本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
,涉及一種狗尾草農(nóng)桿菌高效轉(zhuǎn)化方法,具體是一種金剛砂輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化狗尾草種子的高效轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
：C4光合作用是驅(qū)動幾種主要糧食作物和生物能源草類的生產(chǎn)力，包括玉米(Zeamays)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、高粱(Sorghumbicolor)、芒草(Miscanthusgiganteus)和柳枝稷(Panicumvirgatum)等。狗尾草(Setariaviridis)是一個真正的二倍體，具有許多適于遺傳分析的特性，包括相對較小的基因組(510Mb)，身材矮小，生命周期短和種子量大等等，因此，狗尾草是研究C4光合作用的優(yōu)秀模型，同時也是研究非生物脅迫耐受性和生物能源原料的模型。狗尾草在形態(tài)上類似于大多數(shù)禾本科草，包括主要生物能源作物柳枝稷(Panicumvirgatum)和芒草(Miscanthusgiganteus)等，在地理上廣泛分布，并且占據(jù)多樣化的生態(tài)位。目前，狗尾草的轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要采用成熟種子發(fā)芽后，從幼芽節(jié)點分生組織處誘導(dǎo)胚性愈傷組織進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，這種方法的最大問題是胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低，因品系和種子狀況不同，一般胚性愈傷組織誘導(dǎo)數(shù)與種子數(shù)的比率都小于10％；其次是胚性愈傷組織誘導(dǎo)時間較長，從接種子到培養(yǎng)基獲得第一階段的少量胚性愈傷組織需要約一個月時間，之后需要繼代2次(每半月繼代一次)后才有足夠的胚性愈傷組織用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，整個轉(zhuǎn)化周期需要約4個月時間；同時，這種胚性愈傷組織不耐繼代，不能長期繼代保存用于轉(zhuǎn)化，繼代3次以上的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化效率明顯降低，不適合繼續(xù)用于轉(zhuǎn)化；此外，胚性愈傷組織的挑選需要有一定的經(jīng)驗。這些都降低了這套轉(zhuǎn)化技術(shù)的靈活性和簡單實用性。作為重要的模式植物，為狗尾草建立更簡單、靈活、周期短、高效的轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為相關(guān)領(lǐng)域的研究方向。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種金剛砂輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化狗尾草種子的高效轉(zhuǎn)化方法，以狗尾草成熟種子為外植體，誘導(dǎo)露芽后用金剛砂進(jìn)行創(chuàng)傷處理，處理后用農(nóng)桿菌進(jìn)行浸染，經(jīng)共培養(yǎng)、抑菌、篩選與植株再生得到轉(zhuǎn)基因植株，具有簡單、靈活、快速、高效等特點。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案：一種金剛砂輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化狗尾草種子的高效轉(zhuǎn)化方法，其具體步驟如下：1、外植體的處理和活化選取經(jīng)休眠處理的狗尾草干燥成熟種子，將去除種皮后的種子裝入離心管，用有效濃度為1～3％的次氯酸鈉溶液滅菌消毒處理，無菌水清洗后，按質(zhì)量體積比：種子：芽誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基＝1:6～8的比例在離心管中加入芽誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)1～7天，培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24～26℃。所述芽誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中微量元素含量加倍，pH值為5.0～6.0，并添加激素；所述激素是2,4-D、Dicamba、KT、6-BA中的一種或多種，其添加量分別為：10mg/L以下。2、金剛砂創(chuàng)傷處理及農(nóng)桿菌浸染按照種子體積稱取等量的中等目度的金剛砂(即按體積比：種子：金剛砂＝1:1)，高溫滅菌處理，倒掉離心管中的芽誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基，加入金剛砂,然后加入少量含有0.6～1.0OD600nm農(nóng)桿菌的浸染培養(yǎng)基,在渦旋振蕩器下高速處理2～3分鐘，再加入含農(nóng)桿菌的浸染培養(yǎng)基，使含農(nóng)桿菌的浸染培養(yǎng)基的總體積為種子體積的8～12倍(即按體積比：種子：浸染農(nóng)桿菌液＝1:8～12)，低速振蕩浸染0.5～1小時，培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24～26℃。所述浸染培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素含量減半，微量元素含量加倍，PH值為5.0～6.0，添加激素、乙酰丁香酮(Acetosyringone)20～60mg/L、表面活性劑0.1～1％(如Synperonic,質(zhì)量體積比)；所述激素是2,4-D、Dicamba、KT、6-BA中的一種或多種，其添加量分別為：10mg/L以下。3、共培養(yǎng)將浸染后的種子接到帶濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3～9天，培養(yǎng)溫度在20～28℃之間(可根據(jù)使用的不同農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行調(diào)整)。所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素含量減半，微量元素含量加倍，pH值為5.0～6.0，添加激素、乙酰丁香酮(Acetosyringone)20～60mg/L；所述激素是2,4-D、Dicamba、KT、6-BA中的一種或多種，其添加量分別為：10mg/L以下。4、抑菌和篩選培養(yǎng)將共培養(yǎng)后的種子接到抑菌和篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，篩選分兩個階段：第一階段，先在抑菌和篩選培養(yǎng)基中添加篩選劑的半致死計量，篩選1周；第二階段，將經(jīng)過第一階段篩選的種子繼代到添加篩選劑全致死計量的抑菌和篩選培養(yǎng)基中，篩選3～4周。培養(yǎng)條件：先暗培養(yǎng)，最后1～2周光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24～26℃。所述抑菌和篩選培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中微量元素含量加倍，pH值為5.0～6.0，添加激素、抑制農(nóng)桿菌的抗生素100～500mg/L(如Timentin)；所述激素是2,4-D、Dicamba、KT、6-BA中的一種或多種，其添加量分別為：10mg/L以下。5、抗性愈傷成苗培養(yǎng)將經(jīng)過篩選階段誘導(dǎo)的胚性愈傷組織繼代到成苗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24～26℃，培養(yǎng)時間2～4周。所述成苗培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中有機(jī)元素和微量元素含量加倍，蔗,15～20g/L，pH值為5.0～6.0，添加激素、抑制農(nóng)桿菌的抗生素100～500mg/L(如Timentin)，不添加或添加篩選劑半致死計量。所述激素是2,4-D、KT、6-BA中的一種或多種，其添加量分別為：10mg/L以下。6、生根培養(yǎng)將在成苗培養(yǎng)基上再生的達(dá)到1cm以上的芽單獨取出，接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24～26℃，培養(yǎng)時間1～2周。所述生根培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素含量減半，蔗糖含量減半，pH值為5.0～6.0，添加篩選劑半致死計量，添加或不添加IBA，其添加量為：10mg/L以下。本發(fā)明步驟簡單，易操作，以成熟的狗尾草種子為外植體，種子經(jīng)發(fā)芽活化處理后，用金剛砂輔助造成傷口，進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，大大提高了狗尾草的轉(zhuǎn)化效率，縮短了轉(zhuǎn)化周期，簡化了轉(zhuǎn)化程序，擴(kuò)大了轉(zhuǎn)化品系的范圍，為狗尾草建立了一種靈活、周期短、高效的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。附圖說明圖1是用于轉(zhuǎn)化的pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)質(zhì)粒載體圖。圖2是狗尾草不同品系(A10,ME34)種子金剛砂(emery)輔助處理時共培養(yǎng)不同階段(3天，5天，7天，9天)GUS基因瞬時表達(dá)差異圖。A10、ME34品系左邊的都為不使用金剛砂輔助的轉(zhuǎn)化效果，右邊都為使用金剛砂輔助效果；使用金剛砂輔助種子轉(zhuǎn)化的效率明顯高于不使用的：當(dāng)共培養(yǎng)3天時，金剛砂處理的種子幼芽都已GUS染色，轉(zhuǎn)化基因的瞬時表達(dá)效果非常強，而沒有金剛砂處理的種子幼芽幾乎沒有被染色，瞬時表達(dá)效果很差，隨著共培養(yǎng)時間的延長，非處理的種子瞬時表達(dá)情況有增加，但都遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如金剛砂處理的表達(dá)效果。圖3是pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化苗GUS染色情況。從圖可以看出，經(jīng)金剛砂輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化狗尾草種子后篩選出的抗性苗幾乎都是純合的轉(zhuǎn)基因苗，整株都能被GUS染色。圖4是狗尾草成熟種子金剛砂輔助農(nóng)桿菌直接轉(zhuǎn)化的優(yōu)化基本程序。種子活化(activeseeds)5天，浸染和共培養(yǎng)(transformation)5天,低濃度篩選(selection1)1周,高濃度暗篩選(selection2)2周，高濃度光篩選(selection3)2周，成苗培養(yǎng)(regeneration)2周。具體實施方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例1、外植體的處理和活化選取經(jīng)休眠處理的狗尾草品系A(chǔ)10和ME34干燥成熟種子，去除種皮后將各約1克種子分別裝入兩個14ml離心管，用有效濃度1％的次氯酸鈉溶液滅菌消毒處理，無菌水清洗后，在離心管中加入約一半體積的芽誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)5天，培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃左右。芽誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基是以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(微量元素含量加倍)，pH為5.8，并添加2mg/L2,4-D+0.5mg/LKT。2、金剛砂創(chuàng)傷處理及農(nóng)桿菌浸染按照種子體積比(1:1)稱取金剛砂(120目和320目各一半重量)，高溫滅菌處理，倒掉離心管中的芽誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基，加入金剛砂。加入少量含有0.6OD600nm農(nóng)桿菌的浸染培養(yǎng)基(液體),在渦旋振蕩器下高速處理2分鐘，然后再加入含農(nóng)桿菌的浸染培養(yǎng)基，使浸染培養(yǎng)基的總體積為10mL，低速振蕩浸染40分鐘，培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃左右。浸染培養(yǎng)基是以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(大量元素含量減半，微量元素含量加倍)，pH值為5.2，添加2mg/L2,4-D，添加乙酰丁香酮(Acetosyringone)40mg/L，添加表面活性劑Synperonic0.1％(質(zhì)量體積比)。農(nóng)桿菌為AGL1菌株，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒為pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)見圖1(GUS標(biāo)記)，用帶50mg/L羧芐青霉素和50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基涂板，在20℃暗培養(yǎng)3～5天后取菌塊用浸染培養(yǎng)基重懸為0.6OD600nm，農(nóng)桿菌液輕搖活化2～3小時后用于轉(zhuǎn)化。3、共培養(yǎng)將浸染后的種子接到帶濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3～9天，培養(yǎng)溫度為20℃。共培養(yǎng)培養(yǎng)基是以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，大量元素含量減半，微量元素含量加倍，pH值為5.2，并添加2mg/L2,4-D+0.5mg/LKT，添加乙酰丁香酮(Acetosyringone)40mg/L。分別在不同共培養(yǎng)階段(3天、5天、7天、9天)取A10、ME34種子做GUS染色瞬時表達(dá)檢測，從圖2可見用金剛砂(emery)輔助處理轉(zhuǎn)化的種子GUS瞬時表達(dá)明顯比不輔助處理的強，因此金剛砂輔助處理能明顯提高活化種子的轉(zhuǎn)化效率。4、抑菌和篩選培養(yǎng)將共培養(yǎng)5天后的種子接到抑菌和篩選培養(yǎng)基上，抑菌和篩選培養(yǎng)基是以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，微量元素含量加倍，pH值為5.8，添加2mg/L2,4-D+0.5mg/LKT，添加抑制農(nóng)桿菌的抗生素150mg/L特美丁(Timentin)，添加篩選劑25mg/L潮霉素(Hygromycin)。1周后繼代到潮霉素提高到45mg/L的抑菌和篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4周。培養(yǎng)條件：先暗培養(yǎng)，后2周光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃左右。觀察抗性胚性愈傷組織誘導(dǎo)情況，統(tǒng)計抗性胚性愈傷組織數(shù)，計算誘導(dǎo)率，結(jié)果見表1，抗性胚性愈傷組織誘導(dǎo)率(抗性胚性愈傷組織數(shù)/出芽種子數(shù))A10達(dá)49％，ME34達(dá)34％。表1抗性胚性愈傷組織誘導(dǎo)情況狗尾草品系出芽種子數(shù)抗性胚性愈傷組織數(shù)誘導(dǎo)率A1050024549％ME3450017034％5、抗性愈傷成苗培養(yǎng)將經(jīng)過篩選階段誘導(dǎo)的抗性胚性愈傷組織，繼代到成苗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃左右。成苗培養(yǎng)基是以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有機(jī)和微量元素含量加倍，蔗糖20g/L，pH值為5.8，添加1.5mg/LKT，添加150mg/L特美丁(Timentin)，添加20mg/L潮霉素。培養(yǎng)時間2周。觀察抗性愈傷成苗培養(yǎng)情況，統(tǒng)計叢芽數(shù)，計算誘導(dǎo)率，結(jié)果見表2，基本每塊抗性愈傷都能誘導(dǎo)出叢芽。表2植株再生情況狗尾草品系抗性胚性愈傷組織數(shù)愈傷再生叢芽數(shù)誘導(dǎo)率A1015014798％ME3415013892％6、生根培養(yǎng)將在成苗培養(yǎng)基上再生的達(dá)到約1cm以上的芽單獨取出，接到生根培養(yǎng)基上生根，培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃左右。生根培養(yǎng)基是改良的MS培養(yǎng)基，大量元素含量減半，蔗糖含量減半，pH值為5.8，添加150mg/L特美丁(Timentin)，添加20mg/L潮霉素。培養(yǎng)時間1～2周。觀察生根培養(yǎng)情況，統(tǒng)計生根數(shù)，計算生根率，結(jié)果見表3。將經(jīng)過篩選再生的轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行GUS染色檢測，染色情況見圖3。表3生根培養(yǎng)情況狗尾草品系叢芽數(shù)叢芽生根數(shù)生根率A1012011394.1％ME3412010285％以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3