法鑒定重組子，挑選陽性克隆送往上海立菲生物技術(shù)有限公司測序。

1.1.3重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

CSFV-E2基因大小為1050bp，在起始密碼子前加有kozak序列和XbaI酶切位點與保護性堿基；在E2蛋白基因編碼末端加有終止密碼子、His標簽和BamHI酶切位點與保護性堿基，完整的編碼序列如SEQ NO.1所示。輔助質(zhì)粒pHBLV-CMVIE-IRES-ZSGreen用XbaI、BamHI雙酶切處理，然后與經(jīng)XbaI、BamHI雙酶切回收的CSFV-E2基因在T4DNA連接酶作用下連接，得到重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)后挑選單菌落擴增培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用XbaI、BamHI雙酶切對其進行鑒定；酶切鑒定陽性質(zhì)粒命名為pHBLV-CSFV-E2，同時送生物公司進行測序驗證。質(zhì)粒構(gòu)建示意圖見圖1.

1.1.4細胞轉(zhuǎn)染與篩選

選生長良好的HEK293T細胞消化傳代至T25細胞瓶中，待細胞融合度達到60％至80％時，將包裝所需質(zhì)粒pHBLV-E2按LipoFiter轉(zhuǎn)染試劑說明轉(zhuǎn)染進HEK293T細胞，培養(yǎng)3天后將細胞用胰酶消化，有限稀釋法將細胞傳代于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，10至15天后在熒光顯微鏡下觀察每孔細胞的克隆數(shù)，挑選含有一個細胞團塊并且有明亮熒光的孔相繼在24孔細胞板、6孔細胞板)、細胞培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)，同時收集各個克隆細胞上清用SDS-PAGE檢測蛋白的表達水平。

1.2結(jié)果

1.2.1重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pHBLV-CSFV-E2結(jié)構(gòu)圖見圖1。提取的重組質(zhì)粒經(jīng)XbaI、BamHI雙酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)有兩條帶，酶切產(chǎn)物電泳帶型與預期結(jié)果一致，同時測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒中XbaI、BamHI酶切位點間的序列和設計的編碼E2蛋白的基因完全一致。

1.2.2 E2基因穩(wěn)定表達細胞系的建立

1.2.2.1轉(zhuǎn)染細胞株的篩選

轉(zhuǎn)染后3天，通過有限稀釋法將不同稀釋度細胞置于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，每天在熒光顯微鏡下觀察每孔細胞，對出現(xiàn)有單個熒光細胞的培養(yǎng)孔進行標記，篩選出5個陽性細胞克隆擴大培養(yǎng)。

1.2.2.2克隆細胞的RT-PCR鑒定

取5個不同克隆細胞和親本293T細胞各一支，離心后取沉淀，用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，取6μL進行反轉(zhuǎn)錄，加入Oligo dT 1μL,Annealing Buffer 1uL,2X First-Strand Reaction Mix 10μL和2μL的SuperScript III/RNaseOUT Enzyme Mix，充分混勻，50℃加熱50分鐘，85℃、5分鐘終止反應，獲得cDNA。然后以獲得的cDNA為模板，利用CSFV-E2基因特應性引物(F1,R1)，PCR擴增目的基因，均能檢測到目的基因片段。結(jié)果參見圖2。

1.2.3 E2表達細胞系的篩選

1.2.3.1收取C1、C5、C7、C8和C9這5個克隆細胞在相同條件下的培養(yǎng)上清進行SDS-PAGE，比較不同克隆細胞E2蛋白的表達量，結(jié)果表明C5細胞克隆蛋白表達量最高，選取C5細胞克隆進行傳代培養(yǎng)與進一步特性分析。C5克隆細胞經(jīng)過不同代次傳代后，對培養(yǎng)上清液中CSFV-E2含量進行檢測，如圖3所示，結(jié)果表明篩選出的克隆細胞系在多次傳代后仍保持很好的蛋白表達水平。由上述結(jié)果可以看出構(gòu)建的重組細胞系能夠穩(wěn)定表達目的蛋白。

1.2.3.2表達E2蛋白的Western Blot檢測

細胞培養(yǎng)上清E2蛋白經(jīng)SDS-PAGE，再用特異性單抗進行Western Blot檢測，結(jié)果表明篩選出的克隆細胞系在連續(xù)傳代后表達的蛋白均與單抗產(chǎn)生特異性反應，表明表達蛋白的活性沒有發(fā)生變化(圖4)。

將得到的能夠穩(wěn)定表達豬瘟病毒E2蛋白的細胞克隆，命名為HEK293T-CE2。

實施例2豬瘟E2亞單位疫苗對家兔的免疫效力試驗

2.1試驗方法

2.1.1疫苗制備及免疫

將含量為50ug/ml的E2蛋白細胞培養(yǎng)上清液與油佐劑按重量比1:1混合后，在室溫條件下以300RPM攪拌5分鐘制備成疫苗。將6只日本大耳白家兔隨機分為2組，其中4只為免疫組，每只經(jīng)肌肉注射1ml疫苗(含有20ug E2蛋白)，另外2只不免疫作為對照組。

2.1.2抗體檢測

免疫后，在第14天及21天采血，血清用商品化ELISA試劑盒檢測豬瘟抗體。

2.1.3攻毒

免疫后21天，免疫組和對照組同時經(jīng)耳靜脈接種1ml兔化弱毒(含5000家兔感染量)。接種后，定時測量體溫。

2.2結(jié)果

2.2.1血清學檢測結(jié)果

家兔接種后第14天及21天豬瘟ELISA抗體均為陽性，阻斷率詳細見下表1。

表1家兔免疫后的豬瘟抗體檢測結(jié)果

注：按試劑盒說明進行計算，阻斷率≥40％為抗體陽性。

其中表示陰性對照平均

2.2.2攻毒試驗結(jié)果

家兔免疫后第21天，用豬瘟兔化弱毒攻擊，對照組均出現(xiàn)豬瘟兔化弱毒所導致的定型熱反應，而免疫組家兔體溫均正常，表明家兔接種后可產(chǎn)生中和抗體，能中和豬瘟兔化弱毒。體溫結(jié)果參見圖5。

實施例3豬瘟E2亞單位疫苗對豬的免疫效力試驗

3.1.1.1對2周齡仔豬的免疫效力

(1)分組：將15頭CSFV抗體檢測為陰性的2周齡仔豬隨機分為3組，每組5頭豬，第一組為弱豬瘟活疫苗免疫組，第二組為豬瘟亞單位疫苗免疫組，第三組為空白對照組。

(2)免疫：第一組按使用說明書每頭豬免疫1頭份商品化的豬瘟活疫苗；第二組每頭豬經(jīng)肌肉注射接種1ml的實施例2制備的豬瘟E2蛋白亞單位疫苗；第三組不免疫作為空白對照組。

(3)抗體檢測：豬瘟活疫苗免疫組、豬瘟E2蛋白亞單位疫苗免疫組和對照組均在接種后第14天、第28天、第42天采血，采集的血清用商品化ELISA抗體檢測試劑盒進行抗體檢測。

3.1.1.2對60日齡豬的免疫效力

(1)分組：將15頭CSFV抗體檢測為陰性的60日齡豬隨機分為3組，每組5頭豬，第一組為免疫組(一免組)，第二組為加強免疫組(二免組)，第三組為空白對照組。

(2)免疫：第一組每頭豬經(jīng)頸部肌肉接種2ml實施例2制備的豬瘟E2蛋白亞單位疫苗；第二組每頭豬經(jīng)頸部肌肉注射接種2ml實施例2制備的豬瘟E2蛋白亞單位疫苗，一免后21天每頭豬再經(jīng)頸部肌肉注射接種2ml實施例2制備的豬瘟E2蛋白亞單位疫苗；第三組不免疫作為空白對照。

(3)抗體檢測：一次免疫(一免)組在接種后第14天、第21天和第28天采血；二次免疫(二免)組在一免后第14天及第21天，二免后第7天(即一免后28天)及第14天(即一免后第35天)采血；對照組與二次免疫組同時間采血采集的血清用商品化ELISA抗體檢測試劑盒進行抗體檢測。

(4)攻毒：一次免疫組在免疫后第28天，二次免疫組在加強免疫后14天(即首免后35天)按《中國獸藥典》方法用豬瘟病毒標準強毒株進行攻擊，攻毒后每日觀察試驗豬的精神狀態(tài)、食欲與體溫等指標。

3.2結(jié)果

3.2.1血清學結(jié)果

(1)2周齡仔豬血清學結(jié)果：用豬瘟E2蛋白亞單位疫苗免疫2周齡仔豬后14天，5頭豬的ELISA抗體平均阻斷率為43.85％，28天升高至67.3％，而42天進一步升高至74.96％，其抗體水平與豬瘟活疫苗免疫后相似，詳細結(jié)果參見圖5。

(2)60日齡豬的血清學結(jié)果：用豬瘟E2蛋白亞單位疫苗免疫60日齡仔豬后14天，兩個免疫組豬瘟ELISA抗體均為陽性。一次免疫組接種后抗體繼續(xù)升高至28天的77.15％；二次免疫組首免后21天的抗體變化與一次免疫組相似，但21天加強免疫后7天(即首免后28天)抗體迅速上升到較高水平，14天(首免后35天)與7天抗體相似，維持在高水平。詳細結(jié)果參見圖6。

3.2.2攻毒試驗結(jié)果

攻毒后，兩個免疫組豬均未出現(xiàn)任何豬瘟臨床癥狀，剖檢時淋巴結(jié)、臟器均無任何肉眼可見病理變化；而未免疫對照組豬攻毒后48小時體溫均開始升高，精神沉郁，食欲減退或廢絕，5頭豬分別于攻毒后9-15天內(nèi)死亡，死亡豬剖檢均呈現(xiàn)典型的豬瘟癥狀。

血清學和免疫攻毒試驗結(jié)果表明，本發(fā)明疫苗免疫豬后能誘導產(chǎn)生較高水平的保護性抗體，且對強毒攻擊可提供100％的保護。